TY - THES A1 - Freiberg, Alexander T1 - Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilität und Faltung eines Solenoidproteins T1 - The leucine-rich repeat from internalin B : stability and folding of a solenoid protein N2 - Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können. N2 -

To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB241) from the bacterium Listeria monocytogenes was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB321) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.

A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB241 and InlB321 allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB321 resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the m-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability in vivo without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.

Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.

The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution. KW - Proteinfaltung KW - thermodynamische Stabilität KW - Leucine-Rich Repeat KW - Internalin B KW - Zweizustandsmodell KW - leucine-rich repeat KW - internalin B KW - thermodynamic stability KW - protein folding KW - two-state model Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532 ER - TY - THES A1 - Fiedler, Christian T1 - Die Strukturbildung der beta-Helix in der Pektatlyase Pel-15 T1 - The structure formation of the beta-helix in the pectate lyase Pel-15 N2 - Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminosäuren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturonsäurederivate in einem Ca2+-abhängigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einsträngigen, rechtsgängigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enthält jede Windung drei β-Stränge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 übereinander und bilden entlang der Helixachse flächige, parallele β-Faltblätter aus. Im Bereich dieser β-Faltblätter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden Lösungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgeprägt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix über Salzbrücken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivität und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolutionär konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zuständen HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zustände sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In Rückfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 % der faltenden Moleküle den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabhängigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung“ stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite“ der Aktivierungsbarriere und trägt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht länger nachweisbar ist. Entgegen anfänglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolutionär konservierten Disulfidbrücke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbrücke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, lässt die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Veränderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinität bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivitätstests für VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivität um fast 50 % an. Die evolutionär konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbrücke im Besonderen müssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl für die Struktur des katalytischen Zentrums als auch für die Strukturbildung der β-Helix während der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die für andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber prädestinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilität ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilität und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Auflösung zu studieren, die aufgrund der Komplexität bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verfügung stand. N2 - Pectate lyase Pel-15 was isolated from alcaliphlic Bacillus spec. strain KSM-P15. Like all pectate lyases Pel-15 binds and subsequently cleaves polygalacturonic acid, the main pectic compound in plant cell walls and middle lamellae, in a Ca2+ dependent beta-elimination reaction. With 197 amino acids and a molecular mass of only 21 kDa the protein is one of the smallest right-handed parallel beta-helical proteins known today. Polypeptide chains that are classified into this structural family adopt super-helical folds in which each “solenoid stack” consists of three beta-structured regions that are connected by flexible turn segments. Along its longitudinal axis the right-handed parallel beta-helix thus comprises three elongated parallel beta-sheets that are stabilized by an extensive network of hydrogen bonds wrapping around the densely packed hydrophobic core. Together with the shield-like arrangement of hydrogen bonds this hydrophobic core is considered as the main contributor to an exceptionally high stability that is a common feature of all beta-helical proteins. In contrast to most right-handed parallel beta-helices, Pel-15 is devoid of any terminal capping domains and laterally associated secondary structure. Therefore, this protein is considered to be a promising model protein of a pure beta-helix which will help to understand the determinants of both parallel beta-sheet formation and stability. In the dissertation at hand optical spectroscopic methods were used to assess the enzymatic activity, the folding/unfolding equilibrium and the kinetic mechanism of structure formation in neutral buffered solutions. Results indicate that Pel-15 populates a hyper-fluorescent equilibrium intermediate (HF) that is effectively populated in presence of the denaturing agent guanidinium hydrochloride (GdmCl). According to kinetic folding and unfolding experiments HF is not only an essential on-pathway intermediate but has to be considered as a conformational ensemble in which several hyperfluorescent states are in thermodynamic equilibrium with each other. According to their existence in kinetic folding trajectories these different HF-species were termed HFslow and HFfast. The activation energy between both states is remarkably high leading to a time constant of about 100 seconds for the reaction HFslow ⇆ HFfast. Since native Pel-15 contains an energetically disfavoured cis-prolyl peptide between A59 and P60 it is proposed that HFslow and HFfast differ in their prolyl peptide conformations. Two main results emerge from this dissertation. First, an extensive study of the Pel-15 folding- and unfolding behaviour facilitated the proposal of a “minimal folding model”. According to this model the HF-states and the according denatured species Uslow and Ufast are aligned into a thermodynamic circle. This implies that unfolded polypeptide chains reach the HF-ensemble via parallel folding trajectories. Since the native conformation N together with HFfast are on the same side of the activation barrier, it is the reaction HFslow ⇆ HFfast that is the rate limiting step in the folding reaction of Pel-15. Second, the importance of an evolutionarily conserved disulfide bond in the central region of Pel-15 was tested by site directed mutagenesis and subsequent spectroscopic characterization. The exchange of the disulfide against a hydrophobic pair of alanine and valine decreases the folding free energy by about 10 kJ/mol. Although this value is unexpectedly high, structural perturbations around both mutational positions are small as was deduced from X-Ray crystallography. Interestingly, the stability decrease is accompanied by a major loss of enzymatic activity while the Ca2+ binding affinity is not significantly affected. It is therefore concluded that the allosterically relevant disulfide bond stabilizes long-range interactions that stabilize several adjacent solenoid turns near the N-terminus of the protein. Indeed, planar stacking interactions are perturbed and flexibility of N-terminal loops is increased once the disulfide bond is removed. This dissertation establishes Pel-15 as a novel beta-helical model protein and – even more important – smoothes the way for a generally accepted perspective on the formation and stability of parallel beta-sheet proteins. KW - Rechtsgängige parallele beta-Helix KW - Pektatlyase KW - thermodynamische Stabilität KW - Dreizustandsmodell KW - right-handed parallel beta-helix KW - thermodynamic stability KW - protein folding KW - pectate lyase KW - three-state model Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-47250 ER - TY - THES A1 - Becker, Marion T1 - Bedeutung eines hydrophoben Seitenkettenstapels für Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins T1 - Importance of a hydrophobic side chain stack for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein N2 - Das homotrimere Tailspikeadhäsin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilität in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedomäne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdomäne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Stränge, die durch turns und loops unterschiedlicher Länge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenförmigen Aufbau formen beta-Stränge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltblätter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet größtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelmäßig entlang der Längsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltblätter und die regelmäßige Anordnung von ähnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilität des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das voluminösere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verkürzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin stärkere Effekte auslösen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis für Stabilität und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgelöster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte Änderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass mögliche Kavitäten gefüllt und sterische Spannung abgebaut werden können. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsphänotyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerhöhung waren die Ausbeuten des N‑terminal verkürzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterführende Experimente zeigten, dass der tsf‑Phänotyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilität des nativen Trimers ausgelöst wurde. Durch Untersuchungen am vollständigen und am N‑terminal verkürzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verläufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungsäste im Chevronplot die Abhängigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gewölbt. Dieses Verhalten könnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten Übergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne, bei der die N‑terminale Capsidbindedomäne und die C‑terminale Trimerisierungsdomäne deletiert sind und welche als unabhängige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativitäten folgen. Die konformationellen Stabilitäten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, während Mutationen in äußeren Bereichen der Domäne keinen Einfluss auf die Stabilität der beta-Helix haben. Bei Verlängerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im Übergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem für die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr ähnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „Rückenflosse“ beinhaltet, stabilitätsbestimmend. Dieser Kern könnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung“ kompaktieren. N2 - The homotrimeric tailspike adhesin of bacteriophage P22 is a widely used model system for studying different aspects of multi-domain protein folding, assembly and stability, both in vivo and in vitro. The central domain of the tailspike protein is a 13-turn right-handed parallel beta-helix, flanked by an N-terminal capsid-binding domain and a C-terminal trimerization domain. In the beta-helix motif the polypeptide backbone winds up to form a right-handed helix, with each coil consisting of three short beta-strands connected by turns and loops of varying lengths. Due to this repetitive and solenoidal structure, beta-strands of adjacent coils participate in building up three elongated beta-sheets. The internal lumen of the beta-helix is tightly packed and contains mostly hydrophobic side-chains, which are stacked along the helical axis in a linear and very regular manner. A highly repetitive structure, elongated beta-sheets and stacking of similar or identical side chains along the beta-sheet axis are also typical characteristics of amyloid fibrils, which are associated with protein folding diseases such as Alzheimer’s disease, Creutzfeldt-Jacob disease, Huntington’s disease and type II diabetes. It is assumed that the high stability of both, the tailspike protein and amyloid fibrils, is determined by side chain stacking, a well‑ordered network of H-bonds and the rigid, oligomeric state. To systematically investigate the influence of side chain stacking for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein, a hydrophobic stack located in the lumen of the beta-helix domain was subjected to site-directed mutagenesis. Each of seven valine residues, distributed over the whole length of the beta-helix domain, was substituted by the smaller and less hydrophobic alanine and the bulkier leucine. The influence of these substitutions was investigated with the help of two tailspike protein constructs, namely the N-terminally shortened TSPdeltaN construct and the isolated, monomeric BHX construct. In general, almost all experiments showed that alanine mutations cause a stronger effect than leucine mutations, which demonstrates that the tight and hydrophobic packing in the lumen of the beta-helix domain is the basis for stability and folding of the tailspike protein. High-resolution crystal structures of two alanine and two leucine mutants revealed that the parallel beta-helix motif shows considerable plasticity. Small and local adjustments of side chains and the polypeptide backbone compensate for changes induced by the mutations, herewith potential cavities are filled and steric strain is released. Compared to the wild type, many mutations lead to a temperature sensitive for folding (tsf) phenotype in vivo and in vitro, i.e. mutations reduce folding yields of TSPdeltaN at high temperatures, but had little effect at low temperatures. Our experiments have elucidated that the tsf phenotype was caused either by an impact on different stages of the maturation process or by a reduction of the kinetic stability of the native trimer. Using TSPdeltaN and the complete wild type protein, it was shown that the tailspike trimer unfolds in a complex manner. Although unfolding kinetics exhibit a two-state behaviour, analysis of the apparent rate constants of unfolding in a Chevron plot revealed their non-linear denaturant-dependence. Typically, the natural logarithm of the apparent rate constants depend linearly on the denaturant concentration. However, in case of TSPdeltaN and the complete wild type protein, unfolding branches of the Chevron plot are curved. Such a behaviour could arise from a high energy intermediate on the unfolding pathway, a broad activation barrier or parallel unfolding pathways. The monomeric BHX construct lacks both the N-terminal and C-terminal domain. It folds into a conformation very similar to that of the -helix domain in the tailspike trimer and acts as an independent folding unit. Unfolding and refolding equilibrium transitions of mutant and wild type BHX constructs are reversible and follow a two-state behaviour with comparable cooperativities. However, conformational stabilities of alanine and leucine mutations located in the central part of the beta-helix domain are highly reduced, whereas mutations at the ends of the domain show a wild type-like stability. Furthermore, these destabilizing mutations tend to form aggregates around the transition midpoint when equilibrium experiments were incubated for longer time periods. Taken together, the results suggest that the structure of the isolated beta-helix seems to be similar to an essential, monomeric intermediate during tailspike folding. In this intermediate, a central core including coils 4 to 7 and the dorsal fin determines the stability of the whole folding unit. This core may act as a nucleus on which beta-helix coils can associate in a sequential manner and compact during maturation of the monomer. KW - P22 Tailspikeprotein KW - Seitenkettenstapel KW - beta-Solenoidproteine KW - Proteinfaltung KW - thermodynamische Stabilität KW - P22 tailspike protein KW - side chain stacking KW - beta-solenoid proteins KW - protein folding KW - thermodynamic stability Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-42674 ER - TY - THES A1 - Baumgart, Natalie T1 - Faltungseigenschaften des extrazellulären Proteins Internalin J und seine Cysteinleiter T1 - Folding of the extracellular protein Internalin J and the cysteine ladder N2 - Internalin J (InlJ) gehört zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Domäne von InlJ ist aus 15 regelmäßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminosäuren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungewöhnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die Häufigkeit von Cysteinen in InlJ ist für ein extrazelluläres Protein von L. monocytogenes außergewöhnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquitären Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilität und Faltung nicht äquivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilitätsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine näher beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zugänglich ist. Die thermodynamische Stabilität wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments möglich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts“ Prinzip folgt. Die Gültigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung bestätigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilität von InlJ geht mit hoher Kooperativität einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativität hauptsächlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberflächenänderung während der Faltung bereits zum größten Teil erfolgt ist, bevor der Übergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen über den Übergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im Übergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilität und ein stark-kooperatives Verhalten für das extrazelluläre Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse könnten wichtige Beiträge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet. N2 - Internalin J (InlJ) is a member of the family of bacterial cysteine-containing leucine-rich repeat (LRR) proteins. Internalins are invasion-associated surface proteins of Listeria monocytogenes. The LRR domain of InlJ consists of 15 repeating units, which are arranged in tandem. The consensus sequence consists of 21 residues. Interestingly, a leucine residue which is highly conserved among the Internalins is replaced by cysteine. This results in a continuous cysteine ladder of 12 repeats. This frequency of cysteines is remarkable for an extracellular protein of L. monocytogenes. Stability and folding of repeat proteins are not equivalently studied considering their ubiquitous distribution in nature. Their modular structure results in simple topology and is dominated by short-range interactions. These characteristic features of repeat proteins facilitate the separation and identification of stabilizing interactions, making repeat proteins to ideal model systems for folding studies. In this work the folding and unfolding of InlJ has been extensively characterized, shedding light on the relevance of the cysteines. Two tryptophans located in the N- and C-terminus allowed monitoring the folding state of the entire protein via fluorescence. Thermodynamic stability was therefore derived by guanidinium chloride induced equilibrium experiments. Furthermore, the chemically induced unfolding and folding reactions were characterized with respect to their kinetics. Interrupted refolding experiments were essential for tracking the productive folding reaction of InlJ. Analysis of the kinetic and equilibrium data leads to the conclusion that the results are compatible with a two-state model. The study presented here reveals high stability of the protein InlJ in conjunction with high cooperativity. Kinetic data disclosed the origin of high cooperativity in the folding reaction; with a Tanford value of about 0.93. This high value implicates that the major change of the accessible surface area occurs before the transition state is formed. Mutational studies provided more detailed structural information about the transition state. 12 of 14 cysteine residues were mutated to alanine for this purpose. The cysteines in repeats 1 to 11 stack over each other and form a ladder of reduced cysteines. The substitution of one of these cysteines has an average destabilizing effect of 4.8 kJ/mol. The deceleration of the folding reaction by the substitution shows that repeats 5 to 11 are already fully structured in the transition state, pointing to a central nucleus in the folding of the LRR-protein InlJ. The extracellular protein InlJ reveals extreme stability and high cooperativity. The insights into the folding of this LRR motif could facilitate the design of further artificial repeat proteins. KW - Internalin J KW - leucinreiches repeat-Protein KW - Proteinfaltung KW - Zweizustandsmodell KW - thermodynamische Stabilität KW - Internalin J KW - leucine-rich repeat protein KW - protein folding KW - two-state model KW - thermodynamic stability Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69603 ER -