TY  - THES
A1  - Siemiatkowska, Beata
T1  - Redox signalling in plants
N2  - Once proteins are synthesized, they can additionally be modified by post-translational modifications (PTMs). Proteins containing reactive cysteine thiols, stabilized in their deprotonated form due to their local environment as thiolates (RS-), serve as redox sensors by undergoing a multitude of oxidative PTMs (Ox-PTMs). Ox-PTMs such as S-nitrosylation or formation of inter- or intra-disulfide bridges induce functional changes in these proteins. Proteins containing cysteines, whose thiol oxidation state regulates their functions, belong to the so-called redoxome. Such Ox-PTMs are controlled by site-specific cellular events that play a crucial role in protein regulation, affecting enzyme catalytic sites, ligand binding affinity, protein-protein interactions or protein stability. Reversible protein thiol oxidation is an essential regulatory mechanism of photosynthesis, metabolism, and gene expression in all photosynthetic organisms. Therefore, studying PTMs will remain crucial for understanding plant adaptation to external stimuli like fluctuating light conditions. Optimizing methods suitable for studying plants Ox-PTMs is of high importance for elucidation of the redoxome in plants. This study focusses on thiol modifications occurring in plant and provides novel insight into in vivo redoxome of Arabidopsis thaliana in response to light vs. dark. This was achieved by utilizing a resin-assisted thiol enrichment approach. Furthermore, confirmation of candidates on the single protein level was carried out by a differential labelling approach. The thiols and disulfides were differentially labelled, and the protein levels were detected using immunoblot analysis. Further analysis was focused on light-reduced proteins. By the enrichment approach many well studied redox-regulated proteins were identified. Amongst those were fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase) and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) which have previously been described as thioredoxin system targeted enzymes. The redox regulated proteins identified in the current study were compared to several published, independent results showing redox regulated proteins in Arabidopsis leaves, root, mitochondria and specifically S-nitrosylated proteins. These proteins were excluded as potential new candidates but remain as a proof-of-concept to the enrichment experiments to be effective. Additionally, CSP41A and CSP41B proteins, which emerged from this study as potential targets of redox-regulation, were analyzed by Ribo-Seq. The active translatome study of csp41a mutant vs. wild-type showed most of the significant changes at end of the night, similarly as csp41b. Yet, in both mutants only several chloroplast-encoded genes were altered. Further studies of CSP41A and CSP41B proteins are needed to reveal their functions and elucidate the role of redox regulation of these proteins.
N2  - Wenn Proteine synthetisiert sind, können sie zusätzlich noch post-translationelle Modifikationen (PTM) aufweisen. Proteine, die wegen ihres lokalen Umfeldes reaktive Cysteinthiole in ihrer stabilen deprotonierten Thiolat-Form aufweisen, dienen als Redoxsensoren indem sie eine Vielzahl von oxidativen PTMs (Ox-PTMs) enthalten können.  Ox-PTMs wie die S-Nitrosylierung oder die Bildung von Inter- oder Intradisulfidbrücken induzieren funktionelle Veränderungen in diesen Proteinen. Cystein-haltige Proteine, deren Funktion durch diese Thioloxidierung gesteuert werden, gehören zu dem so genannten Redoxom. Die Ox-PTMs werden durch ortsspezifische zelluläre Prozesse gesteuert, die eine essentielle Rolle bei der Proteinregulation spielen und welche das katalytische Zentrum, die Ligandenbindungsaffinität, Protein-Protein-Interaktionen oder die Proteinstabilität beeinflussen können. Die umkehrbare Proteinthioloxidierung ist ein essentieller regulatorischer Mechanismus in der Photosynthese, dem Metabolismus und der Genexpression photosynthetischer Organismen. Es ist demnach wichtig PTMs zu untersuchen, um zu verstehen wie sich Pflanzen an externe Stimuli wie das Licht anpassen können. Es ist von großer Bedeutung für das Redoxom-Forschungsgebiet Methoden zur Untersuchung von pflanzlichen Ox-PTMs zu verbessern. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf Thiolveränderungen, die in Pflanzen auftreten, und gibt einen Einblick in das in vivo Redoxom von Arabidopsis thaliana als Reaktion auf Licht oder Dunkelheit. Dieses wurde ermöglicht durch eine auf Harz-basierende Thiol-Anreicherung. Darüber hinaus konnten Kandidaten auf dem Einzelproteinlevel durch eine Differentialmarkierungsmethode bestätigt werden. Thiole und Disulfide wurden unterschiedlich markiert und die Proteine durch spezifische Antikörper mittels Proteinblotanalyse erkannt. Weitere Analysen fokussierten sich auf im Licht reduzierte Proteine. Durch die Anreicherungsmethode konnten viele bereits untersuchte redox-regulierte Proteine identifiziert werden. Unter diesen waren unter anderem die Fruktose-1,6-Bisphosphatase (FBPase) sowie die Seduheptulose-1,7-Bisphosphatase (SBPase), welche als Thioredoxin-gesteuerte Enzyme beschrieben sind.  Die redox-regulierten Proteine, die in dieser Studie identifiziert werden konnten, wurden mit veröffentlichten unabhängigen Ergebnissen verglichen und dieses führte zu einer Vielzahl an redox-regulierten Proteinen in Arabidopsisblättern, -Wurzeln und -Mitochondrien sowie S-nitrosylierten Proteinen. Diese Proteine wurden zwar als neue potentielle Kandidaten ausgeschlossen, zeigten allerdings die Effektivität der Anreicherungsmethode. Darüber hinaus wurden die Proteine CSP41 A and CSP41 B, welche in dieser Studie als potentielle Ziele der Redox-Regulation identifiziert wurden, durch Ribo-seq analysiert.
T2  - Redoxsignalisierung in Pflanzen
KW  - redox
KW  - signalling
KW  - plants
KW  - enrichments methods
KW  - post-translational modifications
KW  - oxidative protein modifications
KW  - Redox
KW  - Signalübertragung
KW  - Pflanzen
KW  - Anreicherungsmethoden
KW  - posttranslationale Modifikationen
KW  - oxidative Proteinmodifikationen
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-489119
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Mike-Freya
T1  - Die Glutathionperoxidase 2 : physiologische Funktion und Rolle in der Azoxymethan-induzierten Colonkanzerogenese
T1  - The glutathione peroxidase 2 : physiological function and role in azoxymethane-induced colon carcinogenesis
N2  - Das Selenoprotein Glutathionperoxidase 2 (GPx2) ist ein epithelzellspezifisches, Hydroperoxide-reduzierendes Enzym, welches im Darmepithel, vor allem in den proliferierenden Zellen des Kryptengrundes, exprimiert wird. Die Aufrechterhaltung der GPx2-Expression im Kryptengrund auch bei subadäquatem Selenstatus könnte darauf hinweisen, dass sie hier besonders wichtige Funktionen wahrnimmt. Tatsächlich weisen GPx2 knockout (KO)-Mäuse eine erhöhte Apoptoserate im Kryptengrund auf. Ein Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die physiologische Funktion der GPx2 näher zu untersuchen. In Kryptengrundepithelzellen aus dem Colon selenarmer GPx2 KO-Mäuse wurde eine erhöhte Caspase 3/7-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp (WT) festgestellt. Zudem wiesen diese Zellen eine erhöhte Suszeptibilität für oxidativen Stress auf. Die GPx2 gewährleistet also den Schutz der proliferierenden Zellen des Kryptengrundes auch bei subadäquater Selenversorgung. Des Weiteren wurde im Colon selenarmer (-Se) und -adäquater (+Se) GPx2 KO-Mäuse im Vergleich zum WT eine erhöhte Tumornekrosefaktor α-Expression und eine erhöhte Infiltration von Makrophagen festgestellt. Durch Fütterung einer selensupplementierten Diät (++Se) konnte dies verhindert werden. In GPx2 KO-Mäusen liegt demnach bereits basal eine niedriggradige Entzündung vor. Dies unterstreicht, dass GPx2 vor allem eine wichtige antiinflammatorische Funktion im Darmepithel besitzt. Dem Mikronährstoff Selen werden protektive Funktionen in der Colonkanzerogenese zugeschrieben. In einem Mausmodell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese wirkte GPx2 antiinflammatorisch und hemmte so die Tumorentstehung. Auf der anderen Seite wurden jedoch auch prokanzerogene Eigenschaften der GPx2 aufgedeckt. Deshalb sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welchen Effekt ein GPx2 knockout in einem Modell der sporadischen, durch Azoxymethan (AOM) induzierten, Colonkanzerogenese hat. Im WT kam es in präneoplastischen Läsionen häufig zu einer erhöhten GPx2-Expression im Vergleich zur normalen Darmmucosa. Eine derartige Steigerung der GPx2-Expression wurde auch in der humanen Colonkanzerogenese beschrieben. Das Fehlen der GPx2 resultierte in einer verminderten Entstehung von Tumoren (-Se und ++Se) und präneoplastischen Läsionen (-Se und +Se). Somit förderte GPx2 die Tumorentstehung im AOM-Modell. Acht Stunden nach AOM-Gabe war im GPx2 KO-Colon im Vergleich zum WT eine erhöhte Apoptoserate in der Kryptenmitte (-Se, +Se), nicht jedoch im Kryptengrund oder in der ++Se-Gruppe zu beobachten. Möglicherweise wirkte GPx2 prokanzerogen, indem sie die effiziente Elimination geschädigter Zellen in der Tumorinitiationsphase verhinderte. Eine ähnliche Wirkung wäre auch durch die erhöhte GPx2-Expression in der Promotionsphase denkbar. So könnte GPx2 proliferierende präneoplastische Zellen vor oxidativem Stress, Apoptosen, oder auch der Antitumorimmunität schützen. Dies könnte durch ein Zusammenwirken mit anderen Selenoproteinen wie GPx1 und Thioredoxinreduktasen, für die ebenfalls auch prokanzerogene Funktionen beschrieben wurden, verstärkt werden. Eine wichtige Rolle könnte hier die Modulation des Redoxstatus in Tumorzellen spielen. Die Variation des Selengehalts der Diät hatte im WT einen eher U-förmigen Effekt. So traten in der –Se und ++Se-Gruppe tendenziell mehr und größere Tumore auf, als in der +Se Gruppe. Zusammenfassend schützt GPx2 also die proliferierenden Zellen des Kryptengrundes. Sie könnte jedoch auch proliferierende transformierte Zellen schützen und so die sporadische, AOM-induzierte Colonkanzerogenese fördern. In einem Modell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese hatte GPx2 auf Grund ihrer antiinflammatorischen Wirkung einen gegenteiligen Effekt und hemmte die Tumorentstehung. Die Rolle der GPx2 in der Colonkanzerogenese ist also abhängig vom zugrunde liegenden Mechanismus und wird maßgeblich von der Beteiligung einer Entzündung bestimmt.
N2  - The selenoprotein glutathione peroxidase 2 (GPx2) is a hydroperoxide-reducing enzyme that is mainly expressed in the gastrointestinal epithelium, especially in the crypt base were the proliferating cells reside. GPx2 expression is maintained even when the selenium supply is limited, which indicates that GPx2 might have an important function in these cells. Indeed, GPx2 knockout (KO)-mice have an enhanced rate of apoptosis in the crypt base. Therefore one aim of this study was to further elucidate the physiological function of the GPx2. Isolated colonic crypt base epithelial cells of selenium deficient GPx2 KO-mice were found to have a higher caspase 3/7 activity than wild type (wt) cells. Moreover they exhibited an enhanced susceptibility for oxidative stress. Thus GPx2 protects the proliferative crypt base cells of the intestine, especially when the selenium supply is limited. Additionally an enhanced expression of tumor necrosis factor α and an enhanced infiltration of macrophages were detected in the colon of GPx2 KO-mice in comparison to the wt. These effects were observed on a selenium deficient (-Se) and -adequate (+Se) diet, but could be prevented by feeding a selenium supplemented (++Se) diet. Accordingly, GPx2 KO-mice have a basal low grade inflammation. This underlines, that GPx2 has an important anti-inflammatory function in the intestinal epithelium. Selenium deficiency is linked to an increased risk of developing colorectal cancer. In a mouse model of colitis-associated colon carcinogenesis, GPx2 had anti-inflammatory and thus anticarcinogenic effects. However, also procarcinogenic functions of the GPx2 have been observed. Therefore, this study aimed to analyse the role of GPx2 in a model of non-inflammation triggered, sporadic colon carcinogenesis induced by azoxymethane (AOM). In preneoplastic lesions of wt mice, an enhanced expression of GPx2 in comparison to the normal mucosa was frequently observed. An upregulation of GPx2 expression has also been described in human colon carcinogenesis. GPx2 KO mice had less tumors (-Se and ++Se) and less preneoplastic lesions (-Se, +Se) than wt mice. Accordingly GPx2 promotes colon carcinogenesis in the AOM-model. Eight hours after AOM-application, a higher rate of apoptosis was observed in the mid-crypt region of the colon of GPx2 ko mice in comparison to wt mice in the –Se and +Se groups, but not in the ++Se group or in the crypt base. Thus GPx2 might act procarcinogenic by preventing the elimination of cells with DNA-damage in the tumor initiation stage. Similarly, the enhanced GPx2-expression in preneoplastic cells could promote tumorigenesis by protecting these cells from oxidative stress, apoptosis or antitumor immunity. This effect might be enhanced by other selenoproteins like GPx1 or thioredoxin reductases that have also been reported to possess procarcinogenic properties and it might be closely related to the regulation of the redox state of tumor cells. In wt mice, the selenium content of the diet turned out to have a rather U-shaped effect on colon carcinogenesis. In the –Se and ++Se groups, wt mice tended to have more and larger tumors than in the ++Se group. In conclusion, GPx2 protects the proliferating cells of the intestinal crypt base, but it could also protect proliferating transformed cells and thus promote sporadic, AOM-induced colon carcinogenesis. In contrast, GPx2 acted anticarcinogenic in a model of colitis-associated colon carcinogenesis due to its antiinflammatory properties. Thus, the role of GPx2 in colon carcinogenesis depends on the underlying mechanisms, especially on the involvement of an inflammation.
KW  - Glutathionperoxidase
KW  - Selen
KW  - Colonkanzerogenese
KW  - Entzündung
KW  - Redox
KW  - glutathione peroxidase
KW  - selenium
KW  - colon carcinogenesis
KW  - inflammation
KW  - redox
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-66955
ER  -