TY  - THES
A1  - Hildebrandt, Niko
T1  - Lanthanides and quantum dots : time-resolved laser spectroscopy of biochemical Förster Resonance Energy Transfer (FRET) systems
T1  - Lanthanide und Quantenpunkte : zeitaufgelöste Laserspektroskopie an biochemischen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Systemen
N2  - Förster Resonance Energy Transfer (FRET) plays an important role for biochemical applications such as DNA sequencing, intracellular protein-protein interactions, molecular binding studies, in vitro diagnostics and many others. For qualitative and quantitative analysis, FRET systems are usually assembled through molecular recognition of biomolecules conjugated with donor and acceptor luminophores. Lanthanide (Ln) complexes, as well as semiconductor quantum dot nanocrystals (QD), possess unique photophysical properties that make them especially suitable for applied FRET. In this work the possibility of using QD as very efficient FRET acceptors in combination with Ln complexes as donors in biochemical systems is demonstrated. The necessary theoretical and practical background of FRET, Ln complexes, QD and the applied biochemical models is outlined. In addition, scientific as well as commercial applications are presented. FRET can be used to measure structural changes or dynamics at distances ranging from approximately 1 to 10 nm. The very strong and well characterized binding process between streptavidin (Strep) and biotin (Biot) is used as a biomolecular model system. A FRET system is established by Strep conjugation with the Ln complexes and QD biotinylation. Three Ln complexes (one with Tb3+ and two with Eu3+ as central ion) are used as FRET donors. Besides the QD two further acceptors, the luminescent crosslinked protein allophycocyanin (APC) and a commercial fluorescence dye (DY633), are investigated for direct comparison. FRET is demonstrated for all donor-acceptor pairs by acceptor emission sensitization and a more than 1000-fold increase of the luminescence decay time in the case of QD reaching the hundred microsecond regime. Detailed photophysical characterization of donors and acceptors permits analysis of the bioconjugates and calculation of the FRET parameters. Extremely large Förster radii of more than 100 Å are achieved for QD as acceptors, considerably larger than for APC and DY633 (ca. 80 and 60 Å). Special attention is paid to interactions with different additives in aqueous solutions, namely borate buffer, bovine serum albumin (BSA), sodium azide and potassium fluoride (KF). A more than 10-fold limit of detection (LOD) decrease compared to the extensively characterized and frequently used donor-acceptor pair of Europium tris(bipyridine) (Eu-TBP) and APC is demonstrated for the FRET system, consisting of the Tb complex and QD. A sub-picomolar LOD for QD is achieved with this system in azide free borate buffer (pH 8.3) containing 2 % BSA and 0.5 M KF. In order to transfer the Strep-Biot model system to a real-life in vitro diagnostic application, two kinds of imunnoassays are investigated using human chorionic gonadotropin (HCG) as analyte. HCG itself, as well as two monoclonal anti-HCG mouse-IgG (immunoglobulin G) antibodies are labeled with the Tb complex and QD, respectively. Although no sufficient evidence for FRET can be found for a sandwich assay, FRET becomes obvious in a direct HCG-IgG assay showing the feasibility of using the Ln-QD donor-acceptor pair as highly sensitive analytical tool for in vitro diagnostics.
N2  - Förster Resonanzenergietransfer (FRET) spielt eine wichtige Rolle in biochemischen Anwendungen, wie z.B. DNA-Sequenzierung, intrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen, molekularen Bindungsstudien, in-vitro-Diagnostik und vielen anderen. Zur quantitativen und qualitativen Analyse werden FRET Systeme normalerweise durch molekulare Erkennung von Biomolekülen, die mit Donator- und Acceptorluminophoren markiert sind, ermöglicht. Durch die besonderen photophysikalischen Eigenschaften sowohl von Lanthanidkomplexen (Ln-Komplexen), als auch Halbleiternanokristallen (sog. Quantenpunkten oder Quantumdots - QD), sind diese besonders für FRET Anwendungen geeignet. In der vorliegenden Arbeit wird effizienter FRET zwischen Ln-Komplexen und QD in biochemischen Systemen demonstriert. Die notwendigen theoretischen und praktischen Grundlagen über FRET, Ln-Komplexe, QD und die verwendeten biochemischen Modelle werden dargestellt, und wissenschaftliche als auch kommerzielle Anwendungen werden präsentiert. FRET kann zur Messung von strukturellen Veränderungen und Dynamiken im Bereich von ca. 1 bis 10 nm verwendet werden. Der sehr starke und gut charakterisierte Bindungsprozess zwischen Streptavidin (Strep) und Biotin (Biot) wird als biomolekulares Modellsystem eingesetzt. Ein FRET System wird durch Streptavidinkonjugation mit Ln-Komplexen und QD-Biotinylierung etabliert. Drei Ln-Komplexe (einer mit Tb3+ und zwei mit Eu3+ als Zentralion) werden als Donatoren verwendet, und neben QD werden zwei weitere Acceptoren, das lumineszierende, quervernetzte Protein Allophycocyanin (APC) und ein kommerzieller Fluoreszenzfarbstoff (DY633), untersucht. FRET kann für alle Donator-Acceptor Paare nachgewiesen werden, zum einen durch sensibilisierte Acceptorlumineszenz und zum anderen durch eine über 1000-fach erhöhte Lumineszenzabklingzeit der QD mit über 100 Mikrosekunden. Mittels detailierter photophysikalischer Charakterisierung der Donatoren und Acceptoren können die Biokonjugate analysiert und die FRET Parameter berechnet werden. Für die QD FRET Systeme ergeben sich extrem große Försterradien von über 100 Å, die wesentlich größer sind als für APC und DY633 (ca. 80 bzw. 60 Å). Besondere Aufmerksamkeit gilt der Wechselwirkung mit den Zusatzreagenzien Boratpuffer, Bovines Serumalbumin (BSA), Natriumazid und Kaliumfluorid (KF) in den wässrigen Lösungen. Im Vergleich zum ausgiebig charakterisierten und vielfach verwendeten Donator-Acceptor Paar aus Europium-tris(Bipyridin) (Eu-TBP) und APC wird eine mehr als 10-fache Senkung der Nachweisgrenze für das FRET-System, bestehend aus Tb-Komplex und QD, erreicht. In azidfreiem Boratpuffer (pH 8,3) mit 2 % BSA und 0,5 M KF wird eine subpicomolare QD-Nachweisgrenze für dieses System aufgezeigt. Um den Transfer des Strep-Biot Modellsystems in eine echte in-vitro-diagnostische Anwendung zu demonstrieren, werden zwei Immuntests zum HCG-(Humanes Choriongonadotropin)-Nachweis untersucht. Sowohl HCG als auch monoklonale anti-HCG Maus-IgG-(Immunoglobulin G)-Antikörper werden mit dem Tb-Komplex bzw. mit QD markiert. Obwohl kein ausreichender Nachweis für FRET in einem immunometrischen Assay (oder Sandwichassay) erbracht werden kann, wird FRET in einem direkten HCG-IgG Assay erzielt, wodurch die Realisierbarkeit von Ln-QD Donator-Acceptor Paaren zur hochsensitiven Anwendung in der in-vitro-Diagnostik gezeigt werden kann.
KW  - FRET
KW  - Lanthanide
KW  - Quantenpunkte
KW  - Zeitaufgelöster Immunoassay
KW  - Spektroskopie
KW  - FRET
KW  - Lanthanides
KW  - Quantum Dots
KW  - Time-resolved Immunoassay
KW  - Spectroscopy
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-12686
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lemke, Karina
T1  - Abtrennung und Charakterisierung von Polyelektrolyt-modifizierten Nanopartikeln
T1  - Separation and characterization of polyelectrolyte-modified nanoparticles
N2  - Gegenstand der Dissertation ist die größen- und eigenschaftsoptimierte Synthese und Charakterisierung von anorganischen Nanopartikeln in einer geeigneten Polyelektrolytmodifizierten Mikroemulsion. Das Hauptziel bildet dabei die Auswahl einer geeigneten Mikroemulsion, zur Synthese von kleinen, stabilen, reproduzierbaren Nanopartikeln mit besonderen Eigenschaften. Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Haupteile gegliedert. Der erste Teil befasst sich mit der Einmischung von unterschiedlichen Polykationen (lineares Poly (diallyldimethylammoniumchlorid) (PDADMAC) und verzweigtes Poly (ethylenimin) (PEI)) in verschiedene, auf unterschiedlichen Tensiden (CTAB - kationisch, SDS - anionisch, SB - zwitterionisch) basierenden, Mikroemulsionssysteme. Dabei zeigt sich, dass das Einmischen der Polykationen in die Wassertröpfchen der Wasser-in-Öl (W/O) Mikroemulsion prinzipiell möglich ist. Der Einfluss der verschiedenen Polykationen auf das Phasenverhalten der W/O Mikroemulsion ist jedoch sehr unterschiedlich. In Gegenwart des kationischen Tensids führen die repulsiven Wechselwirkungen mit den Polykationen zu einer Destabilisierung des Systems, während die ausgeprägten Wechselwirkungen mit dem anionischen Tensid in einer deutlichen Stabilisierung des Systems resultieren. Für das zwitterionische Tensid führen die moderaten Wechselwirkungen mit den Polykationen zu einer partiellen Stabilisierung. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Einsatz der unterschiedlichen, Polyelektrolyt- modifizierten Mikroemulsionen als Templatphase für die Herstellung verschiedener, anorganischer Nanopartikel. Die CTAB-basierte Mikroemulsion erweist sich dabei als ungeeignet für die Herstellung von CdS Nanopartikeln, da zum einen nur eine geringe Toleranz gegenüber den Reaktanden vorhanden ist (Destabilisierungseffekt) und zum anderen das Partikelwachstum durch den Polyelektrolyt-Tensid-Film nicht ausreichend begrenzt wird. Zudem zeigt sich, dass eine Abtrennung der Partikel aus der Mikroemulsion nicht möglich ist. Die SDS-basierten Mikroemulsionen, erweisen sich als geeignete Templatphase zur Synthese kleiner anorganischer Nanopartikel (3 – 20 nm). Sowohl CdS Quantum Dots, als auch Gold Nanopartikel konnten erfolgreich in der Mikroemulsion synthetisiert werden, wobei das verzweigte PEI einen interessanten Templat-Effekt in der Mikroemulsion hervorruft. Als deutlicher Nachteil der SDS-basierten Mikroemulsionen offenbaren sich die starken Wechselwirkungen zwischen dem Tensid und den Polyelektrolyten während der Aufarbeitung der Nanopartikel aus der Mikroemulsion. Dabei erweist sich die Polyelektrolyt-Tensid-Komplexbildung als hinderlich für die Redispergierung der CdS Quantum Dots in Wasser, so dass Partikelaggregation einsetzt. Die SB-basierten Mikroemulsionen erweisen sich als günstige Templatphase für die Bildung von größen- und eigenschaftenoptimierten Nanopartikeln (< 4 nm), wobei insbesondere eine Modifizierung mit PEI als ideal betrachtet werden kann. In Gegenwart des verzweigten PEI gelang es erstmals ultrakleine, fluoreszierende Gold Cluster (< 2 nm) in einer SB-basierten Mikroemulsion als Templatphase herzustellen. Als besonderer Vorteil der SB-basierten Mikroemulsion zeigen sich die moderaten Wechselwirkungen zwischen dem zwitterionischen Tensid und den Polyelektrolyten, welche eine anschließende Abtrennung der Partikel aus der Mikroemulsion unter Erhalt der Größe und ihrer optischen Eigenschaften ermöglichen. In der redispergierten wässrigen Lösung gelang somit eine Auftrennung der PEI-modifizierten Partikel mit Hilfe der asymmetrischer Fluss Feldflussfraktionierung (aF FFF). Die gebildeten Nanopartikel zeigen interessante optische Eigenschaften und können zum Beispiel erfolgreich zur Modifizierung von Biosensoren eingesetzt werden.
N2  - This work is focused on the formation, recovery and characterisation of inorganic nanoparticles in a tailor-made polycation-modified reverse microemulsion. The main aim is the choice of an adequate microemulsion for the synthesis of small, uniform, reproducible nanoparticles with specialn characteristics. The first part is focused on the incorporation of two different polycations, low molecular weight linear poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDADMAC) and low molecular weight branched poly(ethyleneimine) (PEI) in different surfactant-based (CTAB – cationic, SDS – anionic, SB - zwitterionic) w/o microemulsions. In principle the incorporation of the polycations in the small water droplets is possible, but the influence of the polycations on the phase behaviour is different. Repulsive interactions induce a destabilisation of the w/o microemulsion for cationic surfactant CTAB, while the distinctive interactions between the anionic surfactant SDS and the polycations induce an extension of the phase range and a considerable stabilisation. In case of zwitterionic surfactant SB a partial destabilisation can be observed, according to the lower interactions with the polycations. The second part is focused on the formation of different, inorganic nanoparticles in these polyelectrolyte-modified reverse microemulsions as a template phase. The CTAB-based microemulsion is not adequate for the formation of CdS nanoparticles, according to the low tolerance towards the reactants (destabilisation effect). Furthermore the particle growth cannot be limited by the surfactant-polycation-film and a recovery of the nanoparticles from the microemulsion is not possible. The results show that the SDS-based quaternary template phase consisting of water, toluene-pentanol (1:1), and the anionic surfactant SDS in presence of PEI or PDADMAC can be successfully used for the synthesis of polymer capped inorganic nanoparticles (3 – 20 nm). CdS quantum dots, as well as gold nanoparticles are successfully synthesised in the microemulsion droplets. Especially PEI acts as a reducing and stabilizing agent and shows an additional, interesting template effect in the microemulsion. Unfortunately a recovery of the nanoparticles without a particle aggregation is not possible due to the strong surfactant polycation interactions, which lead to polycation-surfactant complexes. The SB-based microemulsion can be successfully used as a tailor-made polycation-modifiedreverse microemulsion for the formation of small, uniform nanoparticles (< 4 nm) with special characteristics. Especially a modification with PEI is optimal and for the first time small, fluorescent gold cluster (< 2 nm) can be synthesised in a SB-based microemulsion as template phase. The results show that the electrostatic interactions between the polycation and the surfactant are of high relevance especially in the solvent evaporation and redispersion process. That means only in the case of moderate polycation-surfactant interactions a redispersion of the polymer capped particles without problems of aggregation is possible and the size and characteristics are unchanged in the redispersed solution. By means of asymmetric flow field flow fractionation (af-fff) it becomes possible to separate the two cluster fractions from each other as well as from the nanoparticle fraction with diameter > 5 nm. This opens a way to use the nanoparticles with their interesting, optical characteristics in different new fields of application for example for modification of biosensors.
KW  - Mikroemulsion
KW  - Gold Cluster
KW  - Quantum Dots
KW  - Feldflussfraktionierung
KW  - Nanopartikel
KW  - Microemulsion
KW  - Gold Cluster
KW  - Quantum Dots
KW  - Field Flow Fractionation
KW  - Nanoparticles
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-68133
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TY  - THES
A1  - Riedel, Marc
T1  - Photonic wiring of enzymatic reactions to photoactive entities for the construction of biohybrid electrodes
T1  - Photonische Kontaktierung von enzymatischen Reaktionen mit photoaktiven Entitäten für den Aufbau von biohybriden Elektroden
N2  - In this work, different strategies for the construction of biohybrid photoelectrodes are investigated and have been evaluated according to their intrinsic catalytic activity for the oxidation of the cofactor NADH or for the connection with the enzymes PQQ glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), FAD-dependent glucose dehydrogenase (FAD-GDH) and fructose dehydrogenase (FDH). The light-controlled oxidation of NADH has been analyzed with InGaN/GaN nanowire-modified electrodes. Upon illumination with visible light the InGaN/GaN nanowires generate an anodic photocurrent, which increases in a concentration-dependent manner in the presence of NADH, thus allowing determination of the cofactor. Furthermore, different approaches for the connection of enzymes to quantum dot (QD)-modified electrodes via small redox molecules or redox polymers have been analyzed and discussed. First, interaction studies with diffusible redox mediators such as hexacyanoferrate(II) and ferrocenecarboxylic acid have been performed with CdSe/ZnS QD-modified gold electrodes to build up photoelectrochemical signal chains between QDs and the enzymes FDH and PQQ-GDH. In the presence of substrate and under illumination of the electrode, electrons are transferred from the enzyme via the redox mediators to the QDs. The resulting photocurrent is dependent on the substrate concentration and allows a quantification of the fructose and glucose content in solution. A first attempt with immobilized redox mediator, i.e. ferrocenecarboxylic acid chemically coupled to PQQ-GDH and attached to QD-modified gold electrodes, reveal the potential to build up photoelectrochemical signal chains even without diffusible redox mediators in solution. However, this approach results in a significant deteriorated photocurrent response compared to the situation with diffusing mediators. In order to improve the photoelectrochemical performance of such redox mediator-based, light-switchable signal chains, an osmium complex-containing redox polymer has been evaluated as electron relay for the electronic linkage between QDs and enzymes. The redox polymer allows the stable immobilization of the enzyme and the efficient wiring with the QD-modified electrode. In addition, a 3D inverse opal TiO2 (IO-TiO2) electrode has been used for the integration of PbS QDs, redox polymer and FAD-GDH in order to increase the electrode surface. This results in a significantly improved photocurrent response, a quite low onset potential for the substrate oxidation and a broader glucose detection range as compared to the approach with ferrocenecarboxylic acid and PQQ-GDH immobilized on CdSe/ZnS QD-modified gold electrodes. Furthermore, IO-TiO2 electrodes are used to integrate sulfonated polyanilines (PMSA1) and PQQ-GDH, and to investigate the direct interaction between the polymer and the enzyme for the light-switchable detection of glucose. While PMSA1 provides visible light excitation and ensures the efficient connection between the IO-TiO2 electrode and the biocatalytic entity, PQQ-GDH enables the oxidation of glucose. Here, the IO-TiO2 electrodes with pores of approximately 650 nm provide a suitable interface and morphology, which is required for a stable and functional assembly of the polymer and enzyme. The successful integration of the polymer and the enzyme can be confirmed by the formation of a glucose-dependent anodic photocurrent. In conclusion, this work provides insights into the design of photoelectrodes and presents different strategies for the efficient coupling of redox enzymes to photoactive entities, which allows for light-directed sensing and provides the basis for the generation of power from sun light and energy-rich compounds.
N2  - In dieser Arbeit werden verschiedene Strategien für den Aufbau biohybrider Photoelektroden untersucht und hinsichtlich ihrer intrinsischen katalytischen Aktivität für die Oxidation des Kofaktors NADH oder für die Kontaktierung mit den Enzymen PQQ Glukosedehydrogenase (PQQ-GDH), FAD-abhängige Glukosedehydrogenase (FAD-GDH) und Fruktosedehydrogenase (FDH) evaluiert. Der Licht-gesteuerten Nachweis von NADH wurde mittels InGaN/GaN Nanodraht-modifizierten Elektroden untersucht. Bei Beleuchtung mit sichtbarem Licht generieren die InGaN/GaN Nanodrähte einen anodischen Photostrom, welcher in der Anwesenheit von NADH konzentrationsabhängig ansteigt und somit eine Bestimmung des Kofaktors erlaubt. Des Weiteren werden verschiedene Ansätze für die Kontaktierung von Enzymen mit Quantum Dot (QD)-modifizierten Elektroden unter Verwendung von kleinen Redoxmolekülen oder Redoxpolymeren analysiert und diskutiert. Zunächst wurden Interaktionsstudien mit den Redoxmediatoren Kaliumhexacyanoferrat(II) und Ferrocencarbonsäure in Lösung an CdSe/ZnS QD-modifizierten Goldelektroden durchgeführt um darauf aufbauend photoelektrochemische Signalketten zwischen QDs und den Enzymen FDH und PQQ-GDH aufzubauen und für den Nachweis von Fruktose und Glukose zu nutzen. In Anwesenheit von Substrat und unter Beleuchtung der Elektrode werden Elektronen von dem Enzym über die Redoxmediatoren zu den QDs übertragen. Der daraus resultierende Photostrom ist abhängig von der Substratkonzentration und erlaubt eine Bestimmung des Fruktose- und Glukosegehalts in Lösung. Ein erster Ansatz mit immobilisierten Redoxmediatoren, d.h. Ferrocencarbonsäure kovalent an PQQ-GDH gebunden und auf QD-modifizierten Goldelektroden immobilisiert, zeigt das Potential photoelektrochemische Signalketten auch ohne Redoxmediatoren in Lösung aufzubauen. Jedoch resultierte dieser Ansatz in einer deutlichen Verschlechterung der Photostromantwort im Vergleich zum Ansatz mit Mediatoren in Lösung. Um die photoelektrochemische Leistungsfähigkeit Redoxmediator-basierter, Licht-schaltbarer Signalketten zu verbessern, wurde ein Osmiumkomplex-Redoxpolymer für die elektronische Kontaktierung zwischen QDs und Enzymen untersucht. Das Redoxpolymer erlaubt eine stabile Immobilisierung des Enzymes und eine effiziente Kontaktierung mit der QD-modifizierten Elektrode. Zusätzlich wurde eine 3D „inverse opale“ TiO2 (IO-TiO2) Elektrode für die Integration der PbS QDs, des Redoxpolymers und der FAD-GDH verwendet um die Elektrodenoberfläche zu vergrößern. Dies führt zu einer deutlich verbesserten Leistungsfähigkeit hinsichtlich der Photostromantwort, des Startpotentials für die Substratoxidation und des Nachweisbereiches für Glukose im Vergleich zu dem Ansatz mit Ferrocencarbonsäure und PQQ-GDH immobilisiert auf CdSe/ZnS QD-modifizierten Goldelektroden. Des Weiteren wurden IO-TiO2 Elektroden verwendet um sulfonierte Polyaniline (PMSA1) und PQQ-GDH zu integrieren und die direkte Interaktion zwischen dem Polymer und dem Enzym für den Licht-schaltbaren Nachweis von Glukose zu untersuchen. Während PMSA1 eine Anregung mit sichtbaren Licht ermöglicht und die effiziente Verbindung zwischen der IO-TiO2-Elektrode und der biokatalytischen Einheit sicherstellt, ermöglicht die PQQ-GDH die Oxidation von Glukose. Hierbei bieten die IO-TiO2-Elektroden mit Poren von ca. 650 nm eine geeignete Schnittstelle und Morphologie, welche für eine stabile und funktionelle Assemblierung des Polymers und Enzyms benötigt wird. Die erfolgreiche Integration des Polymers und des Enzyms kann durch die Ausbildung eines Glukose-abhängigen anodischen Photostroms bestätigt werden. Zusammenfassend gibt diese Arbeit Einblicke in den Aufbau von Photoelektroden und präsentiert verschiedene, effiziente Kopplungsstrategien zwischen Redoxenzymen und photoaktiven Komponenten, welche einen Licht-gesteuerten Nachweis von Analyten ermöglichen und die Grundlage für die Energieerzeugung aus Licht und energiereichen Verbindungen bilden.
KW  - biocatalysis
KW  - photocatalysis
KW  - quantum dots
KW  - photoelectrochemical sensor
KW  - enzymes
KW  - Biokatalyse
KW  - Photokatalyse
KW  - Quantum Dots
KW  - Photoelektrchemischer Sensor
KW  - Enzyme
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-417280
ER  -