TY - THES A1 - Dahmani, Ismail T1 - Influenza A virus matrix protein M1 T1 - Influenza-A-Virus-Matrixprotein M1 BT - structural determinants of membrane binding and protein- induced deformation BT - strukturelle Determinanten der Membranbindung und protein-induzierte Deformation N2 - Influenza A virus (IAV) is a pathogen responsible for severe seasonal epidemics threatening human and animal populations every year. During the viral assembly process in the infected cells, the plasma membrane (PM) has to bend in localized regions into a vesicle towards the extracellular side. Studies in cellular models have proposed that different viral proteins might be responsible for inducing membrane curvature in this context (including M1), but a clear consensus has not been reached. M1 is the most abundant protein in IAV particles. It plays an important role in virus assembly and budding at the PM. M1 is recruited to the host cell membrane where it associates with lipids and other viral proteins. However, the details of M1 interactions with the cellular PM, as well as M1-mediated membrane bending at the budozone, have not been clarified. In this work, we used several experimental approaches to analyze M1-lipids and M1-M1 interactions. By performing SPR analysis, we quantified membrane association for full-length M1 and different genetically engineered M1 constructs (i.e., N- and C-terminally truncated constructs and a mutant of the polybasic region). This allowed us to obtain novel information on the protein regions mediating M1 binding to membranes. By using fluorescence microscopy, cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM), and three-dimensional (3D) tomography (cryo-ET), we showed that M1 is indeed able to cause membrane deformation on vesicles containing negatively-charged lipids, in the absence of other viral components. Further, sFCS analysis proved that simple protein binding is not sufficient to induce membrane restructuring. Rather, it appears that stable M1-M1 interactions and multimer formation are required to alter the bilayer three-dimensional structure through the formation of a protein scaffold. Finally, to mimic the budding mechanism in cells that arise by the lateral organization of the virus membrane components on lipid raft domains, we created vesicles with lipid domains. Our results showed that local binding of M1 to spatial confined acidic lipids within membrane domains of vesicles led to local M1 inward curvature. N2 - Das Influenza-A-Virus (IAV) ist ein Erreger, der für schwere saisonale Epidemien verantwortlich ist, die jedes Jahr Menschen und Tiere bedrohen. Während des viralen Assemblierungsprozesses in den infizierten Zellen muss sich die Plasmamembran (PM) an bestimmten Stellen zu einem Vesikel zur extrazellulären Seite biegen. Studien an zellulären Modellen haben ergeben, dass verschiedene virale Proteine (einschließlich M1) für die Induktion der Membrankrümmung in diesem Zusammenhang verantwortlich sein könnten, ein eindeutiger Konsens wurde jedoch nicht erreicht. M1 ist das am häufigsten vorkommende Protein in IAV-Partikeln. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Virusassemblierung und Knospung. M1 wird zur Wirtszellmembran rekrutiert, wo es sich mit Lipiden und anderen viralen Proteinen assoziiert. Die Einzelheiten der Interaktionen von M1 mit der zellulären PM sowie die M1-vermittelte Membranverbiegung am Ort der Virusfreisetzung sind jedoch noch nicht geklärt. In dieser Arbeit wurden mehrere experimentelle Ansätze zur Analyse von M1-Lipiden und M1-M1 Wechselwirkungen untersucht. Mittels SPR-Analyse wurde die Membranassoziation für M1 in voller Länge und verschiedene gentechnisch veränderte M1-Konstrukte (d. h. N- und C-terminal verkürzte Konstrukte und eine Mutante der polybasischen Region) quantifiziert; so konnten neue Erkenntnisse über die Proteinregionen, die die Bindung von M1 an Membranen steuern, gewonnen werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, kryogener Transmissionselektronenmikroskopie (cryo-TEM) und dreidimensionaler (3D) Tomographie (cryo-ET) konnten wir zeigen, dass M1 tatsächlich in der Lage ist, die Membran von Vesikeln, die negativ geladene Lipide enthalten, zu deformieren (und zwar ohne andere virale Komponenten). Außerdem bewies die sFCS-Analyse, dass eine einfache Proteinbindung nicht ausreicht, um eine Umstrukturierung der Membran zu bewirken. Vielmehr scheint es, dass stabile M1-M1-Wechselwirkungen und die Bildung von Multimeren erforderlich sind, um die dreidimensionale Struktur der Doppelschicht Struktur durch die Bildung eines Proteingerüsts zu verändern. Um schließlich den Knospungsmechanismus zu imitieren, der durch die laterale Organisation der Virusmembrankomponenten auf Lipid-Raft-Domänen entsteht, haben wir Vesikel mit Lipiddomänen erzeugt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die lokale Bindung von M1 an räumlich begrenzte saure Lipide innerhalb der Membrandomänen der Vesikel zu einer lokalen Krümmung von M1 nach innen führt. KW - Influenza A virus KW - Influenza KW - Pathogen KW - Lipids KW - Epidemic KW - Epidemics KW - Plasma membrane KW - Viral assembly KW - Virus KW - Vesicle KW - Giant Vesicles KW - Budozone KW - M1-M1 interaction KW - Virion KW - Membrane deformation KW - IAV particles KW - membrane binding KW - M1-lipids KW - protein binding KW - GUV KW - Giant unilamellar vesicles KW - Budozone KW - Epidemie KW - Epidemien KW - GUV KW - Riesenvesikel KW - riesige unilamellare Vesikel KW - IAV-Partikel KW - Influenza KW - Influenza-A-Virus KW - Lipide KW - M1-M1-Interaktion KW - M1-Lipide KW - Membrandeformation KW - Pathogen KW - Plasmamembran KW - Vesikel KW - Virusassemblierung, Virion KW - Virus KW - Membranbindung KW - Proteinbindung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-527409 ER - TY - THES A1 - Memczak, Henry T1 - Entwicklung influenzabindender Peptide für die Biosensorik T1 - Engineering of influenza-binding peptides for biosensing N2 - Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar. N2 - The influenza virus infects mammals and birds. The first step of the infection cycle comprises the attachment of the viral surface protein hemagglutinin (HA) on glycan structures on epithelial cells within the respiratory tract of the host organism. Starting from the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain of a monoclonal hemagglutinin-binding antibody three linear peptides were derived. The binding properties of these peptides was characterized experimentally using surface plasmon resonance spectroscopy. In accordance with accompanying molecular dynamics simulation it was shown, that two of the three peptides (PeB and PeC) were able to bind the influenza virus of the strain X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) comparably to the antibody itself. The interaction of peptide PeB, which was supposed to bind to the conserved receptor binding site at the HA, was then characterized more in detail. The detection of influenza viruses was achieved within the diagnostically relevant concentration range using defined immobilization conditions. The specificity of the peptide-virus-binding was proven by appropriate control experiments. Additionally, peptide PeB was able to inhibit the binding of X31 viruses to mimics of its natural receptor. Furthermore the structure-activity-relationship within all the amino acids of peptide PeB was characterized using a full substitutional analysis in a microarray format. This led to improved peptidic variants, which were able to bind different influenza serotypes and inhibit the influenza infection in vitro. The found peptides and their variants can now be used as receptor molecules in biosensors and also represent potential drug candidates. KW - Influenza KW - Peptid KW - Biosensor KW - Virus KW - Interaktionsstudie KW - influenza KW - peptide KW - biosensor KW - virus KW - interaction analysis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72470 ER - TY - THES A1 - Kruse, Marlen T1 - Characterization of biomolecules and their interactions using electrically controllable DNA nanolevers N2 - In this work, binding interactions between biomolecules were analyzed by a technique that is based on electrically controllable DNA nanolevers. The technique was applied to virus-receptor interactions for the first time. As receptors, primarily peptides on DNA nanostructures and antibodies were utilized. The DNA nanostructures were integrated into the measurement technique and enabled the presentation of the peptides in a controllable geometrical order. The number of peptides could be varied to be compatible to the binding sites of the viral surface proteins. Influenza A virus served as a model system, on which the general measurability was demonstrated. Variations of the receptor peptide, the surface ligand density, the measurement temperature and the virus subtypes showed the sensitivity and applicability of the technology. Additionally, the immobilization of virus particles enabled the measurement of differences in oligovalent binding of DNA-peptide nanostructures to the viral proteins in their native environment. When the coronavirus pandemic broke out in 2020, work on binding interactions of a peptide from the hACE2 receptor and the spike protein of the SARS-CoV-2 virus revealed that oligovalent binding can be quantified in the switchSENSE technology. It could also be shown that small changes in the amino acid sequence of the spike protein resulted in complete loss of binding. Interactions of the peptide and inactivated virus material as well as pseudo virus particles could be measured. Additionally, the switchSENSE technology was utilized to rank six antibodies for their binding affinity towards the nucleocapsid protein of SARS-CoV-2 for the development of a rapid antigen test device. The technique was furthermore employed to show binding of a non-enveloped virus (adenovirus) and a virus-like particle (norovirus-like particle) to antibodies. Apart from binding interactions, the use of DNA origami levers with a length of around 50 nm enabled the switching of virus material. This proved that the technology is also able to size objects with a hydrodynamic diameter larger than 14 nm. A theoretical work on diffusion and reaction-limited binding interactions revealed that the technique and the chosen parameters enable the determination of binding rate constants in the reaction-limited regime. Overall, the applicability of the switchSENSE technique to virus-receptor binding interactions could be demonstrated on multiple examples. While there are challenges that remain, the setup enables the determination of affinities between viruses and receptors in their native environment. Especially the possibilities regarding the quantification of oligo- and multivalent binding interactions could be presented. N2 - In dieser Arbeit wurden Bindungsinteraktionen zwischen biologischen Molekülen mit Hilfe von elektrisch kontrollierbaren DNA-Nanohebeln untersucht. Die Technologie wurde zum ersten Mal auf Virus-Rezeptor Interaktionen angewendet. Als Rezeptoren wurden überwiegend Peptide und Antikörper untersucht. Die Peptide wurden auf vierarmigen DNA-Nanohebeln angeordnet. Ihre geometrische Anordnung entsprach der Anordnung der Rezeptorbindungsstellen der Proteine auf der Virusoberfläche. An Influenza A Viren wurde die Machbarkeit der Bindungsmessung zuerst demonstriert. Dabei konnte die Anwendbarkeit und Sensitivität der Technologie durch Variation der Peptide, der Ligandendichte auf der Sensoroberfläche, der Messtemperatur und der Virussubtypen gezeigt werden. Weiterhin wurde Virusmaterial auf der Sensoroberfläche immobilisiert und anschließend wurden quantitative Bindungsmessungen mit den oligovalenten DNA-Peptid-Strukturen durchgeführt. Dieser Versuchsaufbau ermöglichte die Messung der Bindungsstärke in Abhängigkeit der Anzahl der pro DNA-Struktur gekoppelten Peptide. Im Zuge des Ausbruchs der Coronavirus-Pandemie im Jahr 2020 wurden Bindungsinteraktionsmessungen zwischen einem Peptid aus dem hACE2-Rezeptor und SARS-CoV-2 Spike Proteinen durchgeführt. Auch hier konnten oligovalente Bindungseffekte quantifiziert werden. Außerdem wurde festgestellt, dass Veränderungen an der Aminosäuresequenz des SARS-CoV-2 Proteins starke Auswirkungen auf das Bindungsverhalten hatten. Auch Interaktionen zwischen dem Peptid und sowohl inaktiviertem Virusmaterial als auch Pseudoviruspartikeln wurden gemessen. Für die Entwicklung eines Antigenschnelltests wurden die Affinitäten von sechs Antikörpern an das Nucleocapsidprotein des SARS-CoV-2 bestimmt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass mit der Technologie auch die Bindung von unbehüllten Viren (am Beispiel von Adenoviren) und Virus-ähnlichen Partikeln (am Beispiel von Norovirus-ähnlichen Partikeln) an Antikörper vermessen werden kann. Neben Bindungsinteraktionen, wurden auch Größenbestimmungen mit Hilfe von DNA Origamis durchgeführt. Die Hebellänge von ca. 50 nm ermöglichte die elektrische Bewegung ("switching") von Virusmaterial. Es konnte so gezeigt werden, dass die Technologie es ermöglicht, Objekte mit einem hydrodynamischen Durchmesser von mehr als 14 nm zu bewegen. In einer theoretischen Betrachtung der Experimente konnte gezeigt werden, dass der Sensoraufbau und die verwendeten Parameter die Messung von Bindungsratenkonstanten in einem Reaktions-limitierten Bereich ermöglichen. Insgesamt konnte die Arbeit an vielen Beispielen zeigen, dass die switch-SENSE Technologie für die Messung von Virus-Rezeptor Interaktionen geeignet ist. Während es weiterhin Herausforderungen gibt, so ermöglicht der Aufbau doch die Bestimmung von Affinitäten zwischen Viren und Rezeptoren. Insbesondere die Möglichkeiten zur Quantifizierung von oligo- und multivalenten Bindungsinteraktionen konnten aufgezeigt werden. T2 - Charakterisierung von Biomolekülen und deren Interaktionen mittels elektrisch kontrollierbarer DNA Nanohebel KW - biomolecule KW - binding interactions KW - switchSENSE KW - virus KW - receptor KW - Biomoleküle KW - Bindungsinteraktion KW - switchSENSE Technologie KW - Virus KW - Rezeptor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-577384 ER - TY - THES A1 - Stanke, Sandra T1 - AC electrokinetic immobilization of influenza viruses and antibodies on nanoelectrode arrays for on-chip immunoassays T1 - AC elektrokinetische Immobilisierung von Influenzaviren und Antikörpern auf Nanoelektrodenarrays für on-Chip Immunoassays N2 - In the present thesis, AC electrokinetic forces, like dielectrophoresis and AC electroosmosis, were demonstrated as a simple and fast method to functionalize the surface of nanoelectrodes with submicrometer sized biological objects. These nanoelectrodes have a cylindrical shape with a diameter of 500 nm arranged in an array of 6256 electrodes. Due to its medical relevance influenza virus as well as anti-influenza antibodies were chosen as a model organism. Common methods to bring antibodies or proteins to biosensor surfaces are complex and time-consuming. In the present work, it was demonstrated that by applying AC electric fields influenza viruses and antibodies can be immobilized onto the nanoelectrodes within seconds without any prior chemical modification of neither the surface nor the immobilized biological object. The distribution of these immobilized objects is not uniform over the entire array, it exhibits a decreasing gradient from the outer row to the inner ones. Different causes for this gradient have been discussed, such as the vortex-shaped fluid motion above the nanoelectrodes generated by, among others, electrothermal fluid flow. It was demonstrated that parts of the accumulated material are permanently immobilized to the electrodes. This is a unique characteristic of the presented system since in the literature the AC electrokinetic immobilization is almost entirely presented as a method just for temporary immobilization. The spatial distribution of the immobilized viral material or the anti-influenza antibodies at the electrodes was observed by either the combination of fluorescence microscopy and deconvolution or by super-resolution microscopy (STED). On-chip immunoassays were performed to examine the suitability of the functionalized electrodes as a potential affinity-based biosensor. Two approaches were pursued: A) the influenza virus as the bio-receptor or B) the influenza virus as the analyte. Different sources of error were eliminated by ELISA and passivation experiments. Hence, the activity of the immobilized object was inspected by incubation with the analyte. This resulted in the successful detection of anti-influenza antibodies by the immobilized viral material. On the other hand, a detection of influenza virus particles by the immobilized anti-influenza antibodies was not possible. The latter might be due to lost activity or wrong orientation of the antibodies. Thus, further examinations on the activity of by AC electric fields immobilized antibodies should follow. When combined with microfluidics and an electrical read-out system, the functionalized chips possess the potential to serve as a rapid, portable, and cost-effective point-of-care (POC) device. This device can be utilized as a basis for diverse applications in diagnosing and treating influenza, as well as various other pathogens. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden AC elektrokinetische Kräfte, wie die Dielektrophorese und die AC Elektroosmose, als einfache und schnelle Methode zur Funktionalisierung der Oberfläche von Nanoelektroden mit biologischen Objekten in Submikrometergröße demonstriert. Diese Nanoelektroden haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 500 nm und sind in einem Array aus 6256 Elektroden angeordnet. Aufgrund ihrer medizinischen Relevanz wurden Influenzaviren sowie anti-Influenza Antikörper als Modellorganismus ausgewählt. Gängige Methoden, um Antikörper oder Proteine auf Biosensoroberflächen zu bringen, sind komplex und zeitaufwändig. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch die Anwendung elektrischer Wechselfelder Influenzaviren und Antikörper innerhalb von Sekunden auf den Nanoelektroden immobilisiert werden können, ohne dass zuvor eine chemische Modifikation der Oberfläche noch des immobilisierten biologischen Objekts erforderlich ist. Die Verteilung dieser immobilisierten Objekte ist über das gesamte Array ungleichmäßig. Es kommt zur Ausbildung eines Gradienten, welcher von der äußeren zur den inneren Reihen hin abnimmt. Verschiedene Ursachen für diesen Gradienten wurden diskutiert, beispielsweise der Vortex-förmige Flüssigkeitsstrom über den Nanoelektroden, der unter anderem durch elektrothermische Flüssigkeitsbewegung erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass Teile des akkumulierten Materials dauerhaft an den Elektroden immobilisiert sind. Dies ist ein Alleinstellungsmerkmal des vorgestellten Systems, da in der Literatur die AC elektrokinetische Immobilisierung fast ausschließlich als Methode nur zur temporären Immobilisierung dargestellt wird. Die räumliche Verteilung des immobilisierten Virusmaterials bzw. der anti-Influenza Antikörper an den Elektroden wurde entweder durch die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Dekonvolution oder durch super-resolution Mikroskopie (STED) betrachtet. Es wurden On-Chip-Immunoassays durchgeführt, um die Eignung der funktionalisierten Elektroden für einen potenziellen affinitätsbasierten Biosensor zu untersuchen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: A) Influenzaviren als Biorezeptor oder B) Influenzavirus als Analyt. Verschiedene Fehlerquellen wurden mittels ELISA und Passivierungsexperimente eliminiert. Infolgedessen wurde die Aktivität der immobilisierten Objekte durch Inkubation mit dem Analyten überprüft. Dies führte zum erfolgreichen Nachweis von anti-Influenza Antikörpern mittels immobilisiertem Virusmaterial. Andererseits war ein Nachweis von Influenzaviruspartikeln durch die immobilisierten anti-Influenza Antikörper nicht möglich. Letzteres könnte auf einen Aktivitätsverlust oder eine falsche Ausrichtung der Antikörper zurückzuführen sein. Daher sollten weitere Untersuchungen zur Aktivität von durch elektrische Wechselfelder immobilisierte Antikörper folgen. In Kombination mit Mikrofluidik und einem elektrischen Auslesesystem besitzen die funktionalisierten Chips das Potenzial, als schnelle, tragbare und kostengünstige Point-of-Care-Einheit (POC) zu dienen. Dieses Einheit kann als Grundlage für vielfältige Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Influenza und verschiedenen anderen Krankheitserregern genutzt werden. KW - AC electrokinetics KW - AC Elektrokinetik KW - AC electroosmosis KW - AC Elektroosmosis KW - dielectrophoresis KW - Dielektrophorese KW - virus KW - Virus KW - influenza KW - Influenza KW - antibody KW - Antikörper KW - nanoelectrodes KW - Nanoelektroden KW - lab-on-chip KW - lab-on-chip KW - LOC KW - LOC KW - point-of-care KW - point-of-care KW - POC KW - POC KW - immunoassay KW - Immunoassay Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617165 ER -