TY - THES A1 - Streffer, Katrin T1 - Highly sensitive measurements of substrates and inhibitors on the basis of tyrosinase sensors and recycling systems N2 - Analytische Chemie heute meint nicht länger nur die große Messtechnik, die zeit- und kostenintensiv ist, die außerdem nur von qualifiziertem Personal zu bedienen ist und deren Resultate nur durch dieses Personal auswertbar sind. Meist erfordert diese sagen wir 'klassische analytische Messtechnik' auch noch spezielle Räumlichkeiten und oft eine relative große Menge an speziell vorbereiteten Proben. Neben dieser klassischen analytischen Messtechnik hat sich besonders in den letzten Jahren eine auf bestimmte Stoffgruppen und Anforderungen zugeschnittene Messtechnik durchgesetzt, die oft auch durch einen Laien bedient werden kann. Meist sind es sehr kleine Geräte. Auch die benötigten Probenvolumina sind klein und eine spezielle Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. Ausserdem sind die Geräte einfach zu handhaben, billig sowohl in ihrer Herstellung als auch im Gebrauch und meist erlauben sie sogar eine kontinuierliche Messwerterfassung. Zahlreiche dieser in den letzten Jahren entwickelten Geräte greifen zurück auf 40 Jahre Forschung auf dem Gebiet der Biosensorik. Seit Clark und Lyons im Jahr 1962 in der Lage waren, mit einer einfachen Sauerstoffelektrode, ergänzt durch ein Enzym, Glucose zu messen, war die Entwicklung neuer Messtechnik nicht mehr aufzuhalten. Biosensoren, spezielle Messfühler, die aus einer Kombination aus biologischer Komponente (erlaubt eine spezifische Erkennung des Analyten auch ohne vorherige Reinigung der Probe) und einem physikalischen Messfühler (wandelt den primären physikochemischen Effekt in ein elektronisch messbares Signal um) bestehen, eroberten den Markt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Tyrosinasesensoren entwickelt, die je nach Herkunft und Eigenschaften der verwendeten Tyrosinase unterschiedliche Anforderungen erfüllen. Beispielsweise wurde einer dieser Tyrosinasesensoren für die Bestimmung phenolischer Verbindungen in Fluss- und Seewasserproben eingesetzt, und die mit diesem Sensor gemessenen Ergebnisse konnten sehr gut mit dem entsprechenden DIN-Test zur Bestimmung phenolischer Verbindungen korreliert werden. Ein anderer entwickelter Sensor zeigte eine sehr hohe Empfindlichkeit für Catecholamine, Substanzen die speziell in der medizinischen Diagnostik von Wichtigkeit sind. Ausserdem zeigten die ebenfalls im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Untersuchungen zweier verschiedener Tyrosinasen, dass, will man in Zukunft noch empfindlichere Tyrosinasesensoren entwickeln, eine spezielle Tyrosinase (Tyrosinase aus Streptomyces antibioticus) die bessere Wahl sein wird, als die bisher im Bereich der Biosensorforschung verwendete Tyrosinase aus Agaricus bisporus. Desweiteren wurden erste Erfolge auf molekularbiologischem Gebiet erreicht, das heisst, dass Tyrosinasemutanten mit speziellen, vorher überlegten Eigenschaften, hergestellt werden sollen. Diese Erfolge können dazu genutzt werden, eine neue Generation an Tyrosinasesensoren zu entwickeln, Tyrosinasesensoren in denen Tyrosinase gerichtet gebunden werden kann, sowohl an den entsprechenden physikalischen Messfühler oder auch an ein anderes Enzym. Davon verspricht man sich deutlich minimierte Wege, die die zu bestimmende Substanz (oder deren Produkt) sonst zurücklegen müsste, was am Ende zu einer deutlich erhöhten Empfindlichkeit des resultierenden Biosensors führen sollte. N2 - Today, analytical chemistry does not longer consist of only the big measuring devices and methods which are time consuming and expensive, which can furthermore only be handled by the qualified staff and in addition the results can also only be evaluated by this qualified staff. Usually, this technique, which shall be described in the following as 'classic analytic measuring technique', requires also rooms equipped especially and often a relative big quantity of the test compounds which should be prepared especially. Beside this classic analytic measuring technique, limited on definite substance groups and requests, a new measuring technique has gained acceptance particularly within the last years, which one can often be used by a layman, too. Often the new measuring technique has very little pieces of equipment. The needed sample volumes are also small and a special sample preparation isn't required. In addition, the new measuring instruments are simple to handle. They are cheap both in their production and in the use and they permit even a continuous measurement recording usually. Numerous of this new measuring instruments base on the research in the field of Biosensorik during the last 40 years. Since Clark and Lyon in the year 1962 were able to measure glucose with a simple oxygen electrode, completed by an enzyme the development of the new measuring technique did not have to be held back any longer. Biosensors, special pickups which consists of a combination from a biological component (permits a specific recognition of the analyte also without purification of the sample previously) and a physical pickup (convert the primary physicochemical effect into an electronically measurable signal), conquered the market. In the context of this thesis different tyrosinasesensors were developed which fulfilling the various requests, depending on origin and features of the used tyrosinase. One of the tyrosinasesensors for example was used for quantification of phenolic compounds in river and sea water and the results could correlated very well with the corresponding DIN-test for the determination of phenolic compounds. An other developed tyrosinasesensor showed a very high sensitiveness for catecholamines, substances which are of special importance in the medical diagnostics. In addition, the investigations of two different tyrosinases, which were carried out also in the context of this thesis, have shown, that a special tyrosinase (tyrosinase from Streptomyces antibioticus) will be the better choice as tyrosinase from Agaricus bisporus, which is used in the area of biosensor research till now, if one wants to develop in future even more sensitive tyrosinasesensors. Furthermore, first successes became reached on a molecular biological field, the production of tyrosinasemutants with special, before well-considered features. These successes can be used to develop a new generation of tyrosinasesensors, tyrosinasesensors in which tyrosinase can be bound directionally both to the corresponding physical pickup or also to another enzyme. From this one expects to achieve ways minimized which the substance to be determined (or whose product) otherwise must cover. Finally, this should result in an clearly visible increase of sensitivity of the Biosensor. KW - Enzymelektrode ; Monophenolmonooxygenase KW - Tyrosinase KW - Phenol KW - Biosensor KW - Glucosedehydrogenase KW - Recyclingsystem KW - Tyrosinaseinhibitoren KW - Bioelektrokatalytisches Recycling KW - Biokatalytisches Recyc KW - tyrosinase KW - phenol KW - biosensor KW - glucose dehydrogenase KW - recycling system KW - tyrosinase inhibitors KW - bioelectrocatalytic recycling KW - biocatalytic recycling Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000632 ER - TY - JOUR A1 - Krylov, Andrey. V. A1 - Adamzig, H. A1 - Walter, A. D. A1 - Loechel, B. A1 - Kurth, E. A1 - Pulz, O. A1 - Szeponik, Jan A1 - Wegerich, Franziska A1 - Lisdat, Fred T1 - Parallel generation and detection of superoxide and hydrogen peroxide in a fluidic chip JF - Sensors and actuators : B, Chemical N2 - A fluidic chip system was developed, which combines a stable generation of superoxide radicals and hydrogen peroxide with their sensorial detection. The generation of both reactive oxygen species was achieved by immobilization of xanthine oxidase on controlled pore glass in a reaction chamber. Antioxidants can be introduced into the fluidic chip system by means of mixing chamber. The detection of both species is based on the amperometric principle using a biosensor chip with two working electrodes. As sensing protein for both electrodes cytochrome c was used. The novel system was designed for the quantification of the antioxidant efficiency of different potential scavengers of the respective reactive species in an aqueous medium. Several model antioxidants such as ascorbic acid or catalase have been tested under flow conditions. KW - biosensor KW - cytochrome c KW - flow system KW - reactive oxygen species KW - antioxidant Y1 - 2006 U6 - https://doi.org/10.1016/j.snb.2005.11.062 SN - 0925-4005 VL - 119 IS - 1 SP - 118 EP - 126 PB - Elsevier CY - Lausanne ER - TY - THES A1 - Wegerich, Franziska T1 - Engineered human cytochrome c : investigation of superoxide and protein-protein interaction and application in bioelectronic systems T1 - Gentechnisch verändertes humanes Cytochrom c :Untersuchungen von Superoxid und Protein-Protein-Interaktionen sowie der Anwendung in bioelektronischen Systemen N2 - The aim of this thesis is the design, expression and purification of human cytochrome c mutants and their characterization with regard to electrochemical and structural properties as well as with respect to the reaction with the superoxide radical and the selected proteins sulfite oxidase from human and fungi bilirubin oxidase. All three interaction partners are studied here for the first time with human cyt c and with mutant forms of cyt c. A further aim is the incorporation of the different cyt c forms in two bioelectronic systems: an electrochemical superoxide biosensor with an enhanced sensitivity and a protein multilayer assembly with and without bilirubin oxidase on electrodes. The first part of the thesis is dedicated to the design, expression and characterization of the mutants. A focus is here the electrochemical characterization of the protein in solution and immobilized on electrodes. Further the reaction of these mutants with superoxide was investigated and the possible reaction mechanisms are discussed. In the second part of the work an amperometric superoxide biosensor with selected human cytochrome c mutants was constructed and the performance of the sensor electrodes was studied. The human wild-type and four of the five mutant electrodes could be applied successfully for the detection of the superoxide radical. In the third part of the thesis the reaction of horse heart cyt c, the human wild-type and seven human cyt c mutants with the two proteins sulfite oxidase and bilirubin oxidase was studied electrochemically and the influence of the mutations on the electron transfer reactions was discussed. Finally protein multilayer electrodes with different cyt form including the mutant forms G77K and N70K which exhibit different reaction rates towards BOD were investigated and BOD together with the wild-type and engineered cyt c was embedded in the multilayer assembly. The relevant electron transfer steps and the kinetic behavior of the multilayer electrodes are investigated since the functionality of electroactive multilayer assemblies with incorporated redox proteins is often limited by the electron transfer abilities of the proteins within the multilayer. The formation via the layer-by-layer technique and the kinetic behavior of the mono and bi-protein multilayer system are studied by SPR and cyclic voltammetry. In conclusion this thesis shows that protein engineering is a helpful instrument to study protein reactions as well as electron transfer mechanisms of complex bioelectronic systems (such as bi-protein multilayers). Furthermore, the possibility to design tailored recognition elements for the construction of biosensors with an improved performance is demonstrated. N2 - Ziel dieser Arbeit ist es genetisch veränderte Formen von humanem Cytochrom c herzustellen und diese einerseits hinsichtlich der Reaktion mit dem Sauerstoff-Radikal Superoxid aber auch mit anderen Proteinen zu untersuchen. Zusätzlich sollen die verschiedenen Protein-Mutanten in neuartige bioelektronische Systeme eingebracht werden. Es wurden insgesamt 20 Cytochrome c Mutanten designt, rekombinant exprimiert und aufgereinigt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich die Reaktion von Cytochrom c mit dem negativ geladenen Superoxid durch gezielte Mutationen, die zusätzliche positive Ladungen in das Molekül bringen, um bis zu 30 % erhöhen lässt. Es wurde aber auch deutlich, dass andere Eigenschaften des Proteins sowie dessen Struktur durch die Mutationen geändert werden können. Cytochrom c Mutanten mit einer erhöhten Reaktionsrate mit Superoxid konnten erfolgreich in einen Superoxid-Biosensor mit erhöhter Sensitivität eingebracht werden. Weiterhin wurde einige Mutanten hinsichtlich Ihrer Interaktion mit den zwei Enzymen Sulfitoxidase und Bilirubinoxidase untersucht. Hier konnten ebenfalls unterschiedliche Reaktivitäten festgestellt werden. Schließlich wurden ausgewählte Protein-Varianten mit und ohne den zuvor untersuchten Enzymen in ein Multischicht-Elektroden-System eingebettet und dessen kinetisches Verhalten untersucht. Es wurde gefunden, dass die Schnelligkeit mit der Cytochrom c mit sich selbst Elektronen austauschen kann, eine Limitierung der Größenordnung der katalytischen Ströme darstellt. Diese Selbstaustausschrate wurde durch die eingeführten Mutationen verändert. So verdeutlicht diese Arbeit, dass „Protein-Engineering“ ein gutes Hilfsmittel sein kann, um einerseits Proteinreaktionen und komplexe Elektronentransferreaktionen in Multischichten zu untersuchen, aber auch ein potentes Werkzeug darstellt mit dem zugeschnittene Biokomponenten für Sensoren mit erhöhter Leistungsfähigkeit generiert werden können. KW - Cytochrom c KW - Protein-Engineering KW - Elektrochemie KW - Biosensor KW - Superoxid KW - cytochrome c KW - protein engineering KW - electrochemistry KW - biosensor KW - superoxide Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50782 ER - TY - THES A1 - Frasca, Stefano T1 - Biocatalysis on nanostructured surfaces : investigation and application of redox proteins using spectro-electrochemical methods T1 - Biokatalyse auf nanostrukturierten Oberflächen : Untersuchung und Anwendung von Redox-Proteinen unter Verwendung von Spektro-Elektrochemischen Verfahren N2 - In this thesis, different aspects within the research field of protein spectro- and electro-chemistry on nanostructured materials are addressed. On the one hand, this work is related to the investigation of nanostructured transparent and conductive metal oxides as platform for the immobilization of electroactive enzymes. On the other hand the second part of this work is related to the immobilization of sulfite oxidase on gold nanoparticles modified electrode. Finally direct and mediated spectroelectrochemistry protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and its high homologues the mouse aldehyde oxidase homolog 1. Stable immobilization and reversible electrochemistry of cytochrome c in a transparent and conductive tin-doped and tin-rich indium oxide film with a well-defined mesoporosity is reported. The transparency and good conductivity, in combination with the large surface area of these materials, allow the incorporation of a high amount of electroactive biomolecules (between 250 and 2500 pmol cm-2) and their electrochemical and spectroscopic investigation. Both, the electrochemical behavior and the immobilization of proteins are influenced by the geometric parameters of the porous material, such as the structure and pore shape, the surface chemistry, as well as the protein size and charge. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, are employed for the characterization of cytochrome c immobilized in the mesoporous indium tin oxide and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. A long term protein immobilization is reached using these unmodified mesoporous indium oxide based materials, i.e. more than two weeks even at high ionic strength. The potential of this modified material as an amperometric biosensor for the detection of superoxide anions is demonstrated. A sensitivity of about 100 A M-1 m-2, in a linear measuring range of the superoxide concentration between 0.13 and 0.67 μM, is estimated. In addition an electrochemical switchable protein-based optical device is designed with the core part composed of cytochrome c immobilized on a mesoporous indium tin oxide film. A color developing redox sensitive dye is used as switchable component of the system. The cytochrome c-catalyzed oxidation of the dye by hydrogen peroxide is spectroscopically investigated. When the dye is co-immobilized with the protein, its redox state is easily controlled by application of an electrical potential at the supporting material. This enables to electrochemical reset the system to the initial state and repetitive signal generation. The case of negative charged proteins, which does not have a good interaction with the negative charged indium oxide based films, is also explored. The modification of an indium tin oxide film with a positive charged polymer and the employment of a antimony doped tin oxide film were investigated in this work in order to overcome the repulsion induced by similar charges of the protein and electrode. Human sulfite oxidase and its separated heme-containing domain are able to direct exchange electrons with the supporting material. A study of a new approach for sulfite biosensing, based on enhanced direct electron transfer of a human sulfite oxidase immobilized on a gold nanoparticles modified electrode is reported. The spherical gold nanoparticles were prepared via a novel method by reduction of HAuCl4 with branched poly(ethyleneimine) in an ionic liquid resulting in particles of about 10 nm in hydrodynamic diameter. These nanoparticles were covalently attached to a mercaptoundecanoic acid modified Au-electrode and act as platform where human sulfite oxidase is adsorbed. An enhanced interfacial electron transfer and electrocatalysis is therefore achieved. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, were employed for the characterization of the system and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. The proposed biosensor exhibited a quick steady-state current response, within 2 s and a linear detection range between 0.5 and 5.4 μM with high sensitivity (1.85 nA μM-1). The investigated system provides remarkable advantages, since it works at low applied potential and at very high ionic strength. Therefore these properties could make the proposed system useful in the development of bioelectronic devices and its application in real samples. Finally protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and the mouse aldehyde oxidase homolog 1 were spectroelectrochemically studied. It could be demonstrated that different cofactors present in the protein structure, like the FAD and the molybdenum cofactor, are able to directly exchange electrons with an electrode and are displayed as a single peak in a square wave voltammogram. Protein mutants bearing a serine substituted to the cysteines, bounding to the most exposed iron sulfur cluster additionally showed direct electron transfer which can be attributable to this cluster. On the other hand a mediated spectroelectrochemical titration of the protein bound FAD cofactor was performed in presence of transparent iron and cobalt complex mediators. The results showed the formation of the stable semiquinone and the fully reduced flavin. Two formal potentials for each single electron exchange step were then determined. N2 - In dieser Arbeit werden verschiedenen Aspekte im Forschungsfeld der Protein-Spekro- und Elektro-Chemie an nanostrukturierte Materialien behandelt. Zum einen werden in dieser Arbeit nanostrukturierte, transparente und leitfähige Metalloxide als Basis für die Immobilisierung von elektroaktiven Enzym untersucht. Des Weiteren behandelt diese Arbeit die Immobilisierung von humaner Sulfitoxidase auf einer Gold-Nanopartikel-modifizierten Elektrode. Schließlich wird die direkte und die vermittelte Elektrochemie von Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Aldehydoxidase Homolog 1, aus Mause, vorgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wird über die stabile Immobilisierung und reversible Elektrochemie von Cytochrom c in einem transparenten und leitfähigen Zinn-dotierten und Zinn-reichen Indiumoxid Film mit einer gut definierten Mesoporosität berichtet. Die Transparenz und gute Leitfähigkeit in Kombination mit der großen Oberfläche dieser Materialien erlauben die Inkorporation einer große Menge elektroaktiver Biomoleküle (zwischen 250 und 2500 pmol cm-2) und deren elektrochemische und spektroskopische Untersuchung. Das elektrochemische Verhalten und die Proteinimmobilisierung sind durch die geometrischen Parameter des porösen Materials, wie die Struktur und Porenform, die Oberflächenchemie, sowie die Größe und Ladung des Proteins beeinflusst. UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie werden für die Charakterisierung von Cytochrom c eingesetzt und zeigen keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins durch die Immobilisierung. Eine langfristige Immobilisierung des Proteins von mehr als zwei Wochen auch bei hoher Ionenstärke wurde unter Verwendung dieser unmodifizierten mesoporösen Indiumoxid-basierten Materialien erreicht. Das Potential dieses modifizierten Materials für die Verwendung in einem amperometrischen Biosensor zum Nachweis von Superoxid-Anionen wurde aufgezeigt. Es wurde eine Empfindlichkeit von etwa 100 A M-1 m-2, in einem linearen Messbereich der Superoxidkonzentration zwischen 0,13 und 0,67 µM, erreicht. Außerdem wurde ein elektrochemisch umschaltbares Protein-basiertes optisches Gerät konzipiert mit Cytochrom c und der mesoporösen Indiumzinnoxidschicht. Ein redox-sensitiver Farbstoff wurde als schaltbare Komponente des Systems verwendet. Die Cytochrom c Oxidation des Farbstoffs durch Wasserstoffperoxid wurde spektroskopisch untersucht. Der Redox-Zustand des Farbstoffs, co-immobilisiert mit dem Protein, ist leicht durch das Anlegen eines elektrischen Potentials an das Trägermaterial kontrollierbar. Dadurch wird die elektrochemische Zurücksetzung des Systems auf den Anfangszustand und eine repetitive Signalerzeugung ermöglicht. Für negativ geladene Proteine, die keine gute Interaktion mit dem negativ geladenen Indiumoxid-basierten Film zeigen wurden die Modifikation der Indiumzinnoxidschicht mit einem positiv geladenen Polymer sowie die Verwendung eines Antimon-dotierten Zinnoxid Films vorgeschlagen. Dadurch konnte die Abstoßung induziert durch die ähnliche Ladung des Proteins und der Elektrode überwunden werden. Es gelang für die humane Sulfit-Oxidase und die separate Häm-haltige Domäne der Austausch von Elektronen mit dem Trägermaterial. Im zweiten Teil der Arbeit wird über eine neue Methode für die Biosensorik von Sulfit berichtet, bei der direkte Elektronentransfer von humaner Sulfitoxidase immobilisierten auf einer mit Gold-Nanopartikeln modifizierten Elektrode verstärkt wurde. Die sphärischen Gold-Nanopartikeln, von etwa 10 nm im Durchmesser, wurden über eine neue Methode durch Reduktion von HAuCl4 mit verzweigtem Polyethylenimin in einer ionischen Flüssigkeit synthetisiert. Diese Nanopartikel wurden kovalent an eine mit Mercaptoundecansäure modifizierten Gold-Elektrode immobilisiert und dienen als Basis für die Adsorption von Sulfitoxidase adsorbiert wurde. Dadurch wurde ein schneller heterogener Elektronen-Transfer und verbesserte Elektrokatalyse erreicht. Für die Charakterisierung des verwendeten Systems eingesetzt wurden UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie. Es wurde keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins beobachtet. Der vorgeschlagene Biosensor zeigte eine schnelle steady-state Stromantwort innerhalb von 2 s, eine lineare Detektion im Bereich zwischen 0,5 und 5,4 µM Sulfit mit einer hohen Empfindlichkeit (1,85 nA µM-1). Das untersuchte System bietet bemerkenswerte Vorteile da es ermöglicht bei niedriger angelegter Spannung und bei sehr hoher Ionenstärke zu arbeiten. Aufgrund dieser Eigenschaften hat das vorgeschlagene System großes Potential für die Entwicklung von bioelektronischen Geräten und der Anwendung in realen Proben. Schließlich werden im letzten Teil der Arbeit die komplexeren Enzymen Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Maus Aldehydoxidase Homolog 1 spektro- und elektrochemisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Kofaktoren in der Proteinstruktur, wie FAD und der Molybdän Kofaktor direkt Elektronen mit einer Elektrode austauschen können, was durch einzelne Peaks im Square Wave Voltammogramm angezeigt wird. Es konnte eine zusätzliche redoxaktive Gruppe mit direktem Elektronen-Transfer nach Austausch eines Cysteins durch Serin am exponierten Eisen-Schwefel-Cluster gezeigt werden. Außerdem wurde eine vermittelte spektroelektrochemische Titration des FAD-Kofaktors in Anwesenheit von Mediatoren der Klasse der Eisen und Kobalt-Komplexe durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass FAD in R. capsulatus XDH zu einem stabilen Semichinone reduziert werden kann. Es gelang die formalen Potentiale für die zwei einzigen Elektrontransferprozesse zu bestimmen. KW - Protein Spektroelektrochemie KW - nanostrukturierte Materialien KW - Sulfitoxidase KW - Xanthindehydrogenase KW - Biosensor KW - Protein spectroelectrochemistry KW - nanostructured materials KW - sulfite oxidase KW - xanthine dehydrogenase KW - biosensor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-58131 ER - TY - JOUR A1 - Badalyan, Artavazd A1 - Dierich, Marlen A1 - Stiba, Konstanze A1 - Schwuchow, Viola A1 - Leimkühler, Silke A1 - Wollenberger, Ulla T1 - Electrical wiring of the aldehyde oxidoreductase PaoABC with a polymer containing osmium redox centers BT - biosensors for benzaldehyde and GABA JF - Biosensors N2 - Biosensors for the detection of benzaldehyde and g-aminobutyric acid (GABA) are reported using aldehyde oxidoreductase PaoABC from Escherichia coli immobilized in a polymer containing bound low potential osmium redox complexes. The electrically connected enzyme already electrooxidizes benzaldehyde at potentials below −0.15 V (vs. Ag|AgCl, 1 M KCl). The pH-dependence of benzaldehyde oxidation can be strongly influenced by the ionic strength. The effect is similar with the soluble osmium redox complex and therefore indicates a clear electrostatic effect on the bioelectrocatalytic efficiency of PaoABC in the osmium containing redox polymer. At lower ionic strength, the pH-optimum is high and can be switched to low pH-values at high ionic strength. This offers biosensing at high and low pH-values. A “reagentless” biosensor has been formed with enzyme wired onto a screen-printed electrode in a flow cell device. The response time to addition of benzaldehyde is 30 s, and the measuring range is between 10–150 µM and the detection limit of 5 µM (signal to noise ratio 3:1) of benzaldehyde. The relative standard deviation in a series (n = 13) for 200 µM benzaldehyde is 1.9%. For the biosensor, a response to succinic semialdehyde was also identified. Based on this response and the ability to work at high pH a biosensor for GABA is proposed by coimmobilizing GABA-aminotransferase (GABA-T) and PaoABC in the osmium containing redox polymer. KW - redox polymer KW - aldehyde oxidoreductase KW - ionic strength KW - benzaldehyde KW - GABA KW - biosensor Y1 - 2014 U6 - https://doi.org/10.3390/bios4040403 VL - 4 IS - 4 SP - 403 EP - 421 PB - MDPI CY - Basel ER - TY - GEN A1 - Badalyan, Artavazd A1 - Dierich, Marlen A1 - Stiba, Konstanze A1 - Schwuchow, Viola A1 - Leimkühler, Silke A1 - Wollenberger, Ulla T1 - Electrical wiring of the aldehyde oxidoreductase PaoABC with a polymer containing osmium redox centers BT - biosensors for benzaldehyde and GABA T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Biosensors for the detection of benzaldehyde and g-aminobutyric acid (GABA) are reported using aldehyde oxidoreductase PaoABC from Escherichia coli immobilized in a polymer containing bound low potential osmium redox complexes. The electrically connected enzyme already electrooxidizes benzaldehyde at potentials below −0.15 V (vs. Ag|AgCl, 1 M KCl). The pH-dependence of benzaldehyde oxidation can be strongly influenced by the ionic strength. The effect is similar with the soluble osmium redox complex and therefore indicates a clear electrostatic effect on the bioelectrocatalytic efficiency of PaoABC in the osmium containing redox polymer. At lower ionic strength, the pH-optimum is high and can be switched to low pH-values at high ionic strength. This offers biosensing at high and low pH-values. A “reagentless” biosensor has been formed with enzyme wired onto a screen-printed electrode in a flow cell device. The response time to addition of benzaldehyde is 30 s, and the measuring range is between 10–150 µM and the detection limit of 5 µM (signal to noise ratio 3:1) of benzaldehyde. The relative standard deviation in a series (n = 13) for 200 µM benzaldehyde is 1.9%. For the biosensor, a response to succinic semialdehyde was also identified. Based on this response and the ability to work at high pH a biosensor for GABA is proposed by coimmobilizing GABA-aminotransferase (GABA-T) and PaoABC in the osmium containing redox polymer. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1082 KW - redox polymer KW - aldehyde oxidoreductase KW - ionic strength KW - benzaldehyde KW - GABA KW - biosensor Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-475070 SN - 1866-8372 IS - 1082 ER - TY - JOUR A1 - Cywinski, Piotr J. A1 - Hammann, Tommy A1 - Huehn, Dominik A1 - Parak, Wolfgang J. A1 - Hildebrandt, Niko A1 - Löhmannsröben, Hans-Gerd T1 - Europium-quantum dot nanobioconjugates as luminescent probes for time-gated biosensing JF - Journal of biomedical optics N2 - Nanobioconjugates have been synthesized using cadmium selenide quantum dots (QDs), europium complexes (EuCs), and biotin. In those conjugates, long-lived photoluminescence (PL) is provided by the europium complexes, which efficiently transfer energy via Forster resonance energy transfer (FRET) to the QDs in close spatial proximity. As a result, the conjugates have a PL emission spectrum characteristic for QDs combined with the long PL decay time characteristic for EuCs. The nanobioconjugates synthesis strategy and photo-physical properties are described as well as their performance in a time-resolved streptavidin-biotin PL assay. In order to prepare the QD-EuC-biotin conjugates, first an amphiphilic polymer has been functionalized with the EuC and biotin. Then, the polymer has been brought onto the surface of the QDs (either QD655 or QD705) to provide functionality and to make the QDs water dispersible. Due to a short distance between EuC and QD, an efficient FRET can be observed. Additionally, the QD-EuC-biotin conjugates' functionality has been demonstrated in a PL assay yielding good signal discrimination, both from autofluorescence and directly excited QDs. These newly designed QD-EuC-biotin conjugates expand the class of highly sensitive tools for bioanalytical optical detection methods for diagnostic and imaging applications. (C) 2014 Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers (SPIE) KW - quantum dots KW - europium complex KW - amphiphilic polymer assembly KW - nanobioconjugate KW - biosensor KW - time-resolved fluorescence Y1 - 2014 U6 - https://doi.org/10.1117/1.JBO.19.10.101506 SN - 1083-3668 SN - 1560-2281 VL - 19 IS - 10 PB - SPIE CY - Bellingham ER - TY - THES A1 - Memczak, Henry T1 - Entwicklung influenzabindender Peptide für die Biosensorik T1 - Engineering of influenza-binding peptides for biosensing N2 - Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar. N2 - The influenza virus infects mammals and birds. The first step of the infection cycle comprises the attachment of the viral surface protein hemagglutinin (HA) on glycan structures on epithelial cells within the respiratory tract of the host organism. Starting from the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain of a monoclonal hemagglutinin-binding antibody three linear peptides were derived. The binding properties of these peptides was characterized experimentally using surface plasmon resonance spectroscopy. In accordance with accompanying molecular dynamics simulation it was shown, that two of the three peptides (PeB and PeC) were able to bind the influenza virus of the strain X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) comparably to the antibody itself. The interaction of peptide PeB, which was supposed to bind to the conserved receptor binding site at the HA, was then characterized more in detail. The detection of influenza viruses was achieved within the diagnostically relevant concentration range using defined immobilization conditions. The specificity of the peptide-virus-binding was proven by appropriate control experiments. Additionally, peptide PeB was able to inhibit the binding of X31 viruses to mimics of its natural receptor. Furthermore the structure-activity-relationship within all the amino acids of peptide PeB was characterized using a full substitutional analysis in a microarray format. This led to improved peptidic variants, which were able to bind different influenza serotypes and inhibit the influenza infection in vitro. The found peptides and their variants can now be used as receptor molecules in biosensors and also represent potential drug candidates. KW - Influenza KW - Peptid KW - Biosensor KW - Virus KW - Interaktionsstudie KW - influenza KW - peptide KW - biosensor KW - virus KW - interaction analysis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72470 ER - TY - JOUR A1 - Hovestaedt, Marc A1 - Memczak, Henry A1 - Pleiner, Dennis A1 - Zhang, Xin A1 - Rappich, Joerg A1 - Bier, Frank Fabian A1 - Stöcklein, Walter F. M. T1 - Characterization of a new maleimido functionalization of gold for surface plasmon resonance spectroscopy JF - Journal of molecular recognition : an international journal devoted to research on specific molecular recognition in chemistry, biology, biotechnology and medicine N2 - Para-maleimidophenyl (p-MP) modified gold surfaces have been prepared by one-step electrochemical deposition and used in surface plasmon resonance (SPR) studies. Therefore, a FITC mimotope peptide (MP1, 12 aa), a human mucin 1 epitope peptide (MUC, 9 aa) and a protein with their specific antibodies were used as model systems. The peptides were modified with an N-terminal cysteine for covalent and directed coupling to the maleimido functionalized surface by means of Michael addition. The coupling yield of the peptide, the binding characteristics of antibody and the unspecific adsorption of the analytes were investigated. The results expand the spectrum of biosensors usable with p-MP by widely used SPR and support its potential to be versatile for several electrochemical and optical biosensors. This allows the combination of an electrochemical and optical read-out for a broad variety of biomolecular interactions on the same chip. Copyright (c) 2014 John Wiley & Sons, Ltd. KW - biosensor KW - surface plasmon resonance KW - diazonium coupling KW - maleimidophenyl KW - cys-peptide KW - aryl diazonium salts Y1 - 2014 U6 - https://doi.org/10.1002/jmr.2396 SN - 0952-3499 SN - 1099-1352 VL - 27 IS - 12 SP - 707 EP - 713 PB - Wiley-Blackwell CY - Hoboken ER - TY - THES A1 - Wettstein, Christoph T1 - Cytochrome c-DNA and cytochrome c-enzyme interactions for the construction of analytical signal chains N2 - Electron transfer (ET) reactions play a crucial role in the metabolic pathways of all organisms. In biotechnological approaches, the redox properties of the protein cytochrome c (cyt c), which acts as an electron shuttle in the respiratory chain, was utilized to engineer ET chains on electrode surfaces. With the help of the biopolymer DNA, the redox protein assembles into electro active multilayer (ML) systems, providing a biocompatible matrix for the entrapment of proteins. In this study the characteristics of the cyt c and DNA interaction were defined on the molecular level for the first time and the binding sites of DNA on cyt c were identified. Persistent cyt c/DNA complexes were formed in solution under the assembly conditions of ML architectures, i.e. pH 5.0 and low ionic strength. At pH 7.0, no agglomerates were formed, permitting the characterization of the NMR spectroscopy. Using transverse relaxation-optimized spectroscopy (TROSY)-heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiments, DNAs’ binding sites on the protein were identified. In particular, negatively charged AA residues, which are known interaction sites in cyt c/protein binding were identified as the main contact points of cyt c and DNA. Moreover, the sophisticated task of arranging proteins on electrode surfaces to create functional ET chains was addressed. Therefore, two different enzyme types, the flavin dependent fructose dehydrogenase (FDH) and the pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), were tested as reaction partners of freely diffusing cyt c and cyt c immobilized on electrodes in mono- and MLs. The characterisation of the ET processes was performed by means of electrochemistry and the protein deposition was monitored by microgravimetric measurements. FDH and PQQ-GDH were found to be generally suitable for combination with the cyt c/DNA ML system, since both enzymes interact with cyt c in solution and in the immobilized state. The immobilization of FDH and cyt c was achieved with the enzyme on top of a cyt c monolayer electrode without the help of a polyelectrolyte. Combining FDH with the cyt c/DNA ML system did not succeed, yet. However, the basic conditions for this protein-protein interaction were defined. PQQ-GDH was successfully coupled with the ML system, demonstrating that that the cyt c/DNA ML system provides a suitable interface for enzymes and that the creation of signal chains, based on the idea of co-immobilized proteins is feasible. Future work may be directed to the investigation of cyt c/DNA interaction under the precise conditions of ML assembly. Therefore, solid state NMR or X-ray crystallography may be required. Based on the results of this study, the combination of FDH with the ML system should be addressed. Moreover, alternative types of enzymes may be tested as catalytic component of the ML assembly, aiming on the development of innovative biosensor applications. N2 - In den Energiegewinnungsprozessen der Zellen spielen biochemische Reaktion, die auf Elektronentransfer (ET) basieren, eine wichtige Rolle. So sind die Proteinkomplexe der Atmungskette, welche an der inneren Membran der Mitochondrien abläuft, über eine ET-Kette miteinander verbunden. In biotechnologischen Anwendungen wird dieses Phänomen genutzt um Proteine auf der Oberfläche von Elektroden als funktionierende ET-Ketten zu arrangieren. Dabei kann der ET innerhalb dieser Kaskaden als elektrischer Strom gemessen und als Signal betrachtet werden. Dies ermöglicht die Anwendung von proteinmodifizierten Elektroden als Biosensoren und Biobrennstoffzellen. Ein geeigneter Baustein für den Aufbau vielschichtiger ET-Systeme ist das kleine, eisenhaltige Protein Cytochrom c (Cyt c), welches in der Lage ist Elektronen aufzunehmen, zu transportieren und wieder abzugeben. Als zweiter Baustein dient das lange, fadenartige Biomolekül DNA. DNA und Cyt c interagieren unter bestimmten Bedingungen aufgrund ihrer entgegengesetzten Oberflächenladungen. Dies ermöglicht den schichtweisen Aufbau stabiler Cyt c/DNA-Multischichten (MS) auf Elektrodenoberflächen, welche durch die sogenannte Layer-by-Layer (LbL) Technik aufgebaut werden. In diesen MS Systemen behält Cyt c trotz der Immobilisierung seine Beweglichkeit um die eigene Achse, wodurch der Selbstaustausch von Elektronen zwischen den Cyt c Molekülen sowie der ET zur Elektrode gewährleistet wird. Der molekulare Aufbau der Cyt c/DNA MS sowie die Interaktion zwischen den zwei biologischen Bausteine ist weitgehend unerforscht, daher wurden in der vorliegenden Studie die genauen Bedingungen der Cyt c/DNA Interaktion in Lösung untersucht. Außerdem wird die Eignung des MS Systems zur Einbettung von Enzymen getestet. Die Bausteine des MS-Systems, Cyt c und DNA bilden in Lösung stabile Komplexe unter den Assemblierungsbedingungen der MS (d.h. pH 5.0 und geringe Salzkonzentration). Im Vergleich dazu tritt bei pH 7.0 eine schwächere Interaktion auf, die für eine Komplexbildung nicht ausreicht. Dies ermöglicht die Untersuchung der Interaktion mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR, engl. nuclear magnetic resonance spectroscopy), wobei die Interaktionsstellen des DNA-Moleküls auf Cyt c bestimmt werden. Im Vergleich zu pH 7.0 wird im leicht sauren pH-Bereich (6.0) eine erhöhte Anzahl an Interaktionspunkten gefunden, was Rückschlüsse auf eine erhöhte Interaktion zulässt. Dies resultiert schließlich in der starken Bindung bei pH 5.0, die den Aufbau stabiler Cyt c/DNA-MS auf Elektrodenoberflächen ermöglicht. Darüber hinaus spielen der Salzgehalt der Lösung sowie das Konzentrationsverhältnis von Cyt c und DNA eine wichtige Rolle. Auf der Grundlage des Cyt c/DNA-MS Aufbaus sollte durch die Kopplung eines Enzymes eine Signalkette mit sensorischen Eigenschaften geschaffen werden. Das Enzym dient dabei als Erkennungselement für bestimmte Moleküle in Lösung. Durch die Reaktion des Enzyms mit dem Molekül wird ein bioelektrisches Signal generiert, das durch elektrochemische Methoden gemessen wird. Dies wurde mit zwei verschiedenen Enzymen, der Glukose Dehydrogenase (GDH) und der Fruktose Dehydrogenase (FDH), untersucht. Beide Enzyme waren in der Lage mit einer Cyt c Monoschicht zu kommunizieren und konnten mit dem redox Protein auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert werden. GDH konnte erfolgreich mit dem Cyt c/DNA-MS System gekoppelt und die Sensoreigenschaften der so aufgebauten Elektronentransferkette charakterisiert werden. Zusammenfassend charakterisiert diese Arbeit die Bedingungen der Cyt c/DNA-Komplexbildung und gibt einen Einblick in die bisher unbekannte Interaktion zwischen Cyt c und DNA auf der molekularen Ebene. Darüber hinaus wird die Nutzbarkeit des Cyt c/DNA MS Systems zur Einbettung von Enzymen am Beispiel der GDH gezeigt und schafft somit die Grundlage für das bessere Verständnis von ET Reaktionen zwischen Proteinen auf Elektrodenoberflächen. T2 - Cytochrom c-DNA und Cytochrom c-Enzym Interaktion für den Aufbau analytischer Signalketten KW - biosensor KW - protein KW - DNA KW - enzyme KW - interaction KW - DNA KW - Biosensor KW - Enzym KW - Interaktion KW - Protein Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78367 ER -