TY - THES A1 - Riedel, Soraya Lisanne T1 - Development of electrochemical antibody-based and enzymatic assays for mycotoxin analysis in food T1 - Entwicklung elektrochemischer Antikörper- und Enzym-basierter Assays für die Analyse von Mykotoxinen in Lebensmitteln N2 - Electrochemical methods are promising to meet the demand for easy-to-use devices monitoring key parameters in the food industry. Many companies run own lab procedures for mycotoxin analysis, but it is a major goal to simplify the analysis. The enzyme-linked immunosorbent assay using horseradish peroxidase as enzymatic label, together with 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 as substrates allows sensitive mycotoxin detection with optical detection methods. For the miniaturization of the detection step, an electrochemical system for mycotoxin analysis was developed. To this end, the electrochemical detection of TMB was studied by cyclic voltammetry on different screen-printed electrodes (carbon and gold) and at different pH values (pH 1 and pH 4). A stable electrode reaction, which is the basis for the further construction of the electrochemical detection system, could be achieved at pH 1 on gold electrodes. An amperometric detection method for oxidized TMB, using a custom-made flow cell for screen-printed electrodes, was established and applied for a competitive magnetic bead-based immunoassay for the mycotoxin ochratoxin A. A limit of detection of 150 pM (60 ng/L) could be obtained and the results were verified with optical detection. The applicability of the magnetic bead-based immunoassay was tested in spiked beer using a handheld potentiostat connected via Bluetooth to a smartphone for amperometric detection allowing to quantify ochratoxin A down to 1.2 nM (0.5 µg/L). Based on the developed electrochemical detection system for TMB, the applicability of the approach was demonstrated with a magnetic bead-based immunoassay for the ergot alkaloid, ergometrine. Under optimized assay conditions a limit of detection of 3 nM (1 µg/L) was achieved and in spiked rye flour samples ergometrine levels in a range from 25 to 250 µg/kg could be quantified. All results were verified with optical detection. The developed electrochemical detection method for TMB gives great promise for the detection of TMB in many other HRP-based assays. A new sensing approach, based on an enzymatic electrochemical detection system for the mycotoxin fumonisin B1 was established using an Aspergillus niger fumonisin amine oxidase (AnFAO). AnFAO was produced recombinantly in E. coli as maltose-binding protein fusion protein and catalyzes the oxidative deamination of fumonisins, producing hydrogen peroxide. It was found that AnFAO has a high storage and temperature stability. The enzyme was coupled covalently to magnetic particles, and the enzymatically produced H2O2 in the reaction with fumonisin B1 was detected amperometrically in a flow injection system using Prussian blue/carbon electrodes and the custom-made wall-jet flow cell. Fumonisin B1 could be quantified down to 1.5 µM (≈ 1 mg/L). The developed system represents a new approach to detect mycotoxins using enzymes and electrochemical methods. N2 - Zur Entwicklung von einfach zu bedienenden Vor-Ort-Geräten, welche für die Analytik von wichtigen Parametern in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden können, sind elektrochemische Methoden besonders vielversprechend. Viele Unternehmen führen bereits Mykotoxinanalytik in eigenen Laboren am Produktionsstandort durch, dennoch gibt es große Bestrebungen Analysenmethoden weiter zu vereinfachen. Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), welcher häufig mit der Meerrettichperoxidase als enzymatischem Label und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 als Enzymsubstraten arbeitet, ermöglicht den sensitiven Mykotoxinnachweis mithilfe optischer Detektionsmethoden. Zur Miniaturisierung des Detektionsschrittes wurde in dieser Arbeit der Aufbau von elektrochemischen Detektionssystemen für die Mykotoxinanalytik untersucht. Dazu wurde zunächst die elektrochemische Reaktion von TMB an verschiedenen Materialien siebgedruckter Elektroden (Kohlenstoff und Gold) sowie bei verschiedenen pH-Werten (pH 1 und pH 4) untersucht. Eine stabile Elektrodenreaktion, welche die Grundlage für den weiteren Aufbau des elektrochemischen Detektionssystems darstellt, konnte bei pH 1 an Goldelektroden erzielt werden. Basierend darauf wurde eine amperometrische Detektionsmethode für oxidiertes TMB entwickelt, wofür eine maßgefertigte Durchflusszelle verwendet wurde. Die amperometrische TMB-Detektion wurde für einen kompetitiven Magnetpartikel-basierten Immunoassay für Ochratoxin A eingesetzt. Mit diesem Assay wurde eine Nachweisgrenze von 150 pM (60 ng L-1) erreicht und die Ergebnisse konnten durch optische Detektion verifiziert werden. Die Anwendbarkeit des Assays konnte in Ochratoxin A dotiertem Bier demonstriert werden, wobei für die Detektion ein tragbarer Potentiostat verwendet wurde, welcher über Bluetooth mit einem Smartphone verbunden war. Hiermit konnten niedrige Ochratoxin A Konzentration von bis zu 1.2 nM (0.5 µg L-1) bestimmt werden. Aufbauend auf dem entwickelten elektrochemischen Detektionssystem für TMB wurde die Anwendbarkeit des Ansatzes auf einen Magnetpartikel-basierten Immunoassay für das Ergotalkaloid Ergometrine, evaluiert. Unter optimierten Bedingungen konnte mit dem Assay eine Nachweisgrenze von 3 nM (1 µg L-1) erreicht werden. In mit Ergometrin versetztem Roggenmehl konnten Konzentrationen von 25 bis 250 µg kg-1 nachgewiesen werden. Die entwickelte elektrochemische Nachweismethode für TMB bietet einen vielversprechenden Ansatz für den Einsatz in vielen anderen Meerrettichperoxidase-basierten Assays. Für das Mykotoxin Fumonisin B1, wurde ein neues sensorisches System entwickelt, welches auf einem enzymatischen elektrochemischen Nachweis basiert. Hierfür wurde eine Aspergillus niger Fumonisin Aminoxidase (AnFAO) rekombinant als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein exprimiert. AnFAO katalysiert die oxidative Deaminierung von Fumonisinen, wobei H2O2 gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass AnFAO eine hohe Lagerungs- und Temperaturstabilität hat. Für den Nachweis von Fumonisin B1 wurde das Enzym kovalent an Magnetpartikel gekoppelt. Das enzymatisch produzierte H2O2 konnte anschließend amperometrisch mithilfe von Preußisch Blau/Kohlenstoff-Elektroden in der maßgefertigten Durchflusszelle detektiert werden. Fumonisin B1 konnte bis zu einer Konzentration von 1,5 µM (≈ 1 mg L-1) quantifiziert werden. Das entwickelte System stellt einen neuen Ansatz dar, um Mykotoxine unter Nutzung von Enzymen und elektrochemischen Methoden zu detektieren. KW - mycotoxins KW - Mykotoxine KW - immunoassay KW - Immunoassay KW - food analysis KW - Lebensmittelanalytik KW - enzyme KW - Enzym KW - amperometry KW - Amperometrie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607477 ER - TY - THES A1 - Korn, Ulrike T1 - Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und Fusarium graminearum-Isolate auf die Schadbildausprägung bei Winterweizen sowie die Möglichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza T1 - Impact of aggressiveness of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum isolates on the degree of symptoms as well as the possibility to control Fusarium spp. with mycorrhiza N2 - Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und F. graminearum-Isolate auf die Schadbildausprägung bei Winterweizen sowie die Möglichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza Die durch Pilzarten der Gattung Fusarium spp. hervorgerufene partielle Taubährigkeit ist ein ernstes Problem im weltweiten Weizenanbau. Eine für die Schaderreger günstige feuchte Witterung zum Zeitpunkt der Weizenblüte in Kombination mit befallsfördernden agrotechnischen Maßnahmen löst immer wieder Epidemien aus. Hauptsächlich verursacht durch F. culmorum und F. graminearum führt eine Erkrankung zu Ertrags- und Qualitätseinbußen sowie zu einer Belastung des Ernteguts mit Mykotoxinen, die bereits in niedrigen Konzentrationen toxisch auf den tierischen und menschlichen Organismus wirken. Die am häufigsten vorkommenden Fusarium-Toxine in Weizen sind Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZEA). Isolate von F. graminearum- und F. culmorum können in ihrem DON- und ZEA-Bildungsvermögen und ihrem Potential, Nekrosen zu verursachen, stark variieren. In Laborversuchen (in vitro) wurden F. graminearum- und F. culmorum-Isolate hinsichtlich dieser Eigenschaften (hier als Aggressivität bezeichnet) charakterisiert und anschließend wurde im Feldversuch überprüft, ob die in vitro-ermittelte Aggressivität die Schadbildausprägung bei Weizenpflanzen beeinflusst. Nur im ersten Versuchsjahr, das durch hohe Niederschläge gekennzeichnet war, konnte ein Einfluss der Aggressivität und einer zusätzlichen Beregnung im Feldversuch nachgewiesen werden. Die als hoch-aggressiv eingestuften Fusarium-Isolate reduzierten unter dem Einfluss der Beregnung den Ertrag und das Tausendkorngewicht. Die Beregnung führte zu einer Erhöhung des Pilzwachstums und der DON- und ZEA-Produktion. Ein extrem trockener Sommer verhinderte die Infektion der Weizenpflanzen durch die beimpften Fusarium-Isolate und ein anschließendes Pilzwachstum in den Ähren im zweiten Versuchsjahr. Um den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. vorzubeugen, stehen verschiedene pflanzenbauliche Maßnahmen zur Verfügung. Eine Möglichkeit stellen in diesem Zusammenhang die symbiotischen Mykorrhizapilze (MP) dar. Die Pilze sind in der Lage, Pflanzen zu stärken und antagonistisch auf pilzliche Schaderreger zu wirken. Um zu überprüfen, ob MP dazu beitragen könnten, den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. niedrig zu halten, wurden Weizenpflanzen mit MP und Fusarium spp. beimpft und die Auswirkungen der Interaktionen auf die Weizenpflanzen in einem Klimakammer- und einem Feldversuch getestet. In der Klimakammer wurde eine Reduzierung des Fusarium-Befalls nachgewiesen. Die mykorrhizierten Weizenpflanzen wiesen außerdem höhere Photosyntheseraten, höhere Sprosstrockenmassen und mehr Ähren im Vergleich zu den nicht-mykorrhizierten und mit Fusarium-beimpften Weizenpflanzen auf. Insgesamt wurde durch die Mykorrhizierung der negative Einfluss von Fusarium spp. kompensiert. Im Freiland konnte kein Einfluss der MP auf Fusarium spp. beobachtet werden. Im ersten Versuchsjahr führte das Beimpfen der Weizenpflanzen mit MP zu höheren Wurzel- und Sprosstrockenmassen sowie zu höheren Tausendkorngewichten im Vergleich zu den mit Fusarium spp.-beimpften Weizenpflanzen. Im zweiten Versuchsjahr konnte dieses Ergebnis nicht wiederholt werden. N2 - Impact of aggressiveness of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum isolates on the degree of symptoms as well as the possibility to control Fusarium spp. with mycorrhiza Fusarium Head Blight (FHB) is a serious problem worldwide and is mainly caused by Fusarium (F). culmorum and F. graminearum. Humid weather conditions, especially at anthesis and agricultural measures forcing pathogen attack cause epidemics repeatedly. FHB leads to yield and quality losses and also to contamination of harvest with mycotoxins that are toxic to humans and animals already in low concentrations. The most frequently occurring Fusarium toxins in wheat are deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA). F. culmorum and F. graminearum isolates can differ in their potential to produce mycotoxins and to cause necrosis. Isolates of these two species were assigned to three different groups of aggressiveness on the basis of mycotoxin production and necrotic activity. Afterwards these isolates were inoculated on wheat in fields to ascertain their aggressiveness on the degree of symptoms. Only in the first year of the trial that was characterized by high precipitation amounts an influence of the aggressiveness and of an additional irrigation could be determined. Influenced by irrigation isolates of high aggressiveness reduced yield and 1000-kernel-weight. Besides, irrigation led to an increase of fungal growth and DON and ZEA production. An extremely dry summer in the second year of the trial prevented wheat infection by Fusarium isolates and subsequent colonization of the ears. Various agricultural measures are available to prevent Fusarium infection. The release of mycorrhizal fungi is one possibility. These fungi are able to strengthen plants and affect fungal pathogens antagonistically. Mycorrhizal fungi and Fusarium isolates were inoculated on wheat plants in climate chamber and fields to determine their potential for pest management. The impact of the interactions of these two organisms on wheat plants was analyzed. In climate chamber a reduction of Fusarium colonization was observed. Furthermore a higher rate of photosynthesis, a higher shoot dry weight and a higher number of ears were detected for the mycorrhizal plants compared to the non-mycorrhizal Fusarium inoculated plants. Altogether the negative effects of Fusarium spp. on the wheat plants were compensated by mycorrhizal colonization. In fields no influence of mycorrhizal colonization on Fusarium spp. could be determined. In the first year of the trial inoculation of wheat plants with mycorrhiza led to higher root and shoot dry weight as well as to higher 1000-kernel-weight in comparison to the wheat plants inoculated with Fusarium spp. These results could not be reproduced in the second year of the trial. KW - Fusarium KW - Aggressivität KW - Mykotoxine KW - Arbuskuläre Mykorrhiza KW - Weizen KW - Fusarium KW - aggressiveness KW - mycotoxins KW - arbuscular mycorrhiza KW - wheat Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62908 ER - TY - THES A1 - Rasch, Claudia T1 - Optische Spektroskopie zum Nachweis von Schimmelpilzen und deren Mykotoxine T1 - Optical spectroscopy for the determination of mould and mycotoxins N2 - Gesunde sowie qualitativ hochwertige Nahrungsmittel sind wichtige Voraussetzungen, um einerseits die Lebensmittelsicherheit entlang der Wertschöpfungskette (Wachstum, Verarbeitung, Lagerung und Transport) und andererseits einen vorbeugenden Verbraucherschutz zu gewährleisten. Die Belastung der Nahrung mit Rückständen jeglicher Art war in letzter Zeit häufig Mittelpunkt heftiger öffentlicher Diskussionen. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass unter bestimmten Bedingungen durch Pilze gebildete Giftstoffe, so genannte Mykotoxine, die Ernteprodukte belasten und es bei deren Verzehr durch Menschen oder Tiere zu Vergiftungen kommen kann. Die FAO schätzt, dass etwa 25% der Weltproduktion von Nahrungsmitteln mit Mykotoxinen kontaminiert und in 20% der Getreideernte der Europäischen Union messbare Konzentrationen an Mykotoxinen detektierbar sind. Damit die Lebensmittelsicherheit weiterhin gewährleistet bleibt, werden neben den Routinemethoden schnellere und zerstörungsfreie Methoden benötigt, um die Lebensmittel direkt vor Ort auf Schimmelpilze und deren Mykotoxine zu untersuchen. In dieser Arbeit wird das Potenzial von ausgewählten optisch-basierten spektroskopischen Methoden für die in-situ bzw. in-line Detektion von Schimmelpilzen sowie Mykotoxinen in Getreide(produkten) untersucht. Es werden Absorptions- und Reflexionsmethoden einerseits und Fluoreszenztechniken andererseits eingesetzt. Die spektroskopischen Methoden werden dabei auf Proben unterschiedlicher Komplexität angewandt - beginnend mit der Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften der reinen Mykotoxine in Lösung über künstlich mit verschiedenen Mykotoxinen kontaminierten Getreideproben bis hin zu mit Pilzen befallenem Getreide und hochveredelte Lebensmittel (Wein und Bier) als Proben höchster Komplexität. N2 - Problems of food safety have led to an increasing concern regarding contamination of foods and feeds with mycotoxins and the relevant toxigenic fungi, mainly Aspergillus, Penicillium and Fusarium genera. There is a real need for rapid, sensitive and inexpensive sensors for the detection of toxigenic fungi and mycotoxins, both in the field and after harvest in order to obtain real-time monitoring data on contamination and this assist in food safety assessment. This will result in an enormous cost saving to the farmers as well as to agro-food industry through the prevention and reduction of product recalls and reduced treatment costs. The German Ministry of Education and Research (BMBF) has provided funding of more than 1.9 million Euros from July 2006 to December 2009 for the large joint project "ProSeso.net2" on the development of innovative sensor-based techniques and processes in the field of food quality and safety. In this research-project "Exploration of sustainability potentials by use of sensor-based technologies and integrated assessment models in the production chain of plant related food" 13 partners from universities, non-university institutions and industry cooperate within seven subprojects. The expected results shall contribute to maintain freshness and improve safety of the food production chain. In the subproject “Indicators and sensor technology for the identification of mycotoxin producing fungi in the processing of grain” spectroscopic methods are tested for in-situ and in-line detection of moulds and/or mycotoxins. This presentation focuses on some possible spectroscopic methods for the rapid detection of mycotoxins and fungi on grains. Methods based on one- and two-photon-induced fluorescence spectroscopy are highly attractive because of their outstanding sensitivity and selectivity. In order to utilize a fluorescence technique for the analysis of the mycotoxins in food and feedstuff as well as for basic research on the fungal metabolism, the photochemistry and photophysics of the mycotoxins and fungi need to be elucidated in detail, especially the influence of solvent parameters such as polarity and pH value. Consequently, for a sensitive and selective spectroscopic analysis, it is indispensable to take the specific photophysic of the known mycotoxins into account in order to minimize serious limitations upon sensitivity, selectivity, and accuracy of a potential fluorescence-based sensing application. The spectroscopic techniques are complemented by chemometric tools (Principle Component Analysis) to extract the desired chemical information, e.g. with respect to presence of contaminations. The combination of data obtained from different spectroscopic methods (such as optimal excitation and emission wavelength, fluorescence decay times, and fluorescence quantum efficiency) on the one hand side and NIR spectroscopy on the other side shows promising results for the qualitative as well as quantitative identification of mycotoxins grains. Moreover, NIR reflectance spectra yield additional information on ingredients, moisture content, and the presence (or absence) of fungi in the sample. KW - Mykotoxine KW - Schimmelpilze KW - Fluoreszenz KW - Chemometrie KW - Zweiphotonenanregung KW - mycotoxins KW - mould KW - fluorescence KW - chemometrics KW - Two-Photon-Absorption Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50746 ER -