TY  - THES
A1  - Lotkowska, Magda Ewa
T1  - Functional analysis of MYB112 transcription factor in the model plant Arabidopsis thaliana
T1  - Funktionelle Charakterisierung von MYB112 Transkriptionsfaktor aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana
N2  - Transcription factors (TFs) are ubiquitous gene expression regulators and play essential roles in almost all biological processes. This Ph.D. project is primarily focused on the functional characterisation of MYB112 - a member of the R2R3-MYB TF family from the model plant Arabidopsis thaliana. This gene was selected due to its increased expression during senescence based on previous qRT-PCR expression profiling experiments of 1880 TFs in Arabidopsis leaves at three developmental stages (15 mm leaf, 30 mm leaf and 20% yellowing leaf). MYB112 promoter GUS fusion lines were generated to further investigate the expression pattern of MYB112. Employing transgenic approaches in combination with metabolomics and transcriptomics we demonstrate that MYB112 exerts a major role in regulation of plant flavonoid metabolism. We report enhanced and impaired anthocyanin accumulation in MYB112 overexpressors and MYB112-deficient mutants, respectively. Expression profiling reveals that MYB112 acts as a positive regulator of the transcription factor PAP1 leading to increased anthocyanin biosynthesis, and as a negative regulator of MYB12 and MYB111, which both control flavonol biosynthesis. We also identify MYB112 early responsive genes using a combination of several approaches. These include gene expression profiling (Affymetrix ATH1 micro-arrays and qRT-PCR) and transactivation assays in leaf mesophyll cell protoplasts. We show that MYB112 binds to an 8-bp DNA fragment containing the core sequence (A/T/G)(A/C)CC(A/T)(A/G/T)(A/C)(T/C). By electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and chromatin immunoprecipitation coupled to qPCR (ChIP-qPCR) we demonstrate that MYB112 binds in vitro and in vivo to MYB7 and MYB32 promoters revealing them as direct downstream target genes. MYB TFs were previously reported to play an important role in controlling flavonoid biosynthesis in plants. Many factors acting upstream of the anthocyanin biosynthesis pathway show enhanced expression levels during nitrogen limitation, or elevated sucrose content. In addition to the mentioned conditions, other environmental parameters including salinity or high light stress may trigger anthocyanin accumulation. In contrast to several other MYB TFs affecting anthocyanin biosynthesis pathway genes, MYB112 expression is not controlled by nitrogen limitation, or carbon excess, but rather is stimulated by salinity and high light stress. Thus, MYB112 constitutes a previously uncharacterised regulatory factor that modifies anthocyanin accumulation under conditions of abiotic stress.
N2  - Transkriptionsfaktoren (TFs) sind ubiquitäre Regulatoren der Genexpression und spielen eine essentielle Rolle in nahezu allen biologischen Prozessen. Diese Doktorarbeit hat vor allem die funktionelle Charakterisierung von MYB112 zum Thema, einem Mitglied der R2R3-MYB-TF-Familie aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Ausgesucht wurde das Gen aufgrund seiner erhöhten Expression in seneszenten Blättern, basierend auf vorangegangenen qRT-PCR Expressions-Profiling Experimenten für 1880 TFs in Arabidopsis Blättern aus drei Entwicklungsstadien (15 mm Blatt, 30 mm Blatt und 20 % vergilbtes Blatt). MYB112-Promotor-GUS-Fusionslinien wurden generiert um das Expressionsmuster von MYB112 detailliert zu untersuchen. Unter Zuhilfenahme transgener Ansätze in Kombination mit Metabolomics und Transcriptomics können wir zeigen, dass MYB112 eine wichtige Rolle in der Regulation des pflanzlichen Flavonoid-Metabolismus spielt. In MYB112 Überexpressoren und MYB112-defizienten Mutanten kommt es zu erhöhter bzw. verminderter Anthocyanin-Akkumulation. Expressions-Profiling zeigt, dass MYB112 einerseits als ein positiver Regulator des Transkriptionsfaktors PAP1 fungiert, was zu einer erhöhten Anthocyanin-Biosynthese führt, andererseits als negativer Regulator von MYB12 und MYB111 auftritt, welche beide die Flavonol-Biosynthese kontrollieren. Wir haben früh auf MYB112 reagierende Gene durch eine Kombination verschiedener Ansätze identifiziert. Diese umfassen Genexpressions-Profiling (Affymetrix ATH1 Microarrays und qRT-PCR) und Transaktivierungs-Experimente in Mesophyll-Protoplasten aus Blättern. Wir zeigen, dass MYB112 an eine 8-bp DNA-Fragment, welches die Kernsequenz (A/T/G)(A/C)CC(A/T)(A/G/T)(A/C)(T/C) aufweist. Mit Hilfe von Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und Chromatin-Immunopräzipitation gekoppelt mit qPCR (ChIP-qPCR) zeigen wir, dass MYB112 in vitro und in vivo an die Promotoren von MYB7 und MYB32 bindet was sie damit als direkte Zielgene von MYB112 identifiziert. Es wurde bereits gezeigt, dass MYB TFs eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese in Pflanzen haben. Viele Faktoren, die oberhalb des Anthocyanin-Biosyntheseweges agieren, werden bei Stickstofflimitierung oder erhöhter Saccharose-Konzentration auch verstärkt exprimiert. Außer den erwähnten Bedingungen können auch andere Umweltparameter, wie z. B. erhöhter Salzgehalt und Starklicht zu erhöhter Expression führen. Im Gegensatz jedoch zu einigen anderen MYB TFs, die einen Einfluss auf Gene des Anthocyanin-Biosyntheseweges ausüben, ist die Expression von MYB112 nicht durch Stickstoff-Limitierung oder Kohlenstoffüberfluss kontrolliert, sondern wird durch erhöhten Salzgehalt sowie Starklicht stimuliert. Somit ist MYB112 ein neuer Regulator, der eine Anthocyanin-Akkumulation unter abiotischen Stressbedingungen kontrolliert.
KW  - Transkriptionsfaktoren
KW  - Flavonoid-Metabolismus
KW  - Stress
KW  - Transaktivierungs-Experimente
KW  - Chromatin-Immunopräzipitation
KW  - transcription factors
KW  - flavonoid biosynthesis
KW  - stress
KW  - transactivation assay
KW  - chromatin immunoprecipitation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-72131
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bortfeld, Silvia
T1  - Analysis of Medicago truncatula transcription factors involved in the arbuscular mycorrhizal symbiosis
T1  - Analyse von Medicago truncatula Transkriptionsfaktoren, die während der arbuskulären Mykorrhiz-Symbiose eine Rolle spielen
N2  - For the first time the transcriptional reprogramming of distinct root cortex cells during the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis was investigated by combining Laser Capture Mirodissection and Affymetrix GeneChip® Medicago genome array hybridization. The establishment of cryosections facilitated the isolation of high quality RNA in sufficient amounts from three different cortical cell types. The transcript profiles of arbuscule-containing cells (arb cells), non-arbuscule-containing cells (nac cells) of Rhizophagus irregularis inoculated Medicago truncatula roots and cortex cells of non-inoculated roots (cor) were successfully explored. The data gave new insights in the symbiosis-related cellular reorganization processes and indicated that already nac cells seem to be prepared for the upcoming fungal colonization. The mycorrhizal- and phosphate-dependent transcription of a GRAS TF family member (MtGras8) was detected in arb cells and mycorrhizal roots. MtGRAS shares a high sequence similarity to a GRAS TF suggested to be involved in the fungal colonization processes (MtRAM1). The function of MtGras8 was unraveled upon RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing. An AM symbiosis-dependent expression of a RNAi construct (MtPt4pro::gras8-RNAi) revealed a successful gene silencing of MtGras8 leading to a reduced arbuscule abundance and a higher proportion of deformed arbuscules in root with reduced transcript levels. Accordingly, MtGras8 might control the arbuscule development and life-time. The targeting of MtGras8 by the phosphate-dependent regulated miRNA5204* was discovered previously (Devers et al., 2011). Since miRNA5204* is known to be affected by phosphate, the posttranscriptional regulation might represent a link between phosphate signaling and arbuscule development. In this work, the posttranscriptional regulation was confirmed by mis-expression of miRNA5204* in M. truncatula roots. The miRNA-mediated gene silencing affects the MtGras8 transcript abundance only in the first two weeks of the AM symbiosis and the mis-expression lines seem to mimic the phenotype of MtGras8-RNAi lines. Additionally, MtGRAS8 seems to form heterodimers with NSP2 and RAM1, which are known to be key regulators of the fungal colonization process (Hirsch et al., 2009; Gobbato et al., 2012). These data indicate that MtGras8 and miRNA5204* are linked to the sym pathway and regulate the arbuscule development in phosphate-dependent manner.
N2  - Die Leguminose Medicago truncatula (gehört zur Gattung des Schneckenklees) ist in der Lage sowohl eine Symbiose mit stickstofffixierenden Bakterien (Rhizobien), als auch mit Mykorrhiza-Pilzen einzugehen. Der Mykorrhiza-Pilz Rhizophagus irregularis dringt in die Wurzelrindenzellen ein und bildet Strukturen aus, die als Arbuskeln bezeichnet werden. Diese ermöglichen den Transfer von Nährstoffen, wie Phosphat in die Wurzelzellen. Die Pflanze liefert hingegen bis zu 20 % ihrer Photosyntheseprodukte an den Pilz. Da die Lebenszeit der Arbuskeln nur wenige Tage beträgt, können Wurzelrindenzellen mehrere Arbuskeln nacheinander beherbergen. Somit können neben arbuskelhaltigen, auch nicht-arbuskelhaltige Zellen in kolonisierten Wurzeln auftreten. Die nicht-arbuskelhaltigen Zellen beeinträchtigen die Sensitivität von Genregulationsanalysen, wenn die Genregulation während der Mykorrhiza-Symbiose anhand von ganzen kolonisierten Wurzeln untersucht wird. In dieser Arbeit konnte eine Zelltyp-spezifische Analyse der Genregulation von arbuskelhaltigen und nicht-arbuskelhaltigen Zellen durchgeführt, und eine Erhöhung der Sensitivität erreicht werden. Mittels Laser Capture Microdissection wurden Zellen aus Gefrierschnitten von Wurzeln isoliert. Aus den so gewonnen Zellen konnte RNA von ausreichender Qualität und Quantität extrahiert werden, um das Transkriptom der beiden Zelltypen mittels Mikroarrayhybridisierung zu untersuchen. Transkriptionsfaktoren (TFs) spielen wahrscheinlich eine Schlüsselrolle in der Umprogrammierung von Wurzelzellen während der Mykorrhiza-Symbiose. Daher wurde die Genregulation von TF-Genen in den zwei Zelltypen gezielt untersucht. Anhand von quantitativer RT-PCR und Promoter-Reporter-Fusionen wurde die differentielle Expression von mehreren TF-Transkripten in den verschiedenen Zelltypen bestätigt. Die Charakterisierung eines potentiellen GRAS TF (MtGRAS8) konnte eine stark Symbiose- und Phosphat-abhängige Induktion von Transkripten bestätigt werden. Mutanten mit verringerter MtGras8 Transkriptmenge wiesen eine verringerte Arbuskelzahl und deformierte Arbuskeln auf. MtGras8 scheint daher an der Arbuskelentwicklung beteiligt zu sein. Vorherige Experimente zeigten, dass MtGras8 Transkripte, von der Phosphat-regulierten MikroRNA5204* geschnitten werden (Devers et al., 2011). Dies konnte durch Überexpression der MikroRNA5204* in vivo bestätigt werden. Weiterhin konnten Protein-Protein-Interaktionen von MtGras8 mit bekannten GRAS TFs (NSP1, NSP2, RAM1) nachgewiesen und daraus eine Verbindung zu bekannten Symbiose-induzierten Signalkaskaden geschlossen werden. In dieser Arbeit wurde erstmals die Umprogrammierung von nicht-arbuskelhaltigen Zellen untersucht und neue Regulationselemente für die Kontrolle der Arbuskelentwicklung, wie MtGRAS8 und MikroRNA5204*, charakterisiert.
KW  - arbuskuläre Mykorrhiza-Symbiose
KW  - Transkriptionsfaktoren
KW  - Zelltyp-spezifisch
KW  - Transkriptomanalyse
KW  - arbuscular mycorrhizal symbiosis
KW  - transcription factors
KW  - cell type-specific
KW  - transcriptome analysis
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-70664
ER  -