TY  - THES
A1  - Vosloh, Daniel
T1  - Subcellular compartmentation of primary carbon metabolism in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana
T1  - Subzelluläre Kompartimentierung des primären Kohlenstoffmetabolismus in Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana
N2  - Metabolismus in Pflanzenzellen ist stark kompartimentiert. Viele Stoffwechselwege haben Reaktionen in mehr als einem Kompartiment. Zum Beispiel wird während der Photosynthese in pflanzlichen Mesophyllzellen Kohlenstoff in Form von Stärke in den Chloroplasten synthetisiert, während es im Zytosol in Form von Sacharose gebildet und in der Vakuole gespeichert wird. Diese Reaktionen sind strikt reguliert um ein Gleichgewicht der Kohlenstoffpools der verschiedenen Kompartimente aufrecht zu erhalten und die Energieversorgung aller Teile der Zelle für anabolische Reaktionen sicher zu stellen. Ich wende eine Methode an, bei der die Zellen unter nicht-wässrigen Bedingungen fraktioniert werden und daher der metabolische Status der während der Ernte herrschte über den ganzen Zeitraum der Auftrennung beibehalten wird. Durch die Kombination von nichtwässriger Fraktionierung und verschiedener Massenspektrometrietechniken (Flüssigchromotagraphie- und Gaschromotagraphie basierende Massenspekrometrie) ist es möglich die intrazelluläre Verteilung der meisten Intermediate des photosynthetischen Kohlenstoffstoffwechsels und der Produkte der nachgelagerten metabolischen Reaktionen zu bestimmen. Das Wissen über die in vivo Konzentrationen dieser Metabolite wurde genutzt um die Änderung der freien Gibbs Energie in vivo zu bestimmen. Mit Hilfe dessen kann bestimmt werden, welche Reaktion sich in einem Gleichgewichtszustand befinden und welche davon entfernt sind. Die Konzentration der Enzyme und der Km Werte wurden mit den Konzentrationen der Metabolite in vivo verglichen, um festzustellen, welche Enzyme substratlimitiert sind und somit sensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration sind. Verschiedene Intermediate des Calvin-Benson Zyklus sind gleichzeitig Substrate für andere Stoffwechselwege, als da wären Dihyroxyaceton-phosphat (DHAP, Saccharosesynthese), Fructose 6-phosphat (Fru6P, Stärkesynthese), Erythrose 4-phosphat (E4P, Shikimat Stoffwechselweg) und Ribose 5-phosphat (R5P, Nukleotidbiosynthese). Die Enzyme, die diese Intermediate verstoffwechseln, liegen an den Abzweigungspunkten zu diesen Stoffwechselwegen. Diese sind Trisose phosphat isomerase (DHAP), Transketolase (E4P), Sedoheptulose-1,7 biphosphat aldolase (E4P) und Ribose-5-phosphat isomerase (R5P), welche nicht mit ihren Substraten gesättigt sind, da die jeweilige Substratkonzentration geringer als der zugehörige Km Wert ist. Für metabolische Kontrolle bedeutet dies, dass diese Schritte am sensitivsten gegenüber Änderungen der Substratkonzentrationen sind. Im Gegensatz dazu sind die regulierten irreversiblen Schritte von Fructose-1,6.biphosphatase und Sedoheptulose-1,7-biphosphatase relativ insensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration. Für den Stoffwechselweg der Saccharosesynthese konnte gezeigt werden, dass die zytosolische Aldolase eine geringer Bindeseitenkonzentration als Substratkonzentration (DHAP) aufweist, und dass die Konzentration von Saccharose-6-phosphat geringer als der Km Wert des synthetisierenden Enzyms Saccharose-phosphatase ist. Sowohl die Saccharose-phosphat-synthase, also auch die Saccharose-phosphatase sind in vivo weit von einem Gleichgewichtszustand entfernt. In Wildtyp Arabidopsis thaliana Columbia-0 Blättern wurde der gesamte Pool von ADPGlc im Chloroplasten gefunden. Das Enzyme ADPGlc pyrophosphorylase ist im Chloroplasten lokalisiert und synthetisiert ADPGlc aus ATP und Glc1P. Dieses Verteilungsmuster spricht eindeutig gegen die Hypothese von Pozueta-Romero und Kollegen, dass ADPGlc im Zytosol durch ADP vermittelte Spaltung von Saccharose durch die Saccharose Synthase erzeugt wird. Basierend auf dieser Beobachtung und anderen veröffentlichten Ergebnissen wurde geschlußfolgert, dass der generell akzeptierte Stoffwechselweg der Stärkesynthese durch ADPGlc Produktion via ADPGlc pyrophosphorylase in den Chloroplasten korrekt ist, und die Hypothese des alternativen Stoffwechselweges unhaltbar ist. Innerhalb des Stoffwechselweges der Saccharosesynthsese wurde festgestellt, dass die Konzentration von ADPGlc geringer als der Km Wert des Stärkesynthase ist, was darauf hindeutet, dass das Enzym substratlimitiert ist. Eine generelle Beobachtung ist, dass viele Enzmye des Calvin-Benson Zyklus ähnliche Bindeseitenkonzentrationen wie Metabolitkonzentrationen aufweisen, wohingegen in den Synthesewegen von Saccharose und Stärke die Bindeseitenkonzentrationen der Enzyme viel geringer als die Metabolitkonzentrationen sind.
N2  - Metabolism in plant cells is highly compartmented, with many pathways involving reactions in more than one compartment. For example, during photosynthesis in leaf mesophyll cells, primary carbon fixation and starch synthesis take place in the chloroplast, whereas sucrose is synthesized in the cytosol and stored in the vacuole. These reactions are tightly regulated to keep a fine balance between the carbon pools of the different compartments and to fulfil the energy needs of the organelles. I applied a technique which fractionates the cells under non-aqueous conditions, whereby the metabolic state is frozen at the time of harvest and held in stasis throughout the fractionation procedure. With the combination of non-aqueous fractionation and mass spectrometry based metabolite measurements (LC-MS/MS, GC-MS) it was possible to investigate the intracellular distributions of the intermediates of photosynthetic carbon metabolism and its products in subsequent metabolic reactions. With the knowledge about the in vivo concentrations of these metabolites under steady state photosynthesis conditions it was possible to calculate the mass action ratio and change in Gibbs free energy in vivo for each reaction in the pathway, to determine which reactions are near equilibrium and which are far removed from equilibrium. The Km value and concentration of each enzyme were compared with the concentrations of its substrates in vivo to assess which reactions are substrate limited and so sensitive to changes in substrate concentration. Several intermediates of the Calvin-Benson cycle are substrates for other pathways, including dihydroxyacetone-phosphate (DHAP,sucrose synthesis), fructose 6-phosphate (Fru6P, starch synthesis), erythrose 4-phosphate (E4P,shikimate pathway) and ribose 5-phosphate (R5P, nucleotide synthesis). Several of the enzymes that metabolise these intermediates, and so lie at branch points in the pathway, are triose-phosphate isomerase (DHAP), transketolase (E4P, Fru6P), sedoheptulose-1,7-bisphosphate aldolase (E4P) and ribose-5-phosphate isomerase (R5P) are not saturated with their respective substrate as the metabolite concentration is lower than the respective Km value. In terms of metabolic control these are the steps that are most sensitive to changes in substrate availability, while the regulated irreversible reactions of fructose-1,6-bisphosphatase and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase are relatively insensitive to changes in the concentrations of their substrates. In the pathway of sucrose synthesis it was shown that the concentration of the catalytic binding site of the cytosolic aldolase is lower than the substrate concentration of DHAP, and that the concentration of Suc6P is lower than the Km of sucrose-phosphatase for this substrate. Both the sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphatase reactions are far removed from equilibrium in vivo. In wild type A. thaliana Columbia-0 leaves, all of the ADPGlc was found to be localised in the chloroplasts. ADPglucose pyrophosphorylase is localised to the chloroplast and synthesises ADPGlc from ATP and Glc1P. This distribution argues strongly against the hypothesis proposed by Pozueta-Romero and colleagues that ADPGlc for starch synthesis is produced in the cytosol via ADP-mediated cleavage of sucrose by sucrose synthase. Based on this observation and other published data it was concluded that the generally accepted pathway of starch synthesis from ADPGlc produced by ADPglucose pyrophosphorylase in the chloroplasts is correct, and that the alternative pathway is untenable. Within the pathway of starch synthesis the concentration of ADPGlc was found to be well below the Km value of starch synthase for ADPGlc, indicating that the enzyme is substrate limited. A general finding in the comparison of the Calvin-Benson cycle with the synthesis pathways of sucrose and starch is that many enzymes in the Calvin Benson cycle have active binding site concentrations that are close to the metabolite concentrations, while for nearly all enzymes in the synthesis pathways the active binding site concentrations are much lower than the metabolite concentrations.
KW  - Pflanze
KW  - Kohlenstoffmetabolismus
KW  - Mesophyll
KW  - Zelle
KW  - plant
KW  - carbon metabolism
KW  - mesophyll
KW  - cell
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55534
ER  - 
TY  - THES
A1  - Guedes Corrêa, Luiz Gustavo
T1  - Evolutionary and functional analysis of transcription factors controlling leaf development
T1  - Evolutionäre und funktionelle Analyse von Transkriptionsfaktoren, welche die Blattentwicklung steuern
N2  - Leaves are the main photosynthetic organs of vascular plants, and leaf development is dependent on a proper control of gene expression. Transcription factors (TFs) are global regulators of gene expression that play essential roles in almost all biological processes among eukaryotes. This PhD project focused on the characterization of the sink-to-source transition of Arabidopsis leaves and on the analysis of TFs that play a role in early leaf development. The sink-to-source transition occurs when the young emerging leaves (net carbon importers) acquire a positive photosynthetic balance and start exporting photoassimilates. We have established molecular and physiological markers (i.e., CAB1 and CAB2 expression levels, AtSUC2 and AtCHoR expression patterns, chlorophyll and starch levels, and photosynthetic electron transport rates) to identify the starting point of the transition, especially because the sink-to-source is not accompanied by a visual phenotype in contrast to other developmental transitions, such as the mature-to-senescent transition of leaves. The sink-to-source transition can be divided into two different processes: one light dependent, related to photosynthesis and light responses; and one light independent or impaired, related to the changes in the vascular tissue that occur when leaves change from an import to an export mode. Furthermore, starch, but not sucrose, has been identified as one of the potential signalling molecules for this transition. The expression level of 1880 TFs during early leaf development was assessed by qRTPCR, and 153 TFs were found to exhibit differential expression levels of at least 5-fold. GRF, MYB and SRS are TF families, which are overrepresented among the differentially expressed TFs. Additionally, processes like cell identity acquisition, formation of the epidermis and leaf development are overrepresented among the differentially expressed TFs, which helps to validate the results obtained. Two of these TFs were further characterized. bZIP21 is a gene up-regulated during the sink-to-source and mature-to-senescent transitions. Its expression pattern in leaves overlaps with the one observed for AtCHoR, therefore it constitutes a good marker for the sink-to-source transition. Homozygous null mutants of bZIP21 could not be obtained, indicating that the total absence of bZIP21 function may be lethal to the plant. Phylogenetic analyses indicate that bZIP21 is an orthologue of Liguleless2 from maize. In these analyses, we identified that the whole set of bZIPs in plants originated from four founder genes, and that all bZIPs from angiosperms can be classified into 13 groups of homologues and 34 Possible Groups of Orthologues (PoGOs). bHLH64 is a gene highly expressed in early sink leaves, its expression is downregulated during the mature-to-senescent transition. Null mutants of bHLH64 are characterized by delayed bolting when compared to the wild-type; this indicates a possible delay in the sink-to-source transition or the retention of a juvenile identity. A third TF, Dof4, was also characterized. Dof4 is neither differentially expressed during the sink-to-source nor during the senescent-to-mature transition, but a null mutant of Dof4 develops bigger leaves than the wild-type and forms a greater number of siliques. The Dof4 null mutant has proven to be a good background for biomass accumulation analysis. Though not overrepresented during the sink-to-source transition, NAC transcription factors seem to contribute significantly to the mature-to-senescent transition. Twenty two NACs from Arabidopsis and 44 from rice are differentially expressed during late stages of leaf development. Phylogenetic analyses revealed that most of these NACs cluster into three big groups of homologues, indicating functional conservation between eudicots and monocots. To prove functional conservation of orthologues, the expression of ten NAC genes of barley was analysed. Eight of the ten NAC genes were found to be differentially expressed during senescence. The use of evolutionary approaches combined with functional studies is thus expected to support the transfer of current knowledge of gene control gained in model species to crops.
N2  - Das Blatt ist das wichtigste photosynthetische Organ von Gefäßpflanzen und die Blattentwicklung ist von einer exakten Genexpression abhängig. Transkriptionsfaktoren (TFs) sind globale Regulatoren der Genexpression. Diese sind, in fast allen biologischen Vorgängen der Eukaryoten, von grundlegender Bedeutung. Das Promotionsarbeit legte den Schwerpunkt auf den sogenannten Sink-source-Übergang in Blättern der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, zu deutsch Ackerschmalwand. Ein besonderer Fokus lag dabei auf der Analyse von TFs, welche eine wichtige Rolle in der frühen Blattentwicklung spielen. Sehr junge Blätter befinden sich im sogenannten Sink-Status, sie müssen Photoassimilate aus älteren, sogenannten Source-Blättern importieren, da sie selbst noch nicht in der Lage sind, hinreichend viel Kohlendioxid über die Photosynthese zu binden. Der Übergang vom Sink- in den Source-Zustand eines Blattes ist ein hoch komplizierter biologischer Prozess, der bisher nur in Ansätzen verstanden ist. Im Rahmen der Doktorarbeit wurden molekulare und physiologische Marker identifiziert, die es erlauben, den für das bloße Auge nicht ohne weiteres sichtbaren Sink-Source-Übergang zu erkennen. Dazu wurde beispielsweise die Aktivität bestimmter Gene, unter anderem der Gene AtSUC2 und AtCHoR, mittels molekularer Techniken verfolgt. Um den Über zwischen den beiden Entwicklungszuständen eingehend zu charakterisieren wurde die Aktivität von etwa 1900 Regulatorgenen mittels eines multiparallelen Verfahrens - der sogenannten quantitativen RT-PCR - untersucht. Bei den Regulatoren handelt es sich um Transkriptionsfaktoren, die die Aktivität anderer Gene der Pflanzen steuern. Von allen untersuchten Genen zeigten 153 ein vom Blattstadium abhängiges Aktivitätsmuster. Dabei waren Mitglieder der GRF, MYB und SRS Familien überrepräsentiert. Für die gefundenen Transkriptionsfaktoren zeigte sich besonders häufig eine Assoziation zu Prozessen wie Spezialisierung von Zellen, Entwicklung der Epidermis sowie der Blattentwicklung. Zwei ausgewählte Regulatorproteine - bZIP21 und bHLH64 - wurden detaillierter charakterisiert. Das bZIP21-Gen zeigte eine starke Aktivität whrend des Sink-Source-Übergangs. Sein Expressionsmuster in Blättern deckt sich mit dem für AtCHoR beobachteten Expressionsmuster, so dass bZIP21 als ein neuer Marker für die Sink-Source- Transition dienen kann. Es konnten keine homozygoten Null-Mutanten des Gens erhalten werden, was die Vermutung nahelegt, dass gänzliche Abwesenheit von bZIP21 letal fr die Pflanze sein kann. Phylogenetische Analysen ergaben, dass bZIP21 ortholog zum Gen Liguleless2 aus Mais ist. In diesen Analysen konnte gezeigt werden, dass alle pflanzlichen bZIP Transkriptionsfaktoren von vier Gründergenen abstammen und alle bZIPs der Angiospermen in 13 homologe Klassen und 34 mögliche orthologe Klassen (Possible Groups of Orthologues, PoGOs) eingeordnet werden können. Das bHLH64 Gen ist im unreifen Blatt stark aktiv und während des Alterungsprozesses herunterreguliert. Null-Mutationen von bHLH64 zeigen eine verzögerte Blütenbildung im Vergleich zum Wildtyp; dies weist auf eine mögliche Verzögerung in des Sink-SourceÜbergangs oder Aufrechterhaltung der jugendlichen Identität hin. Ein dritter Transkriptionsfaktor, Dof4, wurde ebenfalls charakterisiert. Dof4 wird weder während des Sink-Source-Übergangs noch während des Alterungsprozesses unterschiedlich exprimiert. Eine Null-Mutante von Dof4 besaß größere Blätter und eine höhere Anzahl an Schoten in Vergleich zum Wildtyp. Diese Mutanten erwiesen sich als gut geeignet fr die Analyse der Akkumulation pflanzlicher Biomasse. Obwohl während der Sink-Source Transition nicht überrepräsentiert, scheinen NAC Transkriptionsfaktoren eine große Rolle während des Alterungsprozesses zu spielen. Zweiundzwanzig NAC-Gene von Arabidopsis und 44 von Reis sind in der späten Phase der Blattentwicklung verändert exprimiert. Phylogenetische Analysen erlaubten die Einordnung der meisten dieser NACs in vier homologe Gruppen, was auf einen funktionellen Erhalt zwischen einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen hinweist. Um den funktionellen Erhalt von Orthologen zu untersuchen, wurde die Expression von zehn NAC-Genen aus Gerste analysiert. Acht dieser Gene zeigten eine von der Blattalterung abhängige Expression. Die Kombination von evolutionären Analysen und funktionellen Studien könnte den Wissenstransfer von Modellpflanzen auf Getreidepflanzen in Zukunft vereinfachen.
KW  - Evolution
KW  - Transkriptionsfaktoren
KW  - Pflanzen
KW  - Entwicklung
KW  - Blatt
KW  - evolution
KW  - transcription factors
KW  - plant
KW  - development
KW  - leaf
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-40038
ER  -