TY - THES A1 - Józefczuk, Szymon T1 - "Escherichia coli" stress response on the level of transcriptome and metabolome Y1 - 2009 ER - TY - THES A1 - Balk, Maria T1 - 3D structured shape-memory hydrogels with enzymatically-induced shape shifting Y1 - 2015 ER - TY - THES A1 - Stephan, Mareike Sophia T1 - A bacterial mimetic system to study bacterial inactivation and infection N2 - The emerging threat of antibiotic-resistant bacteria has become a global challenge in the last decades, leading to a rising demand for alternative treatments for bacterial infections. One approach is to target the bacterial cell envelope, making understanding its biophysical properties crucial. Specifically, bacteriophages use the bacterial envelope as an entry point to initiate infection, and they are considered important building blocks of new antibiotic strategies against drug-resistant bacteria.. Depending on the structure of the cell wall, bacteria are classified as Gram-negative and Gram-positive. Gram-negative bacteria are equipped with a complex cell envelope composed of two lipid membranes enclosing a rigid peptidoglycan layer. The synthesis machinery of the Gram-negative cell envelope is the target of antimicrobial agents, including new physical sanitizing procedures addressing the outer membrane (OM). It is therefore very important to study the biophysical properties of the Gram-negative bacterial cell envelope. The high complexity of the Gram-negative OM sets the demand for a model system in which the contribution of individual components can be evaluated separately. In this respect, giant unilamellar vesicles (GUVs) are promising membrane systems to study membrane properties while controlling parameters such as membrane composition and surrounding medium conditions. The aim of this work was to develop methods and approaches for the preparation and characterization of a GUV-based membrane model that mimics the OM of the Gram-negative cell envelope. A major component of the OM is the lipopolysaccharide (LPS) on the outside of the OM heterobilayer. The vesicle model was designed to contain LPS in the outer leaflet and lipids in the inner leaflet. Furthermore, the interaction of the prepared LPS-GUVs with bacteriophages was tested. LPS containing GUVs were prepared by adapting the inverted emulsion technique to meet the challenging properties of LPS, namely their high self-aggregation rate in aqueous solutions. Notably, an additional emulsification step together with the adaption of solution conditions was employed to asymmetrically incorporate LPS containing long polysaccharide chains into the artificial membranes. GUV membrane asymmetry was verified with a fluorescence quenching assay. Since the necessary precautions for handling the quenching agent sodium dithionite are often underestimated and poorly described, important parameters were tested and identified to obtain a stable and reproducible assay. In the context of varied LPS incorporation, a microscopy-based technique was introduced to determine the LPS content on individual GUVs and to directly compare vesicle properties and LPS coverage. Diffusion coefficient measurements in the obtained GUVs showed that increasing LPS concentrations in the membranes resulted in decreased diffusivity. Employing LPS-GUVs we could demonstrate that a Salmonella bacteriophage bound with high specificity to its LPS receptor when presented at the GUV surface, and that the number of bound bacteriophages scaled with the amount of presented LPS receptor. In addition to binding, the bacteriophages were able to eject their DNA into the vesicle lumen. LPS-GUVs thus provide a starting platform for bottom-up approaches for the generation of more complex membranes, in which the effects of individual components on the membrane properties and the interaction with antimicrobial agents such as bacteriophages could be explored. N2 - Die wachsende Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien ist in den letzten Jahrzehnten zu einer globalen Herausforderung geworden, was zu einer steigenden Nachfrage nach alternativen Behandlungsmethoden für bakterielle Infektionen geführt hat. Ein Ansatz besteht darin, die bakterielle Zellhülle anzugreifen, weshalb das Verständnis ihrer biophysikalischen Eigenschaften entscheidend ist. Insbesondere Bakteriophagen, Viren, die Bakterien infizieren, nutzen die Bakterienhülle als ersten Angriffspunkt für die Infektion und gelten als wichtige Bausteine für neue Antibiotikastrategien gegen arzneimittelresistente Bakterien. Je nach Struktur der Zellwand werden Bakterien in gramnegative und grampositive Bakterien eingeteilt. Gramnegative Bakterien sind mit einer komplexen Zellhülle ausgestattet. Daher ist es sehr wichtig, ihre biophysikalischen Eigenschaften zu untersuchen. Die hohe Komplexität der äußeren Zellhülle, auch äußere Membran genannt, erfordert ein Modellsystem, in dem der Beitrag jeder einzelnen Komponente separat bewertet werden kann. In dieser Hinsicht sind Vesikel-basierte Modellsysteme sehr vielversprechend, da sie wichtige Eigenschaften der äußeren Membran simulieren können, aber in ihrer Komplexität stark reduziert und kontrollierbar sind. Ziel dieser Arbeit war es, Methoden und Ansätze für die Herstellung und Charakterisierung eines Vesikel-basierten Modells zu entwickeln, das die äußere Membran der gramnegativen bakteriellen Zellhülle nachahmt. Ein Hauptbestandteil der äußeren Membran ist Lipopolysaccharid (LPS), das asymmetrisch auf der Außenseite der äußeren Membran vorhanden ist. Das Vesikelmodell wurde so konzipiert, dass es außen LPS und innen Phospholipide enthält. Die Herstellung des beschriebenen Modellsystems erforderte einige Anpassungen, da die Hüllkomponente LPS eine hohe Tendenz zur Bildung von Selbstaggregaten aufweist. Durch die Einführung eines zusätzlichen Schrittes in das Standardprotokoll konnten Vesikel mit LPS-Inkorporation erzeugt werden. Es wurde sowohl die Menge als auch die asymmetrische Verteilung des LPS-Einbaus bestimmt. Mit Hilfe von Bakteriophagen sollte die biologische Wirkung des Modellsystems getestet werden. Es wurde gezeigt, dass Bakteriophagen, die spezifisch LPS erkennen und binden, nach Zugabe zum Modellsystem die Vesikel binden und ihr genetisches Material in das Vesikel-Innere injizieren. Die hier beschriebenen LPS-haltigen Vesikel können als Ausgangsplattform für Bottom-up-Ansätze zur Herstellung komplexerer Membranen verwendet werden. Mit diesen komplexeren, aber kontrollierbaren Systemen lassen sich die Auswirkungen einzelner Komponenten der bakteriellen Zellhülle auf die Eigenschaften der Zellhülle sowie ihre Wechselwirkung mit antimikrobiellen Wirkstoffen wie Bakteriophagen untersuchen. KW - Bakterien KW - Bakteriophagen KW - Zellmembran KW - Vesikel KW - Konfokale Mikroskopie KW - Lipopolysaccharid KW - gramnegativ KW - bacteria KW - bacteriophage KW - cell membrane KW - vesicle KW - confocal microscopy KW - lipopolysaccharide KW - gram-negative Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Kirschbaum, Michael T1 - A microfluidic approach for the initiation and investigation of surface-mediated signal transduction processes on a single-cell level T1 - Entwicklung einer mikrofluidischen Prozesslinie für die Induktion und Analyse oberflächenvermittelter Signaltransduktionsprozesse auf Einzelzell-Ebene N2 - For the elucidation of the dynamics of signal transduction processes that are induced by cellular interactions, defined events along the signal transduction cascade and subsequent activation steps have to be analyzed and then also correlated with each other. This cannot be achieved by ensemble measurements because averaging biological data ignores the variability in timing and response patterns of individual cells and leads to highly blurred results. Instead, only a multi-parameter analysis at a single-cell level is able to exploit the information that is crucially needed for deducing the signaling pathways involved. The aim of this work was to develop a process line that allows the initiation of cell-cell or cell-particle interactions while at the same time the induced cellular reactions can be analyzed at various stages along the signal transduction cascade and correlated with each other. As this approach requires the gentle management of individually addressable cells, a dielectrophoresis (DEP)-based microfluidic system was employed that provides the manipulation of microscale objects with very high spatiotemporal precision and without the need of contacting the cell membrane. The system offers a high potential for automation and parallelization. This is essential for achieving a high level of robustness and reproducibility, which are key requirements in order to qualify this approach for a biomedical application. As an example process for intercellular communication, T cell activation has been chosen. The activation of the single T cells was triggered by contacting them individually with microbeads that were coated with antibodies directed against specific cell surface proteins, like the T cell receptor-associated kinase CD3 and the costimulatory molecule CD28 (CD; cluster of differentiation). The stimulation of the cells with the functionalized beads led to a rapid rise of their cytosolic Ca2+ concentration which was analyzed by a dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the Ca2+-sensitive dye Fura-2. After Ca2+ imaging, the cells were isolated individually from the microfluidic system and cultivated further. Cell division and expression of the marker molecule CD69 as a late activation event of great significance were analyzed the following day and correlated with the previously recorded Ca2+ traces for each individual cell. It turned out such that the temporal profile of the Ca2+ traces between both activated and non-activated cells as well as dividing and non-dividing cells differed significantly. This shows that the pattern of Ca2+ signals in T cells can provide early information about a later reaction of the cell. As isolated cells are highly delicate objects, a precondition for these experiments was the successful adaptation of the system to maintain the vitality of single cells during and after manipulation. In this context, the influences of the microfluidic environment as well as the applied electric fields on the vitality of the cells and the cytosolic Ca2+ concentration as crucially important physiological parameters were thoroughly investigated. While a short-term DEP manipulation did not affect the vitality of the cells, they showed irregular Ca2+ transients upon exposure to the DEP field only. The rate and the strength of these Ca2+ signals depended on exposure time, electric field strength and field frequency. By minimizing their occurrence rate, experimental conditions were identified that caused the least interference with the physiology of the cell. The possibility to precisely control the exact time point of stimulus application, to simultaneously analyze short-term reactions and to correlate them with later events of the signal transduction cascade on the level of individual cells makes this approach unique among previously described applications and offers new possibilities to unravel the mechanisms underlying intercellular communication. N2 - Zelluläre Interaktionen sind wirkungsvolle Mechanismen zur Kontrolle zellulärer Zustände in vivo. Für die Entschlüsselung der dabei beteiligten Signaltransduktionsprozesse müssen definierte Ereignisse entlang der zellulären Signalkaskade erfasst und ihre wechselseitige Beziehung zueinander aufgeklärt werden. Dies kann von Ensemble-Messungen nicht geleistet werden, da die Mittelung biologischer Daten die Variabilität des Antwortverhaltens individueller Zellen missachtet und verschwommene Resultate liefert. Nur eine Multiparameteranalyse auf Einzelzellebene kann die entscheidenden Informationen liefern, die für ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalwege unabdingbar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Methode, welche die gezielte Kontaktierung einzelner Zellen mit anderen Zellen oder Partikeln ermöglicht und mit der die dadurch ausgelösten zellulären Reaktionen auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen analysiert und miteinander korreliert werden können. Da dies die schonende Handhabung einzeln adressierbarer Zellen erfordert, wurde ein auf Dielektrophorese (DEP) basierendes mikrofluidisches System eingesetzt, welches die berührungslose Manipulation mikroskaliger Objekte mit hoher zeitlicher und örtlicher Präzision erlaubt. Das System besitzt ein hohes Potential zur Automatisierung und Parallelisierung, was für eine robuste und reproduzierbare Analyse lebender Zellen essentiell, und daher eine wichtige Voraussetzung für eine Anwendung in der Biomedizin ist. Als Modellsystem für interzelluläre Kommunikation wurde die T-Zell-Aktivierung gewählt. Die Aktivierung der einzelnen T-Zellen wurde durch ihre gezielte Kontaktierung mit Mikropartikeln („beads“) induziert, welche mit Antikörpern gegen spezielle Oberflächenproteine, wie die dem T-Zell-Rezeptor assoziierte Kinase CD3 oder das kostimulatorische Protein CD28, beschichtet waren. Die Stimulation der Zellen mit den funktionalisierten beads führte zu einem raschen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, welche über eine ratiometrische Detektion des Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs Fura-2 gemessen wurde. Anschließend wurden die einzelnen Zellen aus dem mikrofluidischen System isoliert und weiterkultiviert. Am nächsten Tag wurden Zellteilung und die CD69-Expression – ein wichtiger Marker für aktivierte T-Zellen – analysiert und auf Ebene der individuellen Zelle mit dem zuvor gemessenen Ca2+-Signal korreliert. Es stellte sich heraus, dass der zeitliche Verlauf des intrazellulären Ca2+-Signals zwischen aktivierten und nicht aktivierten, sowie zwischen geteilten und nicht geteilten Zellen signifikant verschieden war. Dies zeigt, dass Ca2+-Signale in stimulierten T-Zellen wichtige Informationen über eine spätere Reaktion der Zelle liefern können. Da Einzelzellen äußerst empfindlich auf ihre Umgebungsbedingungen reagieren, war die Anpassung der experimentellen Vorgehensweise im Hinblick auf die Zellverträglichkeit von großer Bedeutung. Vor diesem Hintergrund wurde der Einfluss sowohl der mikrofluidischen Umgebung, als auch der elektrischen Felder auf die Überlebensrate und die intrazelluläre Ca2+-Konzentration der Zellen untersucht. Während eine kurzzeitige DEP-Manipulation im mikrofluidischen System die Vitalität der Zellen nicht beeinträchtigte, zeigten diese unregelmäßige Fluktuationen ihrer intrazellulären Ca2+-Konzentration selbst bei geringer elektrischer Feldexposition. Die Ausprägung dieser Fluktuationen war abhängig von der Expositionszeit, der elektrischen Feldstärke und der Feldfrequenz. Über die Minimierung ihres Auftretens konnten experimentelle Bedingungen mit dem geringsten Einfluss auf die Physiologie der Zellen identifiziert werden. Die Möglichkeit, einzelne Zellen zeitlich definiert und präzise mit anderen Zellen oder Oberflächen zu kontaktieren, die unmittelbare Reaktion der Zellen zu messen und diese mit späteren Ereignissen der Zellantwort zu korrelieren, macht die hier vorgestellte Methode einzigartig im Vergleich mit anderen Ansätzen und eröffnet neue Wege, die der interzellulären Kommunikation zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären. KW - T-Zell Aktivierung KW - Calcium KW - Einzelzellen KW - Mikrofluidik KW - Dielektrophorese KW - T cell activation KW - calcium KW - single-cell KW - lab on a chip KW - dielectrophoresis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-39576 ER - TY - THES A1 - Gerling, Marten Tobias T1 - A microfluidic system for high-precision image-based live cell sorting using dielectrophoretic forces T1 - Ein mikrofluidisches System zur hochpräzisen und bildgestützten Sortierung lebender Zellen mittels dielektrophoretischer Kräfte N2 - An important goal in biotechnology and (bio-) medical research is the isolation of single cells from a heterogeneous cell population. These specialised cells are of great interest for bioproduction, diagnostics, drug development, (cancer) therapy and research. To tackle emerging questions, an ever finer differentiation between target cells and non-target cells is required. This precise differentiation is a challenge for a growing number of available methods. Since the physiological properties of the cells are closely linked to their morphology, it is beneficial to include their appearance in the sorting decision. For established methods, this represents a non addressable parameter, requiring new methods for the identification and isolation of target cells. Consequently, a variety of new flow-based methods have been developed and presented in recent years utilising 2D imaging data to identify target cells within a sample. As these methods aim for high throughput, the devices developed typically require highly complex fluid handling techniques, making them expensive while offering limited image quality. In this work, a new continuous flow system for image-based cell sorting was developed that uses dielectrophoresis to precisely handle cells in a microchannel. Dielectrophoretic forces are exerted by inhomogeneous alternating electric fields on polarisable particles (here: cells). In the present system, the electric fields can be switched on and off precisely and quickly by a signal generator. In addition to the resulting simple and effective cell handling, the system is characterised by the outstanding quality of the image data generated and its compatibility with standard microscopes. These aspects result in low complexity, making it both affordable and user-friendly. With the developed cell sorting system, cells could be sorted reliably and efficiently according to their cytosolic staining as well as morphological properties at different optical magnifications. The achieved purity of the target cell population was up to 95% and about 85% of the sorted cells could be recovered from the system. Good agreement was achieved between the results obtained and theoretical considerations. The achieved throughput of the system was up to 12,000 cells per hour. Cell viability studies indicated a high biocompatibility of the system. The results presented demonstrate the potential of image-based cell sorting using dielectrophoresis. The outstanding image quality and highly precise yet gentle handling of the cells set the system apart from other technologies. This results in enormous potential for processing valuable and sensitive cell samples. N2 - Ein wichtiges Ziel in der Biotechnologie und (bio-) medizinischen Forschung ist die Isolation von Einzelzellen aus einer heterogenen Zellpopulation. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften sind diese Zellen für die Bioproduktion, Diagnostik, Arzneimittelentwicklung, (Krebs-) Therapie und Forschung von großem Interesse. Um neue Fragestellungen angehen zu können, ist eine immer feinere Differenzierung zwischen Zielzellen und Nicht-Zielzellen erforderlich. Diese präzise Differenzierung stellt eine Herausforderung für eine wachsende Zahl verfügbarer Methoden dar. Da die physiologischen Eigenschaften der Zellen eng mit ihrer Morphologie verknüpft sind, ist es sinnvoll ihr Erscheinungsbild mit in die Sortierentscheidung einzubeziehen. Für etablierte Methoden stellt dies jedoch einen nicht adressierbaren Parameter dar, weshalb neue Methoden zur Identifikation und Isolation der Zielzellen benötigt werden. Folglich wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl neuer durchflussbasierter Methoden entwickelt und vorgestellt, die 2D-Bilddaten zur Identifikation der Zielzellen innerhalb einer Probe heranziehen. Da diese Methoden auf hohe Durchsätze abzielen, erfordern die entwickelten Geräte in der Regel hochkomplexe Techniken zur Handhabung der Flüssigkeiten, was sie teuer macht und gleichzeitig zu einer begrenzten Bildqualität führt. In dieser Arbeit wurde ein neues durchflussbasiertes System zur bildbasierten Zellsortierung entwickelt, das Dielektrophorese zur präzisen Handhabung der Zellen in einem Mikrokanal verwendet. Dielektrophoretische Kräfte werden von inhomogenen elektrischen Wechselfeldern auf polarisierbare Partikel (hier: Zellen) ausgeübt. Bei dem vorliegenden System können die elektrischen Felder durch einen Signalgenerator präzise und schnell ein- und ausgeschaltet werden. Neben der daraus resultierenden einfachen und effektiven Handhabung der Zellen zeichnet sich das System durch die hervorragende Qualität der erzeugten Bilddaten und die Kompatibilität mit Standardmikroskopen aus. Diese Aspekte führen zu einer geringen Komplexität, die es sowohl erschwinglich als auch benutzerfreundlich macht. Mit dem entwickelten System zur Zellsortierung konnten Zellen sowohl auf Basis einer zytosolischen Färbung als auch auf Basis morphologischer Eigenschaften bei verschiedenen optischen Vergrößerungen zuverlässig und effizient sortiert werden. Die erreichte Reinheit der Zielzellpopulation betrug bis zu 95% wobei etwa 85% der sortierten Zellen aus dem System zurückgewonnen werden konnten. Dabei wurde eine gute Übereinstimmung der ermittelten Ergebnisse mit theoretischen Überlegungen erreicht. Der erreichte Durchsatz des Systems betrug bis zu 12.000 Zellen pro Stunde. Untersuchungen der Zellvitalität deuteten darauf hin, dass das System eine hohe Biokompatibilität aufweist. Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren das Potenzial der bildbasierten Zellsortierung mittels Dielektrophorese. Die herausragende Bildqualität und hochpräzise aber dennoch zellschonende Handhabung der Zellen grenzen das System von anderen Technologien ab. Daraus ergibt sich ein enormes Potenzial für die Verarbeitung wertvoller und sensibler Zellproben. KW - microfluidics KW - cell sorting KW - dielectrophoresis KW - Zellsortierung KW - Dielektrophorese KW - Mikrofluidik Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-587421 ER - TY - THES A1 - Eisinger, Dirk T1 - A new management model for developing small scale contingency plans of rabies Y1 - 2007 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Pellizzer, Tommaso T1 - A novel approach to identify plastidic factors for plastome genome incompatibility and evidence for the central involvement of the chloroplast in leaf shaping Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Wang, Ting T1 - A novel R2R3 MYB-like transcription factor regulates ABA mediated stress response and leaf growth in Arabidopsis Y1 - 2013 CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Schönheit, Jörg T1 - A phagocyte-specific Irf8 gene enhancer establishes early conventional dendritic cell commitment T1 - Ein Phagozyten spezifischer Enhancer des Irf8 Gens steuert die Entwicklung konventioneller dendritischer Zellen N2 - Haematopoietic development is a complex process that is strictly hierarchically organized. Here, the phagocyte lineages are a very heterogeneous cell compartment with specialized functions in innate immunity and induction of adaptive immune responses. Their generation from a common precursor must be tightly controlled. Interference within lineage formation programs for example by mutation or change in expression levels of transcription factors (TF) is causative to leukaemia. However, the molecular mechanisms driving specification into distinct phagocytes remain poorly understood. In the present study I identify the transcription factor Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8) as the specification factor of dendritic cell (DC) commitment in early phagocyte precursors. Employing an IRF8 reporter mouse, I showed the distinct Irf8 expression in haematopoietic lineage diversification and isolated a novel bone marrow resident progenitor which selectively differentiates into CD8α+ conventional dendritic cells (cDCs) in vivo. This progenitor strictly depends on Irf8 expression to properly establish its transcriptional DC program while suppressing a lineage-inappropriate neutrophile program. Moreover, I demonstrated that Irf8 expression during this cDC commitment-step depends on a newly discovered myeloid-specific cis-enhancer which is controlled by the haematopoietic transcription factors PU.1 and RUNX1. Interference with their binding leads to abrogation of Irf8 expression, subsequently to disturbed cell fate decisions, demonstrating the importance of these factors for proper phagocyte cell development. Collectively, these data delineate a transcriptional program establishing cDC fate choice with IRF8 in its center. N2 - Die Differenzierung von hämatopoietischen Zellen ist ein komplexer Prozess, der strikt hierarchisch organisiert ist. Dabei stellen die Phagozyten eine sehr heterogene Zellpopulation dar, mit hochspezialisierten Funktionen im angeborenen Immunsystem sowie während der Initialisierung der adaptiven Immunreaktion. Ihre Entwicklung, ausgehend von einer gemeinsamen Vorläuferzelle, unterliegt einer strikten Kontrolle. Die Beeinträchtigung dieser Linienentscheidungsprogramme, z.B. durch Mutationen oder Änderungen der Expressionslevel von Transkriptionsfaktoren kann Leukämie auslösen. Die molekularen Mechanismen, welche die linienspezifische Entwicklung steuern, sind allerdings noch nicht im Detail bekannt. In dieser Arbeit zeige ich den maßgeblichen Einfluss des Transkriptionsfaktors Interferon Regulierender Faktor 8 (IRF8) auf die Entwicklung von dendritischen Zellen (DC) innerhalb der Phagozyten. Mittels einer IRF8-Reporter Maus stellte ich die sehr differenziellen Expressionsmuster von Irf8 in der hämatopoietischen Entwicklung dar. Dabei konnte ich eine neue, im Knochenmark lokalisierte, Vorläuferpopulation isolieren, die in vivo spezifisch Differenzierung in CD8α+ konventionelle dendritische Zellen (cDC) steuert. Dieser Vorläufer ist dabei absolut von der Expression von Irf8 abhängig und etabliert auf transkriptioneller Ebene die dendritische Zellentwicklung, während gleichzeitig die Entwicklung neutrophiler Zellen unterdrückt wird. Darüber hinaus zeigte ich, dass Irf8 Expression während der cDC Entwicklung von einem neu charakterisierten cis-regulatorischen Enhancer abhängt, der spezifisch in myeloiden Zellen agiert. Ich konnte zeigen, dass die hämatopoietischen Transkriptionfaktoren PU.1 und RUNX1 mittels dieses Enhancers die Irf8 Expression steuern. Können diese beiden Faktoren nicht mit dem Enhancer interagieren, führt das zu stark verminderter Irf8 Expression, damit zu Veränderungen in den Differnzierungsprogrammen der Zellen, was die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus unterstreicht. Zusammengefasst beschreiben diese Daten die Etablierung der frühen cDC Entwicklung, in der IRF8 die zentrale Rolle spielt. KW - Hämatopoiese KW - dendritische Zelle KW - Immunologie KW - Transkiptionsfaktor KW - Genregulation KW - haematopoiesis KW - dendritic cell KW - immunology KW - transcription factor KW - gene regulation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55482 ER - TY - THES A1 - Gätjen, Dominic T1 - A Pichia pastoris surface display system for the efficient screening of high-producing antibody clones N2 - Pichia pastoris (syn. Komagataella phaffi) is a distinguished expression system widely used in industrial production processes. Recent molecular research has focused on numerous approaches to increase recombinant protein yield in P. pastoris. For example, the design of expression vectors and synthetic genetic elements, gene copy number optimization, or co-expression of helper proteins (transcription factors, chaperones, etc.). However, high clonal variability of transformants and low screening throughput have hampered significant success. To enhance screening capacities, display-based methodologies inherit the potential for efficient isolation of producer clones via fluorescence-activated cell sorting (FACS). Therefore, this study focused on developing a novel clone selection method that is based on the non-covalent attachment of Fab fragments on the P. pastoris cell surface to be applicable for FACS. Initially, a P. pastoris display system was developed, which is a prerequisite for the surface capture of secreted Fabs. A Design of Experiments approach was applied to analyze the influence of various genetic elements on antibody fragment display. The combined P. pastoris formaldehyde dehydrogenase promoter (PFLD1), Saccharomyces cerevisiae invertase 2 signal peptide (ScSUC2), - agglutinin (ScSAG1) anchor protein, and the ARS of Kluyveromyces lactis (panARS) conferred highest display levels. Subsequently, eight single-chain variable fragments (scFv) specific for the constant part of the Fab heavy or light chain were individually displayed in P. pastoris. Among the tested scFvs, the anti-human CH1 IgG domain scFv allowed the most efficient Fab capture detected by flow cytometry. Irrespective of the Fab sequence, exogenously added as well as simultaneously secreted Fabs were successfully captured on the cell surface. Furthermore, Fab secretion capacities were shown to correlate to the level of surface-bound Fabs as demonstrated for characterized producer clones. Flow-sorted clones presenting high amounts of Fabs showed an increase in median Fab titers (factor of 21 to 49) compared to unsorted clones when screened in deep-well plates. For selected candidates, improved functional Fab yields of sorted cells vs. unsorted cells were confirmed in an upscaled shake flask production. Since the scFv capture matrix was encoded on an episomal plasmid with inherently unstable autonomously replicating sequences (ARS), efficient plasmid curing was observed after removing the selective pressure. Hence, sorted clones could be immediately used for production without the need to modify the expression host or vector. The resulting switchable display/secretion system provides a streamlined approach for the isolation of Fab producers and subsequent Fab production. KW - Pichia pastoris KW - Antibody Y1 - 2023 ER -