TY - THES A1 - Gibert, Arthur T1 - Influence of Amyloid Aggregates on the Trafficking and Signaling of GPCRs T1 - Einfluss von Amyloidaggregaten auf den Transport und die Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren N2 - The prevalence of diseases associated with misfolded proteins increases with age. When cellular defense mechanisms become limited, misfolded proteins form aggregates and may also develop more stable cross-β structures ultimately forming amyloid aggregates. Amyloid aggregates are associated with neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Huntington’s disease. The formation of amyloid deposits, their toxicity and cellular defense mechanisms have been intensively studied. However, surprisingly little is known about the effects of protein aggregates on cellular signal transduction. It is also not understood whether the presence of aggregation-prone, but still soluble proteins affect signal transduction. In this study, the still soluble aggregation-prone HttExon1Q74 and its amyloid aggregates were used to analyze the effect of amyloid aggregates on internalization and receptor activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest protein family of mammalian cell surface receptors involved in signal transduction. The aggregated HttExon1Q74, but not its soluble form, could inhibit ligand-induced clathrin-mediated endocytosis (CME) of various GPCRs. Most likely this inhibitory effect is based on a terminal sequestration of the HSC70 chaperone to the aggregates which is necessary for CME. Using the vasopressinV1a receptor (V1aR) and the corticotropin-releasing factor receptor 1 (CRF1R) as a model, it could be shown that the presence of HttExon1Q74 aggregates and the inhibition of ligand-induced CME leads to an accumulation of desensitized receptors at the plasma membrane. In turn, this disrupts Gq-mediated Ca2+ signaling and Gs-mediated cAMP signaling of the V1aR and the CRF1R respectively. In contrast to HttExon1Q74 amyloid aggregates, soluble HttExon1Q74 as well as amorphous aggregates did not inhibit GPCR internalization and signaling demonstrating that cellular signal transduction mechanisms are specifically impaired in response to the formation of amyloid aggregates. In addition, preliminary experiments could show that HttExon1Q74 aggregates provoke an increase in membrane expression of a protein from a structurally and functionally unrelated membrane protein family, namely the serotonin transporter SERT. As SERT is the main pharmacological target to treat depression this could shed light on this commonly occurring comorbidity in neurodegenerative diseases, in particular in early disease states. N2 - Die Prävalenz von Krankheiten, die mit fehlgefalteten Proteinen assoziiert sind, nimmt mit dem Alter zu. Wenn die zellulären Abwehrmechanismen weniger effizient werden, können fehlgefaltete Proteine nicht nur einfache Aggregate bilden, sondern auch stabilere Cross-β-Strukturen, die am Ende zu sogenannten Amyloidaggregaten führen können. Amyloidaggregate sind mit neurodegenerativen Erkrankungen wie z. B. der Alzheimer Erkrankung und dem Huntington-Syndrom assoziiert. Die Bildung von Amyloidablagerungen, ihre Toxizität und die zellulären Abwehrmechanismen wurden in den letzten Jahren intensiv untersucht. Über die Auswirkungen von Proteinaggregaten auf die zelluläre Signaltransduktion ist jedoch überraschend wenig bekannt. Es ist auch nicht bekannt, ob bereits das Vorhandensein von löslichen Vorstadien dieser zur Aggregation neigenden Protein, die Signaltransduktion von Zellen beeinflusst. In dieser Studie wurden Amyloidaggregate des auf dem Huntingtin-Protein basierenden Konstrukts HttExon1Q74 und seine noch löslichen Formen verwendet, um deren Wirkung auf die Internalisierung und Rezeptoraktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu analysieren. GPCR bilden die größte Proteinfamilie von Oberflächenrezeptoren in Säugerzellen und spielen eine entscheidende Rolle in der zellulären Signaltransduktion. Es konnte gezeigt werden, dass aggregiertes HttExon1Q74, aber nicht seine noch lösliche Form, die ligandeninduzierte Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) verschiedener GPCRs hemmt. Höchstwahrscheinlich beruht dieser inhibitorische Effekt auf einer Sequestrierung des HSC70-Chaperons zu den HttExon1Q74-Aggregaten. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass HSC70 die für CME notwendig ist. Unter Verwendung des VasopressinV1a-Rezeptors (V1aR) und des Corticotropin-Releasing-Faktor-Rezeptors 1 (CRF1R) als Modellproteine, konnte in dieser Arbeit ferner gezeigt werden, dass das Vorhandensein von HttExon1Q74-Aggregaten und die Hemmung der ligandeninduzierten CME zu einer Akkumulation desensibilisierter Rezeptoren in der Plasmamembran führt. Dies stört wiederum die Gq-vermittelte Ca2+-Signalisierung und die Gs-vermittelte cAMP-Signalisierung des V1aR bzw. des CRF1R. Im Gegensatz zu HttExon1Q74-Amyloidaggregaten hemmten lösliches HttExon1Q74 sowie amorphe Proteinaggregate die GPCR-Internalisierung und –Signalisierung nicht. Dies zeigt, dass Amyloidaggregate zelluläre Signaltransduktionsmechanismen spezifisch beeinträchtigen können. Darüber hinaus konnten vorläufige Experimente zeigen, dass HttExon1Q74-Aggregate eine Erhöhung der Membranexpression des Serotonintranporters SERT verursachen, eines Membranproteins das strukturell und funktionell nicht mit GPCR verwandt ist. Da SERT das wichtigste pharmakologische Zielmolekül bei der Behandlung von depressiven Syndromen ist, könnten diese Daten dazu beitragen, besser zu verstehen, warum Depressionen in sehr frühen Stadien von neurodegenerativen Erkrankungen gehäuft auftreten. KW - GPCR KW - neurodegenerative KW - disease KW - protein trafficking KW - cell signaling KW - Huntington KW - GPCR KW - Huntington KW - Zellsignalisierung KW - neurodegenerative Erkrankung KW - Proteinhandel Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-506659 ER - TY - THES A1 - Borschewski, Aljona T1 - Bedeutung der Interaktion von Calcineurin und SORLA für die Regulation des Na⁺,K⁺,2Cl⁻-Kotransporters (NKCC2) in der Niere T1 - Importance of the interaction between calcineurin and SORLA for the regulation of the renal Na⁺-K⁺-2Cl⁻−cotransporter (NKCC2) N2 - Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medullären und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport über den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivität des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminosäurereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden müssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. Über Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters führen. Der intrazelluläre Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung für das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress können SORLA-defiziente Mäuse ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochauflösender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die für die NKCC2 Aktivität maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verstärktem CnAβ-Signal und NKCC2 bestätigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Präsenz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte Überexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zelluläre Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazelluläre Domäne) mittels Co-Immunpräzipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster für CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermediäre Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) führte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend führte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ über ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivität von NKCC2 zu unterstützen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen können die Ergebnisse auch über die Niere hinaus Bedeutung erlangen. N2 - The Na⁺-K⁺-2Cl⁻-cotransporter (NKCC2) of the thick ascending limb (TAL) is critical for renal salt handling. Activity of the cotransporter is facilitated by its phosphorylation at conserved N-terminal threonine and serine residues provided by homologous SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) and OSR1 (oxidative stress responsive kinase 1) kinases. The identification of factors which modulate the phosphorylation and hence, the activity of NKCC2 has received recent interest. SORLA (sorting-protein-related receptor with A-type repeats) is co-expressed with NKCC2 in TAL epithelium. Genetically engineered mice lacking SORLA show near-complete absence of NKCC2 phosphorylation at the SPAK/OSR1-dependent phosphoacceptors, indicating that SORLA acts as a mediator between these reaction partners, possibly by a cellular trafficking step involving additional molecules. The present study addresses molecular pathways modulating NKCC2 activity by phosphorylation or dephosphorylation reactions with a special focus on SORLA. Comparative evaluation of SORLA-deficient and wild-type mouse kidneys revealed similar levels of phosphorylated, catalytically active SPAK and OSR1 kinases, whereas abundance of the phosphatase calcineurin Aβ (CnAβ) was increased by approximately two-fold in the renal medulla of SORLA-deficient mice likely reflecting changes in TAL. In line with this, confocal microscopy revealed accumulation of CnAβ in the apical compartment of TAL in SORLA-deficient kidneys. In contrast, overexpression of SORLA in HEK cells resulted in approximately two-fold decreased CnAβ levels suggesting that SORLA modulates both the cellular abundance and distribution of the phosphatase. This data was further corroborated by co-immunoprecipitation and GST pull down assays which showed an interaction between the cytoplasmic tail of SORLA and CnAβ. Acute administration of the calcineurin inhibitor, cyclosporin A (CsA), for 1 h rapidly normalized NKCC2 phosphorylation in SORLA-deficient mice which demonstrates that the decrease in phospho-NKCC2 was functionally related with CnAβ. In sum, our data elucidate the role of calcineurin in the regulation of NKCC2 and establish SORLA as an endogenous regulator of the phosphatase. KW - Salztransport KW - Niere KW - Henlesche Schleife KW - Calcineurin KW - Phosphatase KW - SORLA KW - Calcineurin-Inhibitoren KW - Transporteraktivierung KW - Phosphorylierung KW - kidney KW - phosphorylation KW - thick ascending limb KW - epithelial salt transport KW - calcineurin inhibitors KW - cell signaling Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-89205 ER -