TY  - THES
A1  - Frasca, Stefano
T1  - Biocatalysis on nanostructured surfaces : investigation and application of redox proteins using spectro-electrochemical methods
T1  - Biokatalyse auf nanostrukturierten Oberflächen : Untersuchung und Anwendung von Redox-Proteinen unter Verwendung von Spektro-Elektrochemischen Verfahren
N2  - In this thesis, different aspects within the research field of protein spectro- and electro-chemistry on nanostructured materials are addressed. On the one hand, this work is related to the investigation of nanostructured transparent and conductive metal oxides as platform for the immobilization of electroactive enzymes. On the other hand the second part of this work is related to the immobilization of sulfite oxidase on gold nanoparticles modified electrode. Finally direct and mediated spectroelectrochemistry protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and its high homologues the mouse aldehyde oxidase homolog 1. Stable immobilization and reversible electrochemistry of cytochrome c in a transparent and conductive tin-doped and tin-rich indium oxide film with a well-defined mesoporosity is reported. The transparency and good conductivity, in combination with the large surface area of these materials, allow the incorporation of a high amount of electroactive biomolecules (between 250 and 2500 pmol cm-2) and their electrochemical and spectroscopic investigation. Both, the electrochemical behavior and the immobilization of proteins are influenced by the geometric parameters of the porous material, such as the structure and pore shape, the surface chemistry, as well as the protein size and charge. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, are employed for the characterization of cytochrome c immobilized in the mesoporous indium tin oxide and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. A long term protein immobilization is reached using these unmodified mesoporous indium oxide based materials, i.e. more than two weeks even at high ionic strength. The potential of this modified material as an amperometric biosensor for the detection of superoxide anions is demonstrated. A sensitivity of about 100 A M-1 m-2, in a linear measuring range of the superoxide concentration between 0.13 and 0.67 μM, is estimated. In addition an electrochemical switchable protein-based optical device is designed with the core part composed of cytochrome c immobilized on a mesoporous indium tin oxide film. A color developing redox sensitive dye is used as switchable component of the system. The cytochrome c-catalyzed oxidation of the dye by hydrogen peroxide is spectroscopically investigated. When the dye is co-immobilized with the protein, its redox state is easily controlled by application of an electrical potential at the supporting material. This enables to electrochemical reset the system to the initial state and repetitive signal generation. The case of negative charged proteins, which does not have a good interaction with the negative charged indium oxide based films, is also explored. The modification of an indium tin oxide film with a positive charged polymer and the employment of a antimony doped tin oxide film were investigated in this work in order to overcome the repulsion induced by similar charges of the protein and electrode. Human sulfite oxidase and its separated heme-containing domain are able to direct exchange electrons with the supporting material. A study of a new approach for sulfite biosensing, based on enhanced direct electron transfer of a human sulfite oxidase immobilized on a gold nanoparticles modified electrode is reported. The spherical gold nanoparticles were prepared via a novel method by reduction of HAuCl4 with branched poly(ethyleneimine) in an ionic liquid resulting in particles of about 10 nm in hydrodynamic diameter. These nanoparticles were covalently attached to a mercaptoundecanoic acid modified Au-electrode and act as platform where human sulfite oxidase is adsorbed. An enhanced interfacial electron transfer and electrocatalysis is therefore achieved. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, were employed for the characterization of the system and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. The proposed biosensor exhibited a quick steady-state current response, within 2 s and a linear detection range between 0.5 and 5.4 μM with high sensitivity (1.85 nA μM-1). The investigated system provides remarkable advantages, since it works at low applied potential and at very high ionic strength. Therefore these properties could make the proposed system useful in the development of bioelectronic devices and its application in real samples. Finally protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and the mouse aldehyde oxidase homolog 1 were spectroelectrochemically studied. It could be demonstrated that different cofactors present in the protein structure, like the FAD and the molybdenum cofactor, are able to directly exchange electrons with an electrode and are displayed as a single peak in a square wave voltammogram. Protein mutants bearing a serine substituted to the cysteines, bounding to the most exposed iron sulfur cluster additionally showed direct electron transfer which can be attributable to this cluster. On the other hand a mediated spectroelectrochemical titration of the protein bound FAD cofactor was performed in presence of transparent iron and cobalt complex mediators. The results showed the formation of the stable semiquinone and the fully reduced flavin. Two formal potentials for each single electron exchange step were then determined.
N2  - In dieser Arbeit werden verschiedenen Aspekte im Forschungsfeld der Protein-Spekro- und Elektro-Chemie an nanostrukturierte Materialien behandelt. Zum einen werden in dieser Arbeit nanostrukturierte, transparente und leitfähige Metalloxide als Basis für die Immobilisierung von elektroaktiven Enzym untersucht. Des Weiteren behandelt diese Arbeit die Immobilisierung von humaner Sulfitoxidase auf einer Gold-Nanopartikel-modifizierten Elektrode. Schließlich wird die direkte und die vermittelte Elektrochemie von Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Aldehydoxidase Homolog 1, aus Mause, vorgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wird über die stabile Immobilisierung und reversible Elektrochemie von Cytochrom c in einem transparenten und leitfähigen Zinn-dotierten und Zinn-reichen Indiumoxid Film mit einer gut definierten Mesoporosität berichtet. Die Transparenz und gute Leitfähigkeit in Kombination mit der großen Oberfläche dieser Materialien erlauben die Inkorporation einer große Menge elektroaktiver Biomoleküle (zwischen 250 und 2500 pmol cm-2) und deren elektrochemische und spektroskopische Untersuchung. Das elektrochemische Verhalten und die Proteinimmobilisierung sind durch die geometrischen Parameter des porösen Materials, wie die Struktur und Porenform, die Oberflächenchemie, sowie die Größe und Ladung des Proteins beeinflusst. UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie werden für die Charakterisierung von Cytochrom c eingesetzt und zeigen keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins durch die Immobilisierung. Eine langfristige Immobilisierung des Proteins von mehr als zwei Wochen auch bei hoher Ionenstärke wurde unter Verwendung dieser unmodifizierten mesoporösen Indiumoxid-basierten Materialien erreicht. Das Potential dieses modifizierten Materials für die Verwendung in einem amperometrischen Biosensor zum Nachweis von Superoxid-Anionen wurde aufgezeigt. Es wurde eine Empfindlichkeit von etwa 100 A M-1 m-2, in einem linearen Messbereich der Superoxidkonzentration zwischen 0,13 und 0,67 µM, erreicht. Außerdem wurde ein elektrochemisch umschaltbares Protein-basiertes optisches Gerät konzipiert mit Cytochrom c und der mesoporösen Indiumzinnoxidschicht. Ein redox-sensitiver Farbstoff wurde als schaltbare Komponente des Systems verwendet. Die Cytochrom c Oxidation des Farbstoffs durch Wasserstoffperoxid wurde spektroskopisch untersucht. Der Redox-Zustand des Farbstoffs, co-immobilisiert mit dem Protein, ist leicht durch das Anlegen eines elektrischen Potentials an das Trägermaterial kontrollierbar. Dadurch wird die elektrochemische Zurücksetzung des Systems auf den Anfangszustand und eine repetitive Signalerzeugung ermöglicht. Für negativ geladene Proteine, die keine gute Interaktion mit dem negativ geladenen Indiumoxid-basierten Film zeigen wurden die Modifikation der Indiumzinnoxidschicht mit einem positiv geladenen Polymer sowie die Verwendung eines Antimon-dotierten Zinnoxid Films vorgeschlagen. Dadurch konnte die Abstoßung induziert durch die ähnliche Ladung des Proteins und der Elektrode überwunden werden. Es gelang für die humane Sulfit-Oxidase und die separate Häm-haltige Domäne der Austausch von Elektronen mit dem Trägermaterial. Im zweiten Teil der Arbeit wird über eine neue Methode für die Biosensorik von Sulfit berichtet, bei der direkte Elektronentransfer von humaner Sulfitoxidase immobilisierten auf einer mit Gold-Nanopartikeln modifizierten Elektrode verstärkt wurde. Die sphärischen Gold-Nanopartikeln, von etwa 10 nm im Durchmesser, wurden über eine neue Methode durch Reduktion von HAuCl4 mit verzweigtem Polyethylenimin in einer ionischen Flüssigkeit synthetisiert. Diese Nanopartikel wurden kovalent an eine mit Mercaptoundecansäure modifizierten Gold-Elektrode immobilisiert und dienen als Basis für die Adsorption von Sulfitoxidase adsorbiert wurde. Dadurch wurde ein schneller heterogener Elektronen-Transfer und verbesserte Elektrokatalyse erreicht. Für die Charakterisierung des verwendeten Systems eingesetzt wurden UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie. Es wurde keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins beobachtet. Der vorgeschlagene Biosensor zeigte eine schnelle steady-state Stromantwort innerhalb von 2 s, eine lineare Detektion im Bereich zwischen 0,5 und 5,4 µM Sulfit mit einer hohen Empfindlichkeit (1,85 nA µM-1). Das untersuchte System bietet bemerkenswerte Vorteile da es ermöglicht bei niedriger angelegter Spannung und bei sehr hoher Ionenstärke zu arbeiten. Aufgrund dieser Eigenschaften hat das vorgeschlagene System großes Potential für die Entwicklung von bioelektronischen Geräten und der Anwendung in realen Proben. Schließlich werden im letzten Teil der Arbeit die komplexeren Enzymen Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Maus Aldehydoxidase Homolog 1 spektro- und elektrochemisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Kofaktoren in der Proteinstruktur, wie FAD und der Molybdän Kofaktor direkt Elektronen mit einer Elektrode austauschen können, was durch einzelne Peaks im Square Wave Voltammogramm angezeigt wird. Es konnte eine zusätzliche redoxaktive Gruppe mit direktem Elektronen-Transfer nach Austausch eines Cysteins durch Serin am exponierten Eisen-Schwefel-Cluster gezeigt werden. Außerdem wurde eine vermittelte spektroelektrochemische Titration des FAD-Kofaktors in Anwesenheit von Mediatoren der Klasse der Eisen und Kobalt-Komplexe durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass FAD in R. capsulatus XDH zu einem stabilen Semichinone reduziert werden kann. Es gelang die formalen Potentiale für die zwei einzigen Elektrontransferprozesse zu bestimmen.
KW  - Protein Spektroelektrochemie
KW  - nanostrukturierte Materialien
KW  - Sulfitoxidase
KW  - Xanthindehydrogenase
KW  - Biosensor
KW  - Protein spectroelectrochemistry
KW  - nanostructured materials
KW  - sulfite oxidase
KW  - xanthine dehydrogenase
KW  - biosensor
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-58131
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wettstein, Christoph
T1  - Cytochrome c-DNA and cytochrome c-enzyme interactions for the construction of analytical signal chains
N2  - Electron transfer (ET) reactions play a crucial role in the metabolic pathways of all organisms. In biotechnological approaches, the redox properties of the protein cytochrome c (cyt c), which acts as an electron shuttle in the respiratory chain, was utilized to engineer ET chains on electrode surfaces. With the help of the biopolymer DNA, the redox protein assembles into electro active multilayer (ML) systems, providing a biocompatible matrix for the entrapment of proteins. 
In this study the characteristics of the cyt c and DNA interaction were defined on the molecular level for the first time and the binding sites of DNA on cyt c were identified. Persistent cyt c/DNA complexes were formed in solution under the assembly conditions of ML architectures, i.e. pH 5.0 and low ionic strength. At pH 7.0, no agglomerates were formed, permitting the characterization of the NMR spectroscopy. Using transverse relaxation-optimized spectroscopy (TROSY)-heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiments, DNAs’ binding sites on the protein were identified. In particular, negatively charged AA residues, which are known interaction sites in cyt c/protein binding were identified as the main contact points of cyt c and DNA. 
Moreover, the sophisticated task of arranging proteins on electrode surfaces to create functional ET chains was addressed. Therefore, two different enzyme types, the flavin dependent fructose dehydrogenase (FDH) and the pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), were tested as reaction partners of freely diffusing cyt c and cyt c immobilized on electrodes in mono- and MLs. The characterisation of the ET processes was performed by means of electrochemistry and the protein deposition was monitored by microgravimetric measurements. FDH and PQQ-GDH were found to be generally suitable for combination with the cyt c/DNA ML system, since both enzymes interact with cyt c in solution and in the immobilized state. The immobilization of FDH and cyt c was achieved with the enzyme on top of a cyt c monolayer electrode without the help of a polyelectrolyte. Combining FDH with the cyt c/DNA ML system did not succeed, yet. However, the basic conditions for this protein-protein interaction were defined. PQQ-GDH was successfully coupled with the ML system, demonstrating that that the cyt c/DNA ML system provides a suitable interface for enzymes and that the creation of signal chains, based on the idea of co-immobilized proteins is feasible. 
Future work may be directed to the investigation of cyt c/DNA interaction under the precise conditions of ML assembly. Therefore, solid state NMR or X-ray crystallography may be required. Based on the results of this study, the combination of FDH with the ML system should be addressed. Moreover, alternative types of enzymes may be tested as catalytic component of the ML assembly, aiming on the development of innovative biosensor applications.
N2  - In den Energiegewinnungsprozessen der Zellen spielen biochemische Reaktion, die auf Elektronentransfer (ET) basieren, eine wichtige Rolle. So sind die Proteinkomplexe der Atmungskette, welche an der inneren Membran der Mitochondrien abläuft, über eine ET-Kette miteinander verbunden. In biotechnologischen Anwendungen wird dieses Phänomen genutzt um Proteine auf der Oberfläche von Elektroden als funktionierende ET-Ketten zu arrangieren. Dabei kann der ET innerhalb dieser Kaskaden als elektrischer Strom gemessen und als Signal betrachtet werden. Dies ermöglicht die Anwendung von proteinmodifizierten Elektroden als Biosensoren und Biobrennstoffzellen. Ein geeigneter Baustein für den Aufbau vielschichtiger ET-Systeme ist das kleine, eisenhaltige Protein Cytochrom c (Cyt c), welches in der Lage ist Elektronen aufzunehmen, zu transportieren und wieder abzugeben. Als zweiter Baustein dient das lange, fadenartige Biomolekül DNA. DNA und Cyt c interagieren unter bestimmten Bedingungen aufgrund ihrer entgegengesetzten Oberflächenladungen. Dies ermöglicht den schichtweisen Aufbau stabiler Cyt c/DNA-Multischichten (MS) auf Elektrodenoberflächen, welche durch die sogenannte Layer-by-Layer (LbL) Technik aufgebaut werden. In diesen MS Systemen behält Cyt c trotz der Immobilisierung seine Beweglichkeit um die eigene Achse, wodurch der Selbstaustausch von Elektronen zwischen den Cyt c Molekülen sowie der ET zur Elektrode gewährleistet wird.
Der molekulare Aufbau der Cyt c/DNA MS sowie die Interaktion zwischen den zwei biologischen Bausteine ist weitgehend unerforscht, daher wurden in der vorliegenden Studie die genauen Bedingungen der Cyt c/DNA Interaktion in Lösung untersucht. Außerdem wird die Eignung des MS Systems zur Einbettung von Enzymen getestet.
Die Bausteine des MS-Systems, Cyt c und DNA bilden in Lösung stabile Komplexe unter den Assemblierungsbedingungen der MS (d.h. pH 5.0 und geringe Salzkonzentration). Im Vergleich dazu tritt  bei pH 7.0 eine schwächere Interaktion auf, die für eine Komplexbildung nicht ausreicht. Dies ermöglicht die Untersuchung der Interaktion mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR, engl. nuclear magnetic resonance spectroscopy), wobei die Interaktionsstellen des DNA-Moleküls auf Cyt c bestimmt werden. Im Vergleich zu pH 7.0 wird im leicht sauren pH-Bereich (6.0) eine erhöhte Anzahl an Interaktionspunkten gefunden, was Rückschlüsse auf eine erhöhte Interaktion zulässt. Dies resultiert schließlich in der starken Bindung bei pH 5.0, die den Aufbau stabiler Cyt c/DNA-MS auf Elektrodenoberflächen ermöglicht. Darüber hinaus spielen der Salzgehalt der Lösung sowie das Konzentrationsverhältnis von Cyt c und DNA eine wichtige Rolle.
Auf der Grundlage des Cyt c/DNA-MS Aufbaus sollte durch die Kopplung eines Enzymes eine Signalkette mit sensorischen Eigenschaften geschaffen werden. Das Enzym dient dabei als Erkennungselement für bestimmte Moleküle in Lösung. Durch die Reaktion des Enzyms mit dem Molekül wird ein bioelektrisches Signal generiert, das durch elektrochemische Methoden gemessen wird. Dies wurde mit zwei verschiedenen Enzymen, der Glukose Dehydrogenase (GDH) und der Fruktose Dehydrogenase (FDH), untersucht. Beide Enzyme waren in der Lage mit einer Cyt c Monoschicht zu kommunizieren und konnten mit dem redox Protein auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert werden. GDH konnte erfolgreich mit dem Cyt c/DNA-MS System gekoppelt und die Sensoreigenschaften der so aufgebauten Elektronentransferkette charakterisiert werden.
Zusammenfassend charakterisiert diese Arbeit die Bedingungen der Cyt c/DNA-Komplexbildung und gibt einen Einblick in die bisher unbekannte Interaktion zwischen Cyt c und DNA auf der molekularen Ebene. Darüber hinaus wird die Nutzbarkeit des Cyt c/DNA MS Systems zur Einbettung von Enzymen am Beispiel der GDH gezeigt und schafft somit die Grundlage für das bessere Verständnis von ET Reaktionen zwischen Proteinen auf Elektrodenoberflächen.
T2  - Cytochrom c-DNA und Cytochrom c-Enzym Interaktion für den Aufbau analytischer Signalketten
KW  - biosensor
KW  - protein
KW  - DNA
KW  - enzyme
KW  - interaction
KW  - DNA
KW  - Biosensor
KW  - Enzym
KW  - Interaktion
KW  - Protein
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78367
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TY  - THES
A1  - Rajkumar, Rajagopal
T1  - Development of a thermometric sensor for fructosyl valine and fructose using molecularly imprinted polymers as a recognition element
T1  - Entwicklung eines thermometrischen Sensors für Fructosyl-Valin und Fructose mittels molekular geprägter Polymere als Erkennungselemente
N2  - Nature has always served as a model for mimicking and inspiration to humans in their efforts to improve their life. Researchers have been inspired by nature to produce biomimetic materials with molecular recognition properties by design rather than evolution. Molecular imprinting is one way to prepare such materials. Such smart materials with new functionalities are at the forefront of the development of a relevant number of ongoing and perspective applications ranging from consumer to space industry. Molecularly imprinted polymers were developed by mimicking the natural enzymes or antibodies that serve as host for binding target molecules. These imprints were used as a recognition element to substitute natural biomolecules in biosensors. The concept behind molecular imprinting is to mold a material (with the desired chemical properties) around individual molecules. Upon removal of the molecular templates, one is left with regions in the molded material that fit the shape of the template molecules. Thus, molecular imprinting results in materials that can selectively bind to molecules of interest. Imprinted materials resulted in applications ranging from chemical separation to bioanalytics. In this work attempts were made particularly in the development of molecularly imprinted polymer based thermometric sensors. The main effort was focused towards the development of an covalently imprinted polymer that would be able to selectively bind fructosyl valine (Fru-Val), the N-terminal constituent of hemoglobin A1c ß-chains. Taking into account the known advantages of imprinted polymers, e.g. robustness, thermal and chemical stability, imprinted materials were successfully used as a recognition element in the sensor. One of the serious problems associated with the development of MIP sensors and which lies in the absence of a generic procedure for the transformation of the polymer-template binding event into a detectable signal has been addressed by developing the "thermometric" approach. In general the developed approach gives a new insight on MIP/Analyte interactions.
N2  - In dem Bestreben, ihr eigenes Leben zu verbessern, haben die Menschen stets die Natur nachgeahmt und sich von ihr inspirieren lassen. Die Natur hat Forscher zur Erzeugung smarter biomimetischer Stoffe mit molekularen Erkennungseigenschaften nach dem Vorbild der Evolution inspiriert. Eine der Methoden zur Herstellung solcher Substanzen ist das molekulare Prägen. Smarte Materialien mit neuen Eigenschaften stehen an der Spitze der Entwicklung potentieller Anwendungen vom Verbraucher bis hin zur Raumfahrtindustrie. Durch Nachahmung von natürlichen Enzymen oder Antikörpern wurden molekular geprägte Polymere (MIPs) entwickelt, die der Bindung von Zielmolekülen dienen. Diese geprägten Polymere (imprints) wurden anstelle von Biomolekülen als Erkennungselemente in Biosensoren eingesetzt. Das Konzept, das dem molekularen Prägen zugrunde liegt, besteht in der Formung eines Polymers (mit den entsprechenden chemischen Eigenschaften) um einzelne Zielmoleküle herum. Nach Entfernen dieser molekularen Template bleiben Abdrücke im Polymer übrig, die der Form der Templatmoleküle entsprechen. Mit Hilfe des molekularen Prägens kann man also Stoffe herstellen, die sich selektiv an bestimmte Moleküle binden können. Geprägte Polymere finden breite Anwendung, etwa in chemischen Aufreinigungsprozessen und der Bioanalytik. Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit war es, thermometrische Sensoren auf der Basis molekular geprägter Polymere zu entwickeln. Die Anstrengungen richteten sich vor allem auf die Entwicklung eines kovalent geprägten Polymers, das in der Lage ist, selektiv Fruktosyl-Valin (Fru-Val), den N-terminalen Bereich von Hämoglobin A1c, zu binden. Aufgrund der bekannten Vorzüge geprägter Polymere – z. B. Robustheit und thermische und chemische Stabilität – wurden geprägte Polymere erfolgreich als Erkennungselement im Sensor angewendet. Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung von MIP-Sensoren, das Fehlen eines generischen Verfahrens zur Umwandlung der Bindungsreaktion in ein nachweisbares Signal, wurde mit der Entwicklung der thermometrischen Methode in Angriff genommen. Diese Methode führt allgemein zu neuen Einsichten in die Interaktionen zwischen MIP und Analyt.
KW  - Covalent imprinting
KW  - Fructosyl valine
KW  - MIP sensor
KW  - Fructose
KW  - Glycated hemoglobin
KW  - HbA1c
KW  - Thermistor
KW  - Biosensor
KW  - Calorimetry
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-17272
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TY  - THES
A1  - Wegerich, Franziska
T1  - Engineered human cytochrome c : investigation of superoxide and protein-protein interaction and application in bioelectronic systems
T1  - Gentechnisch verändertes humanes Cytochrom c :Untersuchungen von Superoxid und Protein-Protein-Interaktionen sowie der Anwendung in bioelektronischen Systemen
N2  - The aim of this thesis is the design, expression and purification of human cytochrome c mutants and their characterization with regard to electrochemical and structural properties as well as with respect to the reaction with the superoxide radical and the selected proteins sulfite oxidase from human and fungi bilirubin oxidase. All three interaction partners are studied here for the first time with human cyt c and with mutant forms of cyt c. A further aim is the incorporation of the different cyt c forms in two bioelectronic systems: an electrochemical superoxide biosensor with an enhanced sensitivity and a protein multilayer assembly with and without bilirubin oxidase on electrodes. The first part of the thesis is dedicated to the design, expression and characterization of the mutants. A focus is here the electrochemical characterization of the protein in solution and immobilized on electrodes. Further the reaction of these mutants with superoxide was investigated and the possible reaction mechanisms are discussed. In the second part of the work an amperometric superoxide biosensor with selected human cytochrome c mutants was constructed and the performance of the sensor electrodes was studied. The human wild-type and four of the five mutant electrodes could be applied successfully for the detection of the superoxide radical. In the third part of the thesis the reaction of horse heart cyt c, the human wild-type and seven human cyt c mutants with the two proteins sulfite oxidase and bilirubin oxidase was studied electrochemically and the influence of the mutations on the electron transfer reactions was discussed. Finally protein multilayer electrodes with different cyt form including the mutant forms G77K and N70K which exhibit different reaction rates towards BOD were investigated and BOD together with the wild-type and engineered cyt c was embedded in the multilayer assembly. The relevant electron transfer steps and the kinetic behavior of the multilayer electrodes are investigated since the functionality of electroactive multilayer assemblies with incorporated redox proteins is often limited by the electron transfer abilities of the proteins within the multilayer. The formation via the layer-by-layer technique and the kinetic behavior of the mono and bi-protein multilayer system are studied by SPR and cyclic voltammetry. In conclusion this thesis shows that protein engineering is a helpful instrument to study protein reactions as well as electron transfer mechanisms of complex bioelectronic systems (such as bi-protein multilayers). Furthermore, the possibility to design tailored recognition elements for the construction of biosensors with an improved performance is demonstrated.
N2  - Ziel dieser Arbeit ist es genetisch veränderte Formen von humanem Cytochrom c herzustellen und diese einerseits hinsichtlich der Reaktion mit dem Sauerstoff-Radikal Superoxid aber auch mit anderen Proteinen zu untersuchen. Zusätzlich sollen die verschiedenen Protein-Mutanten in neuartige bioelektronische Systeme eingebracht werden. Es wurden insgesamt 20 Cytochrome c Mutanten designt, rekombinant exprimiert und aufgereinigt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich die Reaktion von Cytochrom c mit dem negativ geladenen Superoxid durch gezielte Mutationen, die zusätzliche positive Ladungen in das Molekül bringen, um bis zu 30 % erhöhen lässt. Es wurde aber auch deutlich, dass andere Eigenschaften des Proteins sowie dessen Struktur durch die Mutationen geändert werden können. Cytochrom c Mutanten mit einer erhöhten Reaktionsrate mit Superoxid konnten erfolgreich in einen Superoxid-Biosensor mit erhöhter Sensitivität eingebracht werden. Weiterhin wurde einige Mutanten hinsichtlich Ihrer Interaktion mit den zwei Enzymen Sulfitoxidase und Bilirubinoxidase untersucht. Hier konnten ebenfalls unterschiedliche Reaktivitäten festgestellt werden. Schließlich wurden ausgewählte Protein-Varianten mit und ohne den zuvor untersuchten Enzymen in ein Multischicht-Elektroden-System eingebettet und dessen kinetisches Verhalten untersucht. Es wurde gefunden, dass die Schnelligkeit mit der Cytochrom c mit sich selbst Elektronen austauschen kann, eine Limitierung der Größenordnung der katalytischen Ströme darstellt. Diese Selbstaustausschrate wurde durch die eingeführten Mutationen verändert. So verdeutlicht diese Arbeit, dass „Protein-Engineering“ ein gutes Hilfsmittel sein kann, um einerseits Proteinreaktionen und komplexe Elektronentransferreaktionen in Multischichten zu untersuchen, aber auch ein potentes Werkzeug darstellt mit dem zugeschnittene Biokomponenten für Sensoren mit erhöhter Leistungsfähigkeit generiert werden können.
KW  - Cytochrom c
KW  - Protein-Engineering
KW  - Elektrochemie
KW  - Biosensor
KW  - Superoxid
KW  - cytochrome c
KW  - protein engineering
KW  - electrochemistry
KW  - biosensor
KW  - superoxide
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50782
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TY  - THES
A1  - Streffer, Katrin
T1  - Highly sensitive measurements of substrates and inhibitors on the basis of tyrosinase sensors and recycling systems
N2  - Analytische Chemie heute meint nicht länger nur die große Messtechnik, die zeit- und kostenintensiv ist, die außerdem nur von qualifiziertem Personal zu bedienen ist und deren Resultate nur durch dieses Personal auswertbar sind. Meist erfordert diese sagen wir 'klassische analytische Messtechnik' auch noch spezielle Räumlichkeiten und oft eine relative große Menge an speziell vorbereiteten Proben. Neben dieser klassischen analytischen Messtechnik hat sich besonders in den letzten Jahren eine auf bestimmte Stoffgruppen und Anforderungen zugeschnittene Messtechnik durchgesetzt, die oft auch durch einen Laien bedient werden kann. Meist sind es sehr kleine Geräte. Auch die benötigten Probenvolumina sind klein und eine spezielle Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. Ausserdem sind die Geräte einfach zu handhaben, billig sowohl in ihrer Herstellung als auch im Gebrauch und meist erlauben sie sogar eine kontinuierliche Messwerterfassung.   Zahlreiche dieser in den letzten Jahren entwickelten Geräte greifen zurück auf 40 Jahre Forschung auf dem Gebiet der Biosensorik. Seit Clark und Lyons im Jahr 1962 in der Lage waren, mit einer einfachen Sauerstoffelektrode, ergänzt durch ein Enzym, Glucose zu messen, war die Entwicklung neuer Messtechnik nicht mehr aufzuhalten. Biosensoren, spezielle Messfühler, die aus einer Kombination aus biologischer Komponente (erlaubt eine spezifische Erkennung des Analyten auch ohne vorherige Reinigung der Probe) und einem physikalischen Messfühler (wandelt den primären physikochemischen Effekt in ein elektronisch messbares Signal um) bestehen, eroberten den Markt.   Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Tyrosinasesensoren entwickelt, die je nach Herkunft und Eigenschaften der verwendeten Tyrosinase unterschiedliche Anforderungen erfüllen. Beispielsweise wurde einer dieser Tyrosinasesensoren für die Bestimmung phenolischer Verbindungen in Fluss- und Seewasserproben eingesetzt, und die mit diesem Sensor gemessenen Ergebnisse konnten sehr gut mit dem entsprechenden DIN-Test zur Bestimmung phenolischer Verbindungen korreliert werden. Ein anderer entwickelter Sensor zeigte eine sehr hohe Empfindlichkeit für Catecholamine, Substanzen die speziell in der medizinischen Diagnostik von Wichtigkeit sind.   Ausserdem zeigten die ebenfalls im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Untersuchungen zweier verschiedener Tyrosinasen, dass, will man in Zukunft noch empfindlichere Tyrosinasesensoren entwickeln, eine spezielle Tyrosinase (Tyrosinase aus Streptomyces antibioticus) die bessere Wahl sein wird, als die bisher im Bereich der Biosensorforschung verwendete Tyrosinase aus Agaricus bisporus.   Desweiteren wurden erste Erfolge auf molekularbiologischem Gebiet erreicht, das heisst, dass Tyrosinasemutanten mit speziellen, vorher überlegten Eigenschaften, hergestellt werden sollen. Diese Erfolge können dazu genutzt werden, eine neue Generation an Tyrosinasesensoren zu entwickeln, Tyrosinasesensoren in denen Tyrosinase gerichtet gebunden werden kann, sowohl an den entsprechenden physikalischen Messfühler oder auch an ein anderes Enzym. Davon verspricht man sich deutlich minimierte Wege, die die zu bestimmende Substanz (oder deren Produkt) sonst zurücklegen müsste, was am Ende zu einer deutlich erhöhten Empfindlichkeit des resultierenden Biosensors führen sollte.
N2  - Today, analytical chemistry does not longer consist of only the big measuring devices and methods which are time consuming and expensive, which can furthermore only be handled by the qualified staff and in addition the results can also only be evaluated by this qualified staff. Usually, this technique, which shall be described in the following as 'classic analytic measuring technique', requires also rooms equipped especially and often a relative big quantity of the test compounds which should be prepared especially. Beside this classic analytic measuring technique, limited on definite substance groups and requests, a new measuring technique has gained acceptance particularly within the last years, which one can often be used by a layman, too. Often the new measuring technique has very little pieces of equipment. The needed sample volumes are also small and a special sample preparation isn't required. In addition, the new measuring instruments are simple to handle. They are cheap both in their production and in the use and they permit even a continuous measurement recording usually.   Numerous of this new measuring instruments base on the research in the field of Biosensorik during the last 40 years. Since Clark and Lyon in the year 1962 were able to measure glucose with a simple oxygen electrode, completed by an enzyme the development of the new measuring technique did not have to be held back any longer. Biosensors, special pickups which consists of a combination from a biological component (permits a specific recognition of the analyte also without purification of the sample previously) and a physical pickup (convert the primary physicochemical effect into an electronically measurable signal), conquered the market.   In the context of this thesis different tyrosinasesensors were developed which fulfilling the various requests, depending on origin and features of the used tyrosinase. One of the tyrosinasesensors for example was used for quantification of phenolic compounds in river and sea water and the results could correlated very well with the corresponding DIN-test for the determination of phenolic compounds. An other developed tyrosinasesensor showed a very high sensitiveness for catecholamines, substances which are of special importance in the medical diagnostics.   In addition, the investigations of two different tyrosinases, which were carried out also in the context of this thesis, have shown, that a special tyrosinase (tyrosinase from Streptomyces antibioticus) will be the better choice as tyrosinase from Agaricus bisporus, which is used in the area of biosensor research till now, if one wants to develop in future even more sensitive tyrosinasesensors.   Furthermore, first successes became reached on a molecular biological field, the production of tyrosinasemutants with special, before well-considered features. These successes can be used to develop a new generation of tyrosinasesensors, tyrosinasesensors in which tyrosinase can be bound directionally both to the corresponding physical pickup or also to another enzyme. From this one expects to achieve ways minimized which the substance to be determined (or whose product) otherwise must cover. Finally, this should result in an clearly visible increase of sensitivity of the Biosensor.
KW  - Enzymelektrode ; Monophenolmonooxygenase
KW  - Tyrosinase
KW  - Phenol
KW  - Biosensor
KW  - Glucosedehydrogenase
KW  - Recyclingsystem
KW  - Tyrosinaseinhibitoren
KW  - Bioelektrokatalytisches Recycling
KW  - Biokatalytisches Recyc
KW  - tyrosinase
KW  - phenol
KW  - biosensor
KW  - glucose dehydrogenase
KW  - recycling system
KW  - tyrosinase inhibitors
KW  - bioelectrocatalytic recycling
KW  - biocatalytic recycling
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000632
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TY  - THES
A1  - Naseri, Gita
T1  - Plant-derived transcription factors and their application for synthetic biology approaches in Saccharomyces cerevisiae
T1  - Pflanzenbasierte Transkriptionsfaktoren und ihre Anwendungen in der synthetischen Biologie in Saccharomyces cerevisiae
N2  - Bereits seit 9000 Jahren verwendet die Menschheit die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae für das Brauen von Bier, aber erst seit 150 Jahren wissen wir, dass es sich bei diesem unermüdlichen Helfer im Brauprozess um einzellige, lebende Organismen handelt. Und die Bäckerhefe kann noch viel mehr. Im Rahmen des Forschungsgebietes der Synthetischen Biologie soll unter anderem die Bäckerhefe als innovatives Werkzeug für die biobasierte Herstellung verschiedenster Substanzen etabliert werden. Zu diesen Substanzen zählen unter anderem Feinchemikalien, Biokraftstoffe und Biopolymere sowie pharmakologisch und medizinisch interessante Pflanzenstoffe.
Damit diese verschiedensten Substanzen in der Bäckerhefe hergestellt werden können, müssen große Mengen an Produktionsinformationen zum Beispiel aus Pflanzen in die Hefezellen übertragen werden. Darüber hinaus müssen die neu eingebrachten Biosynthesewege reguliert und kontrolliert in den Zellen ablaufen. Auch Optimierungsprozesse zur Erhöhung der Produktivität sind notwendig. Für alle diese Arbeitsschritte mangelt es bis heute an anwendungsbereiten Technologien und umfassenden Plattformen. Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit verschiedene Technologien und Plattformen zur Informationsübertragung, Regulation und Prozessoptimierung geplant und erzeugt.
Für die Konstruktion von Biosynthesewegen in der Bäckerhefe wurde als erstes eine Plattform aus neuartigen Regulatoren und Kontrollelementen auf der Basis pflanzlicher Kontrollelemente generiert und charakterisiert. Im zweiten Schritt erfolgte die Entwicklung einer Technologie zur kombinatorischen Verwendung der Regulatoren in der Planung und Optimierung von Biosynthesewegen (COMPASS). Abschließend wurde eine Technologie für die Prozessoptimierung der veränderten Hefezellen entwickelt (CapRedit). Die Leistungsfähigkeit der entwickelten Plattformen und Technologien wurde durch eine Optimierung der Produktion von Carotenoiden (Beta-Carotin und Beta-Ionon) und Flavonoiden (Naringenin) in Hefezellen nachgewiesen.
Die im Rahmen der Arbeit etablierten neuartigen Plattformen und innovativen Technologien sind ein wertvoller Grundbaustein für die Erweiterung der Nutzbarkeit der Bäckerhefe. Sie ermöglichen den Einsatz der Hefezellen in kosteneffizienten Produktionswegen und alternativen chemischen Wertschöpfungsketten. Dadurch können zum Beispiel Biokraftstoffe und pharmakologisch interessante Pflanzenstoffe unter Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen, Reststoffen und Nebenprodukten hergestellt werden. Darüber hinaus ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten zur Bodensanierung und Wasseraufbereitung.
N2  - Plant-derived Transcription Factors for Orthologous Regulation of Gene Expression in the Yeast Saccharomyces cerevisiae
Control of gene expression by transcription factors (TFs) is central in many synthetic biology projects where tailored expression of one or multiple genes is often needed. As TFs from evolutionary distant organisms are unlikely to affect gene expression in a host of choice, they represent excellent candidates for establishing orthogonal control systems. To establish orthogonal regulators for use in yeast (Saccharomyces cerevisiae), we chose TFs from the plant Arabidopsis thaliana. We established a library of 106 different combinations of chromosomally integrated TFs, activation domains (yeast GAL4 AD, herpes simplex virus VP64, and plant EDLL) and synthetic promoters harbouring cognate cis-regulatory motifs driving a yEGFP reporter. Transcriptional output of the different driver / reporter combinations varied over a wide spectrum, with EDLL being a considerably stronger transcription activation domain in yeast, than the GAL4 activation domain, in particular when fused to Arabidopsis NAC TFs. Notably, the strength of several NAC - EDLL fusions exceeded that of the strong yeast TDH3 promoter by 6- to 10-fold. We furthermore show that plant TFs can be used to build regulatory systems encoded by centromeric or episomal plasmids. Our library of TF – DNA-binding site combinations offers an excellent tool for diverse synthetic biology applications in yeast.

COMPASS: Rapid combinatorial optimization of biochemical pathways based on artificial transcription factors

We established a high-throughput cloning method, called COMPASS for COMbinatorial Pathway ASSembly, for the balanced expression of multiple genes in Saccharomyces cerevisiae. COMPASS employs orthogonal, plant-derived artificial transcription factors (ATFs) for controlling the expression of pathway genes, and homologous recombination-based cloning for the generation of thousands of individual DNA constructs in parallel. The method relies on a positive selection of correctly assembled pathway variants from both, in vivo and in vitro cloning procedures. To decrease the turnaround time in genomic engineering, we equipped COMPASS with multi-locus CRISPR/Cas9-mediated modification capacity. In its current realization, COMPASS allows combinatorial optimization of up to ten pathway genes, each transcriptionally controlled by nine different ATFs spanning a 10-fold difference in expression strength. The application of COMPASS was demonstrated by generating cell libraries producing beta-carotene and co-producing beta-ionone and biosensor-responsive naringenin. COMPASS will have many applications in other synthetic biology projects that require gene expression balancing. 

CaPRedit: Genome editing using CRISPR-Cas9 and plant-derived transcriptional regulators for the redirection of flux through the FPP branch-point in yeast. Technologies developed over the past decade have made Saccharomyces cerevisiae a promising platform for production of different natural products. We developed CRISPR/Ca9- and plant derived regulator-mediated genome editing approach (CaPRedit) to greatly accelerate strain modification and to facilitate very low to very high expression of key enzymes using inducible regulators. CaPRedit can be implemented to enhance the production of yeast endogenous or heterologous metabolites in the yeast S. cerevisiae. The CaPRedit system aims to faciltiate modification of multiple targets within a complex metabolic pathway through providing new tools for increased expression of genes encoding rate-limiting enzymes, decreased expression of essential genes, and removed expression of competing pathways. This approach is based on CRISPR/Cas9-mediated one-step double-strand breaks to integrate modules containing IPTG-inducible plant-derived artificial transcription factor and promoter pair(s) in a desired locus or loci. Here, we used CaPRedit to redirect the yeast endogenous metabolic flux toward production of farnesyl diphosphate (FPP), a central precursor of nearly all yeast isoprenoid products, by overexpression of the enzymes lead to produce FPP from glutamate. We found significantly higher beta-carotene accumulation in the CaPRedit-mediated modified strain than in the wild type (WT) strain. More specifically, CaPRedit_FPP 1.0 strain was generated, in which three genes involved in FPP synthesis, tHMG1, ERG20, and GDH2, were inducibly overexpressed under the control of strong plant-derived ATFPs. The beta–carotene accumulated in CaPRedit_FPP 1.0 strain to a level 1.3-fold higher than the previously reported optimized strain that carries the same overexpressed genes (as well as additional genetic modifications to redirect yeast endogenous metabolism toward FPP production). Furthermore, the genetic modifications implemented in CaPRedit_FPP 1.0 strain resulted in only a very small growth defect (growth rate relative to the WT is ~ -0.03).
KW  - synthetic biology
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - artificial transcription factor
KW  - combinatorial optimization
KW  - biosensor
KW  - DNA assembly
KW  - pathway engineering
KW  - artifizielle Transkriptionsfaktoren
KW  - Biosensor
KW  - kombinatorische Optimierung
KW  - DNA assembly
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - synthetische Biologie
KW  - pathway engineering
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421514
ER  -