TY - THES A1 - Kirschbaum, Michael T1 - A microfluidic approach for the initiation and investigation of surface-mediated signal transduction processes on a single-cell level T1 - Entwicklung einer mikrofluidischen Prozesslinie für die Induktion und Analyse oberflächenvermittelter Signaltransduktionsprozesse auf Einzelzell-Ebene N2 - For the elucidation of the dynamics of signal transduction processes that are induced by cellular interactions, defined events along the signal transduction cascade and subsequent activation steps have to be analyzed and then also correlated with each other. This cannot be achieved by ensemble measurements because averaging biological data ignores the variability in timing and response patterns of individual cells and leads to highly blurred results. Instead, only a multi-parameter analysis at a single-cell level is able to exploit the information that is crucially needed for deducing the signaling pathways involved. The aim of this work was to develop a process line that allows the initiation of cell-cell or cell-particle interactions while at the same time the induced cellular reactions can be analyzed at various stages along the signal transduction cascade and correlated with each other. As this approach requires the gentle management of individually addressable cells, a dielectrophoresis (DEP)-based microfluidic system was employed that provides the manipulation of microscale objects with very high spatiotemporal precision and without the need of contacting the cell membrane. The system offers a high potential for automation and parallelization. This is essential for achieving a high level of robustness and reproducibility, which are key requirements in order to qualify this approach for a biomedical application. As an example process for intercellular communication, T cell activation has been chosen. The activation of the single T cells was triggered by contacting them individually with microbeads that were coated with antibodies directed against specific cell surface proteins, like the T cell receptor-associated kinase CD3 and the costimulatory molecule CD28 (CD; cluster of differentiation). The stimulation of the cells with the functionalized beads led to a rapid rise of their cytosolic Ca2+ concentration which was analyzed by a dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the Ca2+-sensitive dye Fura-2. After Ca2+ imaging, the cells were isolated individually from the microfluidic system and cultivated further. Cell division and expression of the marker molecule CD69 as a late activation event of great significance were analyzed the following day and correlated with the previously recorded Ca2+ traces for each individual cell. It turned out such that the temporal profile of the Ca2+ traces between both activated and non-activated cells as well as dividing and non-dividing cells differed significantly. This shows that the pattern of Ca2+ signals in T cells can provide early information about a later reaction of the cell. As isolated cells are highly delicate objects, a precondition for these experiments was the successful adaptation of the system to maintain the vitality of single cells during and after manipulation. In this context, the influences of the microfluidic environment as well as the applied electric fields on the vitality of the cells and the cytosolic Ca2+ concentration as crucially important physiological parameters were thoroughly investigated. While a short-term DEP manipulation did not affect the vitality of the cells, they showed irregular Ca2+ transients upon exposure to the DEP field only. The rate and the strength of these Ca2+ signals depended on exposure time, electric field strength and field frequency. By minimizing their occurrence rate, experimental conditions were identified that caused the least interference with the physiology of the cell. The possibility to precisely control the exact time point of stimulus application, to simultaneously analyze short-term reactions and to correlate them with later events of the signal transduction cascade on the level of individual cells makes this approach unique among previously described applications and offers new possibilities to unravel the mechanisms underlying intercellular communication. N2 - Zelluläre Interaktionen sind wirkungsvolle Mechanismen zur Kontrolle zellulärer Zustände in vivo. Für die Entschlüsselung der dabei beteiligten Signaltransduktionsprozesse müssen definierte Ereignisse entlang der zellulären Signalkaskade erfasst und ihre wechselseitige Beziehung zueinander aufgeklärt werden. Dies kann von Ensemble-Messungen nicht geleistet werden, da die Mittelung biologischer Daten die Variabilität des Antwortverhaltens individueller Zellen missachtet und verschwommene Resultate liefert. Nur eine Multiparameteranalyse auf Einzelzellebene kann die entscheidenden Informationen liefern, die für ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalwege unabdingbar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Methode, welche die gezielte Kontaktierung einzelner Zellen mit anderen Zellen oder Partikeln ermöglicht und mit der die dadurch ausgelösten zellulären Reaktionen auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen analysiert und miteinander korreliert werden können. Da dies die schonende Handhabung einzeln adressierbarer Zellen erfordert, wurde ein auf Dielektrophorese (DEP) basierendes mikrofluidisches System eingesetzt, welches die berührungslose Manipulation mikroskaliger Objekte mit hoher zeitlicher und örtlicher Präzision erlaubt. Das System besitzt ein hohes Potential zur Automatisierung und Parallelisierung, was für eine robuste und reproduzierbare Analyse lebender Zellen essentiell, und daher eine wichtige Voraussetzung für eine Anwendung in der Biomedizin ist. Als Modellsystem für interzelluläre Kommunikation wurde die T-Zell-Aktivierung gewählt. Die Aktivierung der einzelnen T-Zellen wurde durch ihre gezielte Kontaktierung mit Mikropartikeln („beads“) induziert, welche mit Antikörpern gegen spezielle Oberflächenproteine, wie die dem T-Zell-Rezeptor assoziierte Kinase CD3 oder das kostimulatorische Protein CD28, beschichtet waren. Die Stimulation der Zellen mit den funktionalisierten beads führte zu einem raschen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, welche über eine ratiometrische Detektion des Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs Fura-2 gemessen wurde. Anschließend wurden die einzelnen Zellen aus dem mikrofluidischen System isoliert und weiterkultiviert. Am nächsten Tag wurden Zellteilung und die CD69-Expression – ein wichtiger Marker für aktivierte T-Zellen – analysiert und auf Ebene der individuellen Zelle mit dem zuvor gemessenen Ca2+-Signal korreliert. Es stellte sich heraus, dass der zeitliche Verlauf des intrazellulären Ca2+-Signals zwischen aktivierten und nicht aktivierten, sowie zwischen geteilten und nicht geteilten Zellen signifikant verschieden war. Dies zeigt, dass Ca2+-Signale in stimulierten T-Zellen wichtige Informationen über eine spätere Reaktion der Zelle liefern können. Da Einzelzellen äußerst empfindlich auf ihre Umgebungsbedingungen reagieren, war die Anpassung der experimentellen Vorgehensweise im Hinblick auf die Zellverträglichkeit von großer Bedeutung. Vor diesem Hintergrund wurde der Einfluss sowohl der mikrofluidischen Umgebung, als auch der elektrischen Felder auf die Überlebensrate und die intrazelluläre Ca2+-Konzentration der Zellen untersucht. Während eine kurzzeitige DEP-Manipulation im mikrofluidischen System die Vitalität der Zellen nicht beeinträchtigte, zeigten diese unregelmäßige Fluktuationen ihrer intrazellulären Ca2+-Konzentration selbst bei geringer elektrischer Feldexposition. Die Ausprägung dieser Fluktuationen war abhängig von der Expositionszeit, der elektrischen Feldstärke und der Feldfrequenz. Über die Minimierung ihres Auftretens konnten experimentelle Bedingungen mit dem geringsten Einfluss auf die Physiologie der Zellen identifiziert werden. Die Möglichkeit, einzelne Zellen zeitlich definiert und präzise mit anderen Zellen oder Oberflächen zu kontaktieren, die unmittelbare Reaktion der Zellen zu messen und diese mit späteren Ereignissen der Zellantwort zu korrelieren, macht die hier vorgestellte Methode einzigartig im Vergleich mit anderen Ansätzen und eröffnet neue Wege, die der interzellulären Kommunikation zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären. KW - T-Zell Aktivierung KW - Calcium KW - Einzelzellen KW - Mikrofluidik KW - Dielektrophorese KW - T cell activation KW - calcium KW - single-cell KW - lab on a chip KW - dielectrophoresis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-39576 ER - TY - JOUR A1 - Fechner, Lennart A1 - Baumann, Otto A1 - Walz, Bernd T1 - Activation of the cyclic AMP pathway promotes serotonin-induced Ca2+ oscillations in salivary glands of the blowfly Calliphora vicina JF - Cell calcium N2 - Ca2+ and cAMP signalling pathways interact in a complex manner at multiple sites. This crosstalk fine-tunes the spatiotemporal patterns of Ca2+ and cAMP signals. In salivary glands of the blowfly Calliphora vicina fluid secretion is stimulated by serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) via activation of two different 5-HT receptors coupled to the InsP(3)/Ca2+ (Cv5-HT2 alpha) or the cAMP pathway (Cv5-HT7), respectively. We have shown recently in permeabilized gland cells that cAMP sensitizes InsP(3)-induced Ca2+ release to InsP(3). Here we study the effects of the CAMP signalling pathway on 5-HT-induced oscillations in transepithelial potential (TEP) and in intracellular [Ca2+]. We show: (1) Blocking the activation of the cAMP pathway by cinanserin suppresses the generation of TEP and Ca2+ oscillations, (2) application of 8-CPT-cAMP in the presence of cinanserin restores 5-HT-induced TEP and Ca2+ oscillations, (3) 8-CPT-cAMP sensitizes the InsP(3)/Ca2+ signalling pathway to 5-HT and the Cv5-HT2 alpha, receptor agonist 5-MeOT, (4) 8-CPT-cAMP induces Ca2+ oscillations in cells loaded with subthreshold concentrations of InsP(3), (5) inhibition of protein kinase A by H-89 abolishes 5-HT-induced TEP and Ca2+ spiking and mimics the effect of cinanserin. These results suggest that activation of the cyclic AMP pathway promotes the generation of 5-HT-induced Ca2+ oscillations in blowfly salivary glands. KW - Calcium KW - Ca2+ KW - Calcium oscillations KW - cAMP KW - Signalling KW - Crosstalk KW - Salivary gland KW - Calliphora KW - Blowfly KW - Insect Y1 - 2013 U6 - https://doi.org/10.1016/j.ceca.2012.10.004 SN - 0143-4160 VL - 53 IS - 2 SP - 94 EP - 101 PB - Churchill Livingstone CY - Edinburgh ER - TY - JOUR A1 - Feger, Martina A1 - Fajol, Abul A1 - Lebedeva, Aleksandra A1 - Meissner, Adrian A1 - Michael, Diana A1 - Völkl, Jakob A1 - Alesutan, Ioana A1 - Schleicher, Erwin A1 - Reichetzeder, Christoph A1 - Hocher, Berthold A1 - Qadri, Syed M. A1 - Lang, Florian T1 - Effect of Carbon Monoxide Donor CORM-2 on Vitamin D-3 Metabolism JF - Kidney & blood pressure research : official organ of the Gesellschaft für Nephrologie N2 - Background/Aims: Carbon monoxide (CO) interferes with cytochrome-dependent cellular functions and acts as gaseous transmitter. CO is released from CO-releasing molecules (CORM) including tricarbonyl-dichlororuthenium (II) dimer (CORM-2), molecules considered for the treatment of several disorders including vascular dysfunction, inflammation, tissue ischemia and organ rejection. Cytochrome P450-sensitive function include formation of 1,25-dihydroxyvitamin D-3 (1,25(OH)(2)D-3) by renal 25-hydroxyvitamin D-3 1-alpha-hydroxylase (Cyp27b1). The enzyme is regulated by PTH, FGF23 and klotho. 1,25(OH)(2)D-3 regulates Ca2+ and phosphate transport as well as klotho expression. The present study explored, whether CORM-2 influences 1,25(OH)(2)D-3 formation and klotho expression. Methods: Mice were treated with intravenous CORM-2 (20 mg/kg body weight). Plasma 1,25(OH)(2)D-3 and FGF23 concentrations were determined by ELISA, phosphate, calcium and creatinine concentrations by colorimetric methods, transcript levels by quantitative RT-PCR and protein expression by western blotting. Fgf23 mRNA transcript levels were further determined in rat osteosarcoma UMR106 cells without or with prior treatment for 24 hours with 20 mu M CORM-2. Results: CORM-2 injection within 24 hours significantly increased FGF23 plasma levels and decreased 1,25(OH)(2)D-3 plasma levels, renal Cyp27b1 gene expression as well as renal klotho protein abundance and transcript levels. Moreover, treatment of UMR106 cells with CORM-2 significantly increased Fgf23 transcript levels. Conclusion: CO-releasing molecule CORM-2 enhances FGF23 expression and release and decreases klotho expression and 1,25(OH)(2)D-3 synthesis. KW - CORM-2 KW - 1,25-Dihydroxyvitamin D-3 KW - Klotho KW - FGF23 KW - Phosphate KW - Calcium Y1 - 2013 U6 - https://doi.org/10.1159/000355730 SN - 1420-4096 SN - 1423-0143 VL - 37 IS - 4-5 SP - 496 EP - 505 PB - Karger CY - Basel ER - TY - THES A1 - Behrends, Nicole T1 - Funktionalisierte OS(T)K-Stäbe und Sensorfluorophore zur optischen Sensorik T1 - Functionalized OS(T)K-rods and dyes for optical sensor systems N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum einen erste Oligospiro(thio)ketal (OS(T)K)-basierte Modellsysteme (molekulare Sonden) für abstandsabhängige Messungen mittels Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) und zum anderen Sensorfluorophore, basierend auf einem DBD-Fluorophor und BAPTA, zur Messung der intrazellulären Calcium-Konzentration dargestellt. Für die Synthese von molekularen Sonden für abstandsabhängige Messungen wurden verschiedenste einfach- und doppelt-markierte OS(T)K-Stäbe entwickelt und spektroskopisch untersucht. Die OS(T)K-Stäbe, sogenannte molekulare Stäbe, dienten als starre Abstandshalter zwischen den Fluorophoren. Als Fluorophore wurden Derivate von 6,7-Dihydroxy-4-methylcoumarin (Donor) und Acyl-DBD (Akzeptor) verwendet, die zusammen ein FRET-Paar bilden. Die Fluorophore wurden so funktionalisiert, dass sie sowohl unbeweglich bzw. „starr“, als auch beweglich bzw. „flexibel“ an den OS(T)K-Stab gebunden werden konnten. Für die Synthese der OS(T)K-Stäbe wurden ebenfalls eine Reihe an unterschiedlich langen und kurzen Stabbausteinen synthetisiert. Auf diese Weise wurden eine Vielzahl an verschiedensten einfach- und doppelt-markierten OS(T)K-Stäben dargestellt, deren Fluorophore sowohl „starr“ als auch „flexibel“ gebunden sind. Die dargestellten Stäbe wurden in verschiedensten Lösungsmitteln spektroskopisch untersucht, um anschließend das Verhalten in Vesikel, die eine biomimetische Umgebung darstellen, zu beurteilen. Es wurde festgestellt, dass sich die Stäbe erfolgreich in die Vesikelmembran einlagerten und hohe FRET-Effizienzen aufweisen. Des Weiteren wurde ein FRET-Paar dargestellt, das sich durch 2-Photonenabsorpion im NIR-Bereich anregen lässt. Es wurde in den lebenden Zellen mittels Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM) untersucht. Zur Untersuchung von intrazellulärem Calcium wurden zwei verschiedene DBD-Fluorophore über einen kurzen Linker mit dem Calcium-Chelator BAPTA verknüpft. Die dargestellten Fluorophore wurden sowohl in vitro als auch in vivo auf ihre Calcium-Sensitivität überprüft. Mittels FLIM wurden in lebenden Zellen die Fluoreszenzlebenszeitverteilungen der Fluorophore nach Calcium-Konzentrationsänderungen detektiert. N2 - In this work, Oligospiro(thio)ketal (OS(T)K)-based model systems (molecular probes) for distance-dependent measurements by Förster resonance energy transfer (FRET) and sensor dyes, based on [1,3]dioxolo[4,5-f][1,3]benzodioxole (DBD) dyes and BAPTA, for measuring the intracellular calcium concentration, were presented. For synthesis of molecular probes, for distance-dependent measurements, various single and double-labeled OS(T)K rods were developed and examined spectroscopically. The OS(T)K rods, called molecular rods, served as rigid spacers between the fluorophores. The FRET pairs consist of a Coumarin (Cou) dye as donor and a DBD dye as acceptor. Cou and DBD were functionalized in such a way that they could be connected both "rigid" as well as "flexible" to the OS(T)K rod. For synthesis of the OS(T)K rods, a number of different long and short rod units were synthesized. In this way, a variety of different single- and double-labeled OS(T)K rods were presented. The rods were spectroscopically analyzed in various solvents to subsequently evaluate the behavior in large unilamellar vesicles (LUVs) that represent a biomimetic system for cell membranes. It was found that the rods successfully incorporated in the vesicle membrane. Furthermore, a FRET pair was shown that can be excited by 2-photon absorption in the NIR region. It was examined in living cells by fluorescence lifetime microscopy (FLIM). To study intracellular calcium, two different DBD dyes were linked via a short linker to the calcium chelator BAPTA. The dyes were examined for their calcium sensitivity both in vitro and in vivo. Using FLIM, the fluorescence lifetime distributions of the dyes were detected in living cells after calcium concentration changes. KW - DBD KW - Coumarin KW - FRET KW - BAPTA KW - Calcium KW - 2P-FRET KW - OSK KW - OSTK KW - molekulare Stäbe KW - DBD KW - coumarin KW - FRET KW - BAPTA KW - calcium KW - 2P-FRET KW - OSK KW - OSTK KW - molecular rods Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-404213 ER - TY - THES A1 - Sinn, Cornelia G. T1 - Ion binding to polymers and lipid membranes in aqueous solutions : Ionenbindung an Polymeren und Lipidmembranen in wässrigen Lösungen N2 - Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Ionenbindung an Polymeren und Lipidmembranen in wässrigen Lösungen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss verschiedener anorganischer Salze und Polyelektrolyte auf die Struktur des Wassers mit Hilfe Isothermer Mikrotitrationskalorimetrie (ITC) erforscht. Die Verdünnungswärme der Salze wurde als Maß für die Fähigkeit der Ionen, die geordnete Struktur des Wassers zu stabilisieren oder zu zerstören, verwendet. Die Verdünnungswärmen konnten auf Hofmeister Effekte zurückgeführt werden. Im Anschluss daran wurde die Bindung von Ca2+ an Natrium- Poly(acrylsäure) (NaPAA) untersucht. Mit Hilfe von ITC und einer Ca2+- selektiven Elektrode wurde die Reaktionsenthalpie und Bindungsisotherme gemessen. Es wurde gezeigt, dass die Binding von Ca2+ - Ionen an NaPAA stark endotherm und daher entropiegetrieben ist. Anschließend wurde die Bindung von Ca2+ an die eindimensionale Polymerkette mit der an ein Lipidvesikel mit denselben funktioniellen Gruppen verglichen. Es wurde beobachtet, dass die Ionenbindung –wie auch im Fall des Polymers- endotherm ist. Ein Vergleich der Ca2+- Bindung an die Lipidmembran mit der an das Polymer konnte zeigen, dass das Ion schwächer an die Membran bindet. Im Zusammenhang mit diesen Experimenten wurde auch beobachtet, dass Ca2+ nicht nur an geladene, sondern auch an zwitterionische Lipidvesikel bindet. Schließlich wurde die Wechselwirkung zweier Salze, KCl and NaCl, mit einem neutralen Polymergel, PNIPAAM, und dem geladenen Polymer PAA untersucht. Mit Hilfe von Kalorimetrie und einer kaliumselektiven Elektrode wurde beobachtet, dass die Ionen mit beiden Polymeren wechselwirken, unabhängig davon, ob diese Ladungen tragen, oder nicht. N2 - The goal of this work was to study the binding of ions to polymers and lipid bilayer membranes in aqueous solutions. In the first part of this work, the influence of various inorganic salts and polyelectrolytes on the structure of water was studied using Isothermal Titration Calorimetry (ITC). The heat of dilution of the salts was used as a scale of water structure making and breaking of the ions. The heats of dilution could be attributed to the Hofmeister Series. Following this, the binding of Ca2+ to poly(sodium acrylate) (NaPAA) was studied. ITC and a Ca2+ Ion Selective Electrode were used to measure the reaction enthalpy and binding isotherm. Binding of Ca2+ ions to PAA, was found to be highly endothermic and therefore solely driven by entropy. We then compared the binding of ions to the one-dimensional PAA polymer chain to the binding to lipid vesicles with the same functional groups. As for the polymer, Ca2+ binding was found to be endothermic. Binding of calcium to the lipid bilayer was found to be weaker than to the polymer. In the context of these experiments, it was shown that Ca2+ not only binds to charged but also to zwitterionic lipid vesicles. Finally, we studied the interaction of two salts, KCl and NaCl, to a neutral polymer gel, PNIPAAM, and to the ionic polymer PAA. Combining calorimetry and a potassium selective electrode we observed that the ions interact with both polymers, whether containing charges or not. T2 - Ion binding to polymers and lipid membranes in aqueous solutions : Ionenbindung an Polymeren und Lipidmembranen in wässrigen Lösungen KW - Ionen KW - Bindung KW - Salz KW - Wasser KW - Struktur KW - Hofmeister KW - Polyelektrolyt KW - Isotherme Titrationskalorimetrie KW - ionenselektive Elektrode KW - Vesikel KW - Calcium KW - Micr KW - ions KW - binding KW - salt KW - water KW - structure KW - Hofmeister KW - polyelectrolyte KW - Isothermal Titration Calorimetry KW - ion selective electrode KW - vesicle KW - calcium KW - micro Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001778 ER -