TY - THES A1 - Sandmann, Michael T1 - Biochemische und cytologische Marker der Zellentwicklung synchronisierter Stämme con Chlamydomonas reinhardtii Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Blankenburg, Stefanie T1 - Charakterisierung der GABAB-Rezeptor Subtypen 1 und 2 der Amerikanischen Großschabe Periplaneta americana T1 - Characterization of GABAB receptor subtypes 1 and 2 of the American Cockroach Periplaneta americana N2 - Die nichtproteinogene Aminosäure GABA (γ-Aminobuttersäure) gilt als der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Zentralnervensystem von Vertebraten sowie Invertebraten und vermittelt ihre Wirkung u. a. über die metabotropen GABAB-Rezeptoren. Bisher sind diese Rezeptoren bei Insekten nur rudimentär untersucht. Für die Amerikanische Großschabe als etablierter Modellorganismus konnte pharmakologisch eine modulatorische Rolle der GABAB-Rezeptoren bei der Bildung von Primärspeichel nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war eine umfassende Charakterisierung der GABAB-Rezeptor-Subtypen 1 und 2 von Periplaneta americana. Unter Verwendung verschiedenster Klonierungsstrategien sowie der Kooperationsmöglichkeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. T. Miura (Hokkaido, Japan) in Hinsicht auf eine dort etablierte P. americana EST-Datenbank gelang die Klonierung von zwei Rezeptor-cDNAs. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen auf GB-spezifische Domänen und konservierte Aminosäure-Reste, sowie der Vergleich zu bekannten GB Sequenzen anderer Arten legen nahe, dass es sich bei den isolierten Sequenzen um die GABAB-Rezeptor-Subtypen 1 und 2 (PeaGB1 und PeaGB2) handelt. Für die funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des Heteromers aus PeaGB1 und PeaGB2 wurden Expressionskonstrukte für die Transfektion in HEK-flpTM-Zellen hergestellt. Das Heteromer aus PeaGB1 und PeaGB2 hemmt bei steigenden GABA-Konzentrationen die cAMP-Produktion. Die Substanzen SKF97541 und 3-APPA konnten als Agonisten identifiziert werden. CGP55845 und CGP54626 wirken als vollwertige Antagonisten. Das in vitro ermittelte pharmakologische Profil im Vergleich zur Pharmakologie an der isolierten Drüse bestätigt, dass die GABA-Wirkung in der Speicheldrüse tatsächlich von GBs vermittelt wird. Für die immunhistochemische Charakterisierung konnte ein spezifischer polyklonaler Antikörper gegen die extrazelluläre Schleife 2 des PeaGB1 generiert werden. Ein weiterer Antikörper, welcher gegen den PeaGB2 gerichtet ist, erwies sich hingegen nicht als ausreichend spezifisch. Western-Blot-Analysen bestätigen das Vorkommen beider Subtypen im Zentralnervensystem von P. americana. Zudem wird der PeaGB1 in der Speicheldrüse und in den Geschlechtsdrüsen der Schabenmännchen exprimiert. Immunhistochemische Analysen zeigen eine PeaGB1-ähnliche Markierung in den GABAergen Fasern der Speicheldrüse auf. Demnach fungiert der PeaGB1 hier als Autorezeptor. Weiterhin konnte eine PeaGB1-ähnliche Markierung in nahezu allen Gehirnneuropilen festgestellt werden. Auch die akzessorischen Drüsen der Männchen, Pilzdrüse und Phallusdrüse, sind PeaGB1-immunreaktiv. N2 - The non-proteinogenic amino acid GABA (γ-aminobutyric acid) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates and invertebrates, and GABA mediates its action among others via metabotropic GABAB receptors (GBs). So far, these receptors are only rudimentary characterized in insects. In the American Cockroach, which is an established model organism, pharmacological studies have pointed out a modulatory role of GBs in the production of primary saliva in the salivary gland. Therefore, the aim of this study is the profound characterization of the GABAB receptor subtypes 1 and 2 of Periplaneta americana. Diverse cloning strategies and the access to a Periplaneta EST-database enabled the cloning of two receptor-cDNAs. The analysis of the deduced amino acid sequences for GB-specific domains and conserved amino acid-residues, and the comparison to known GB-sequences of other species revealed that the sequences correspond to GABAB receptor subtypes 1 and 2 (PeaGB1 and PeaGB2). Next, we functionally and pharmacologically characterized the receptor-heteromer of PeaGB1 and PeaGB2. Therefore, we established expression constructs for the transfection of HEK-flpTM-cells. The PeaGB1/PeaGB2 heteromer inhibits dose-dependently the production of cAMP. The substances SKF97541 and 3-APPA imitate the GABA effect. In contrast, CGP54626 and CGP55845 are considered to be proper antagonists. The comparison of the in vitro with the known pharmacology of isolated glands reveals that GBs indeed mediate the effect of GABA in the salivary gland. For immunohistochemical localization, a specific polyclonal antibody was raised against the extracellular loop 2 of PeaGB1. A second antibody, which was raised against the analogous region of the PeaGB2, must be considered to be non-specific. Western blot analyses demonstrate the localization of both subtypes in the central nervous system of P. americana. Additionally, PeaGB1 is expressed in the salivary gland and in male accessory glands. Immunohistochemical analyses reveal the expression of PeaGB1 in GABAergic nerve fibers of the salivary gland. As a consequence, PeaGB1 must act as an autoreceptor in this organ. A widespread distribution of PeaGB1 in almost all neuropiles was detected in the cockroach brain. In the male accessory glands mushroom gland and phallic (conglobate) gland, an intense PeaGB1-like immunoreactivity was measured. KW - GABA KW - Insekt KW - Pharmakologie KW - Gehirn KW - Speicheldrüse KW - GABA KW - insect KW - pharmacology KW - brain KW - salivary gland Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69648 ER - TY - THES A1 - Hasdorf, Sebastian T1 - Charakterisierung der Photosynthese in an extreme Standorte angepassten Arabidopsi thaliana Ökotypen und in ribosomalen Tabakmutanten Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Zulawski, Monika Anna T1 - Die Rolle der Phosphorylierung in der Regulation pflanzlicher Proteine Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Winkler, André T1 - Entstehung und phänotyp anti - inflammatorischer IgG und ihre Verwendung zur Induktion von Toleranz in der Maus Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Schmitz-Hertzberg, Sebastian-Tim T1 - Entwicklung eines Verkapselungssystems für den Einsatz autonomer Biosensoren in der Bioprozesstechnik und medizinischen Diagnostik Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Baumgart, Natalie T1 - Faltungseigenschaften des extrazellulären Proteins Internalin J und seine Cysteinleiter T1 - Folding of the extracellular protein Internalin J and the cysteine ladder N2 - Internalin J (InlJ) gehört zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Domäne von InlJ ist aus 15 regelmäßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminosäuren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungewöhnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die Häufigkeit von Cysteinen in InlJ ist für ein extrazelluläres Protein von L. monocytogenes außergewöhnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquitären Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilität und Faltung nicht äquivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilitätsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine näher beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zugänglich ist. Die thermodynamische Stabilität wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments möglich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts“ Prinzip folgt. Die Gültigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung bestätigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilität von InlJ geht mit hoher Kooperativität einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativität hauptsächlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberflächenänderung während der Faltung bereits zum größten Teil erfolgt ist, bevor der Übergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen über den Übergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im Übergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilität und ein stark-kooperatives Verhalten für das extrazelluläre Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse könnten wichtige Beiträge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet. N2 - Internalin J (InlJ) is a member of the family of bacterial cysteine-containing leucine-rich repeat (LRR) proteins. Internalins are invasion-associated surface proteins of Listeria monocytogenes. The LRR domain of InlJ consists of 15 repeating units, which are arranged in tandem. The consensus sequence consists of 21 residues. Interestingly, a leucine residue which is highly conserved among the Internalins is replaced by cysteine. This results in a continuous cysteine ladder of 12 repeats. This frequency of cysteines is remarkable for an extracellular protein of L. monocytogenes. Stability and folding of repeat proteins are not equivalently studied considering their ubiquitous distribution in nature. Their modular structure results in simple topology and is dominated by short-range interactions. These characteristic features of repeat proteins facilitate the separation and identification of stabilizing interactions, making repeat proteins to ideal model systems for folding studies. In this work the folding and unfolding of InlJ has been extensively characterized, shedding light on the relevance of the cysteines. Two tryptophans located in the N- and C-terminus allowed monitoring the folding state of the entire protein via fluorescence. Thermodynamic stability was therefore derived by guanidinium chloride induced equilibrium experiments. Furthermore, the chemically induced unfolding and folding reactions were characterized with respect to their kinetics. Interrupted refolding experiments were essential for tracking the productive folding reaction of InlJ. Analysis of the kinetic and equilibrium data leads to the conclusion that the results are compatible with a two-state model. The study presented here reveals high stability of the protein InlJ in conjunction with high cooperativity. Kinetic data disclosed the origin of high cooperativity in the folding reaction; with a Tanford value of about 0.93. This high value implicates that the major change of the accessible surface area occurs before the transition state is formed. Mutational studies provided more detailed structural information about the transition state. 12 of 14 cysteine residues were mutated to alanine for this purpose. The cysteines in repeats 1 to 11 stack over each other and form a ladder of reduced cysteines. The substitution of one of these cysteines has an average destabilizing effect of 4.8 kJ/mol. The deceleration of the folding reaction by the substitution shows that repeats 5 to 11 are already fully structured in the transition state, pointing to a central nucleus in the folding of the LRR-protein InlJ. The extracellular protein InlJ reveals extreme stability and high cooperativity. The insights into the folding of this LRR motif could facilitate the design of further artificial repeat proteins. KW - Internalin J KW - leucinreiches repeat-Protein KW - Proteinfaltung KW - Zweizustandsmodell KW - thermodynamische Stabilität KW - Internalin J KW - leucine-rich repeat protein KW - protein folding KW - two-state model KW - thermodynamic stability Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69603 ER - TY - THES A1 - Keuthe, Mandy T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Suppressormutanten einer Plastom-Genom-Inkompatibilität in Oenothera Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - JOUR A1 - Sultanow, Eldar A1 - Weber, Edzard T1 - Pharmataxigraphie Model of a Hybrid System of RFID Technology and optical Methods JF - Die pharmazeutische Industrie Y1 - 2013 SN - 0031-711X VL - 75 IS - 7 SP - 1197 EP - + PB - Editio-Cantor-Verl. für Medizin und Naturwiss. CY - Aulendorf ER - TY - THES A1 - Verhounig, Andreas T1 - Riboswitche für die konditionale Genexpression in Bakterien und Plastiden Y1 - 2013 CY - Potsdam ER -