TY - JOUR A1 - Koonce, Michael A1 - Tikhonenko, Irina A1 - Gräf, Ralph T1 - Dictyostelium cell fixation BT - two simple tricks JF - Methods and protocols N2 - We share two simple modifications to enhance the fixation and imaging of relatively small, motile, and rounded model cells. These include cell centrifugation and the addition of trace amounts of glutaraldehyde to existing fixation methods. Though they need to be carefully considered in each context, they have been useful to our studies of the spatial relationships of the microtubule cytoskeletal system. KW - Dictyostelium KW - cell fixation KW - microscopy KW - microtubule KW - cytoskeleton Y1 - 2020 U6 - https://doi.org/10.3390/mps3030047 SN - 2409-9279 VL - 3 IS - 3 PB - MDPI CY - Basel ER - TY - JOUR A1 - Breuer, David A1 - Nowak, Jacqueline A1 - Ivakov, Alexander A1 - Somssich, Marc A1 - Persson, Staffan A1 - Nikoloski, Zoran T1 - System-wide organization of actin cytoskeleton determines organelle transport in hypocotyl plant cells JF - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America N2 - The actin cytoskeleton is an essential intracellular filamentous structure that underpins cellular transport and cytoplasmic streaming in plant cells. However, the system-level properties of actin-based cellular trafficking remain tenuous, largely due to the inability to quantify key features of the actin cytoskeleton. Here, we developed an automated image-based, network-driven framework to accurately segment and quantify actin cytoskeletal structures and Golgi transport. We show that the actin cytoskeleton in both growing and elongated hypocotyl cells has structural properties facilitating efficient transport. Our findings suggest that the erratic movement of Golgi is a stable cellular phenomenon that might optimize distribution efficiency of cell material. Moreover, we demonstrate that Golgi transport in hypocotyl cells can be accurately predicted from the actin network topology alone. Thus, our framework provides quantitative evidence for system-wide coordination of cellular transport in plant cells and can be readily applied to investigate cytoskeletal organization and transport in other organisms. KW - actin KW - cytoskeleton KW - Golgi KW - image processing KW - networks Y1 - 2017 U6 - https://doi.org/10.1073/pnas.1706711114 SN - 0027-8424 VL - 114 SP - E5741 EP - E5749 PB - National Acad. of Sciences CY - Washington ER - TY - THES A1 - Breuer, David T1 - The plant cytoskeleton as a transportation network T1 - Modellierung des pflanzliche Zytoskeletts als Transportnetzwerk N2 - The cytoskeleton is an essential component of living cells. It is composed of different types of protein filaments that form complex, dynamically rearranging, and interconnected networks. The cytoskeleton serves a multitude of cellular functions which further depend on the cell context. In animal cells, the cytoskeleton prominently shapes the cell's mechanical properties and movement. In plant cells, in contrast, the presence of a rigid cell wall as well as their larger sizes highlight the role of the cytoskeleton in long-distance intracellular transport. As it provides the basis for cell growth and biomass production, cytoskeletal transport in plant cells is of direct environmental and economical relevance. However, while knowledge about the molecular details of the cytoskeletal transport is growing rapidly, the organizational principles that shape these processes on a whole-cell level remain elusive. This thesis is devoted to the following question: How does the complex architecture of the plant cytoskeleton relate to its transport functionality? The answer requires a systems level perspective of plant cytoskeletal structure and transport. To this end, I combined state-of-the-art confocal microscopy, quantitative digital image analysis, and mathematically powerful, intuitively accessible graph-theoretical approaches. This thesis summarizes five of my publications that shed light on the plant cytoskeleton as a transportation network: (1) I developed network-based frameworks for accurate, automated quantification of cytoskeletal structures, applicable in, e.g., genetic or chemical screens; (2) I showed that the actin cytoskeleton displays properties of efficient transport networks, hinting at its biological design principles; (3) Using multi-objective optimization, I demonstrated that different plant cell types sustain cytoskeletal networks with cell-type specific and near-optimal organization; (4) By investigating actual transport of organelles through the cell, I showed that properties of the actin cytoskeleton are predictive of organelle flow and provided quantitative evidence for a coordination of transport at a cellular level; (5) I devised a robust, optimization-based method to identify individual cytoskeletal filaments from a given network representation, allowing the investigation of single filament properties in the network context. The developed methods were made publicly available as open-source software tools. Altogether, my findings and proposed frameworks provide quantitative, system-level insights into intracellular transport in living cells. Despite my focus on the plant cytoskeleton, the established combination of experimental and theoretical approaches is readily applicable to different organisms. Despite the necessity of detailed molecular studies, only a complementary, systemic perspective, as presented here, enables both understanding of cytoskeletal function in its evolutionary context as well as its future technological control and utilization. N2 - Das Zytoskelett ist ein notwendiger Bestandteil lebender Zellen. Es besteht aus verschiedenen Arten von Proteinfilamenten, die ihrerseits komplexe, sich dynamisch reorganisierende und miteinander verknüpfte Netzwerke bilden. Das Zytoskelett erfüllt eine Vielzahl von Funktionen in der Zelle. In Tierzellen bestimmt das Aktin-Zytoskelett maßgeblich die mechanischen Zelleigenschaften und die Zellbewegung. In Pflanzenzellen hingegen kommt dem Aktin-Zytoskelett eine besondere Bedeutung in intrazellulären Transportprozessen zu, bedingt insbesondere durch die starre pflanzliche Zellwand sowie die Zellgröße. Als wesentlicher Faktor für Zellwachstum und somit auch die Produktion von Biomasse, ist Zytoskelett-basierter Transport daher von unmittelbarer ökologischer und ökonomischer Bedeutung. Während das Wissen über die molekularen Grundlagen Zytoskelett-basierter Transportprozesse beständig wächst, sind die zugrunde liegenden Prinzipien zellweiter Organisation bisher weitgehend unbekannt. Diese Dissertation widmet sich daher folgender Frage: Wie hängt die komplexe Architektur des pflanzlichen Zytoskeletts mit seiner intrazellulären Transportfunktion zusammen? Eine Antwort auf diese Frage erfordert eine systemische Perspektive auf Zytoskelettstruktur und -transport. Zu diesem Zweck habe ich Mikroskopiedaten mit hoher raumzeitlicher Auflösung sowie Computer-gestützte Bildanalysen und mathematische Ansätzen der Graphen- und Netzwerktheorie kombiniert. Die vorliegende Dissertation umfasst fünf meiner Publikationen, die sich einem systemischen Verständnis des pflanzlichen Zytoskeletts als Transportnetzwerk widmen: (1) Dafür habe ich Bilddaten-basierte Netzwerkmodelle entwickelt, die eine exakte und automatisierte Quantifizierung der Architektur des Zytoskeletts ermöglichen. Diese Quantifizierung kann beispielsweise in genetischen oder chemischen Versuchen genutzt werden und für eine weitere Erforschung der genetischen Grundlagen und möglicher molekularer Interaktionspartner des Zytoskeletts hilfreich sein; (2) Ich habe nachgewiesen, dass das pflanzliche Aktin-Zytoskelett Eigenschaften effizienter Transportnetzwerk aufweist und Hinweise auf seine evolutionären Organisationsprinzipien liefert; (3) Durch die mathematische Optimierung von Transportnetzwerken konnte ich zeigen, dass unterschiedliche Pflanzenzelltypen spezifische und optimierte Organisationsstrukturen des Aktin-Zytoskeletts aufweisen; (4) Durch quantitative Analyse des Transports von Organellen in Pflanzenzellen habe ich nachgewiesen, dass sich Transportmuster ausgehend von der Struktur des Aktin-Zytoskeletts vorhersagen lassen. Dabei spielen sowohl die Organisation des Zytoskeletts auf Zellebene als auch seine Geometrie eine zentrale Rolle. (5) Schließlich habe ich eine robuste, optimierungs-basierte Methode entwickelt, die es erlaubt, individuelle Filamente eines Aktin-Netzwerks zu identifizieren. Dadurch ist es möglich, die Eigenschaften einzelner Zytoskelettfilamente im zellulären Kontext zu untersuchen. Die im Zuge dieser Dissertation entwickelten Methoden wurden frei und quelloffen als Werkzeuge zur Beantwortung verwandter Fragestellung zugänglich gemacht. Insgesamt liefern die hier präsentierten Ergebnisse und entwickelten Methoden quantitative, systemische Einsichten in die Transportfunktion des Zytoskeletts. Die hier etablierte Kombination von experimentellen und theoretischen Ansätzen kann, trotz des Fokusses auf das pflanzliche Zytoskelett, direkt auf andere Organismen angewendet werden. Als Ergänzung molekularer Studien bildet ein systemischer Blickwinkel, wie er hier entwickelt wurde, die Grundlage für ein Verständnis sowohl des evolutionären Kontextes als auch zukünftiger Kontroll- und Nutzungsmöglichkeiten des pflanzlichen Zytoskeletts. KW - systems biology KW - mathematical modeling KW - cytoskeleton KW - plant science KW - graph theory KW - image analysis KW - Systembiologie KW - mathematische Modellierung KW - Zytoskelett KW - Zellbiologie KW - Graphtheorie KW - Bildanalyse Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93583 ER - TY - THES A1 - Bringmann, Martin T1 - Identification of novel components that connect cellulose synthases to the cytoskeleton T1 - Identifikation neuer Proteine als Bindeglieder zwischen den Zellulosesynthasen und dem Zytoskelett N2 - Cellulose is the most abundant biopolymer on earth and the main load-bearing structure in plant cell walls. Cellulose microfibrils are laid down in a tight parallel array, surrounding plant cells like a corset. Orientation of microfibrils determines the direction of growth by directing turgor pressure to points of expansion (Somerville et al., 2004). Hence, cellulose deficient mutants usually show cell and organ swelling due to disturbed anisotropic cell expansion (reviewed in Endler and Persson, 2011). How do cellulose microfibrils gain their parallel orientation? First experiments in the 1960s suggested, that cortical microtubules aid the cellulose synthases on their way around the cell (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). This was proofed in 2006 through life cell imaging (Paredez et al., 2006). However, how this guidance was facilitated, remained unknown. Through a combinatory approach, including forward and reverse genetics together with advanced co-expression analysis, we identified pom2 as a cellulose deficient mutant. Map- based cloning revealed that the gene locus of POM2 corresponded to CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1). Intriguingly, we previously found the CSI1 protein to interact with the putative cytosolic part of the primary cellulose synthases in a yeast-two-hybrid screen (Gu et al., 2010). Exhaustive cell biological analysis of the POM2/CSI1 protein allowed to determine its cellular function. Using spinning disc confocal microscopy, we could show that in the absence of POM2/CSI1, cellulose synthase complexes lose their microtubule-dependent trajectories in the plasma membrane. The loss of POM2/CSI1, however does not influence microtubule- dependent delivery of cellulose synthases (Bringmann et al., 2012). Consequently, POM2/CSI1 acts as a bridging protein between active cellulose synthases and cortical microtubules. This thesis summarizes three publications of the author, regarding the identification of proteins that connect cellulose synthases to the cytoskeleton. This involves the development of bioinformatics tools allowing candidate gene prediction through co-expression studies (Mutwil et al., 2009), identification of candidate genes through interaction studies (Gu et al., 2010), and determination of the cellular function of the candidate gene (Bringmann et al., 2012). N2 - Zellulose ist das abundanteste Biopolymer der Erde und verleiht pflanzlichen Zellwänden ihre enorme Tragkraft. Mit der Reißfestigkeit von Stahl umwickeln Zellulosefibrillen pflanzliche Zellwände wie ein Korsett. Die Orientierung der Zellulosefibrillen bestimmt zugleich die Wachstumsrichtung, indem sie den Zellinnendruck (Turgor) in die entsprechende Ausdehnungsrichtung dirigiert (Somerville et al.,2004).Folglich zeigen Mutanten mit gestörter Zellulosesynthese oft geschwollene Organe und Zellen, die sich nicht mehr gerichtet ausdehnen können (zusammengefasst von Endler und Persson,2011). Wie aber erhalten die Zellulosefibrillen ihre parallele Orientierung? Erste Experimente aus den1960ern führten zur Vermutung, kortikale Mikrotubuli leiten die Zellulosesynthasen auf ringförmigen Bahnen um die Zellen herum (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). Diese Theorie wurde 2006 mit Hilfe moderner mikroskopischer Methoden bestätigt (Paredez et al., 2006). Wie jedoch dieser Leitmechanismus funktioniert, blieb bisher unentdeckt. Durch die Kombination verschiedener genetischer und bioinformatischer Methoden, konnten wir pom2 als Zellulose defiziente Mutante identifizieren. Die Ermittlung des Genlocus durch Map-based cloning zeigte, dass es sich bei POM2 um CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1) handelt, ein Gen, dessen korrespondierendes Protein, wie vorher von uns gezeigt, mit dem zytosolischen Teil der primären Zellulosesynthasen interagiert (Gu et al., 2010). Durch ausführliche zellbiologische Charakterisierung von POM2/CSI1 konnten wir seine zelluläre Funktion entschlüsseln. Mit Hilfe konfokaler Spinning- Disc-Mikroskopie konnten wir zeigen, dass in Abwesenheit von POM2/CSI1, Zellulosesynthasen von den Mikrotubuli- Bahnen abweichen. Der ebenfalls von den Mikrotubuli abhängige Transport der Zellulosesynthasen zur Zellmembran hingegen, war nicht beeinflusst (Bringmann et al., 2012). Demzufolge ist POM2/CSI1 das gesuchte Bindeglied zwischen aktiven Zellulosesynthasen und Mikrotubuli. In dieser Dissertationsschrift werden drei Publikationen des Autors zusammengefasst, die wa ̈hrend der Arbeit an der Dissertiation entstanden sind. Sie beinhalten die Entwicklung bioinformatischer Methoden zur Ko- Expressionsanalyse, um Kandidatengene zu ermitteln (Mutwil et al., 2009), die Identifikaton des Kandidatengens POM2/CSI1 in einer Interaktionsstudie (Gu et al., 2010), sowie die Bestimmung der zellula ̈ren Funktion des korrespondieren- den Proteins POM2/CSI1 (Bringmann et al., 2012). KW - Zellwand KW - Zytoskelett KW - Mikrotubuli KW - CESA Komplex KW - Polysaccharide KW - cell wall KW - cytoskeleton KW - microtubules KW - cesa complex KW - polysaccharides Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61478 ER -