TY - THES A1 - Krumbholz, Julia T1 - Identification of chemical mediators that regulate the specialized metabolism in Nostoc punctiforme T1 - Identifizierung chemischer Mediatoren, die den spezialisierten Metabolismus in Nostoc punctiforme regulieren N2 - Specialized metabolites, so-called natural products, are produced by a variety of different organisms, including bacteria and fungi. Due to their wide range of different biological activities, including pharmaceutical relevant properties, microbial natural products are an important source for drug development. They are encoded by biosynthetic gene clusters (BGCs), which are a group of locally clustered genes. By screening genomic data for genes encoding typical core biosynthetic enzymes, modern bioinformatical approaches are able to predict a wide range of BGCs. To date, only a small fraction of the predicted BGCs have their associated products identified. The phylum of the cyanobacteria has been shown to be a prolific, but largely untapped source for natural products. Especially multicellular cyanobacterial genera, like Nostoc, harbor a high amount of BGCs in their genomes. A main goal of this study was to develop new concepts for the discovery of natural products in cyanobacteria. Due to its diverse setup of orphan BGCs and its amenability to genetic manipulation, Nostoc punctiforme PCC 73102 (N. punctiforme) appeared to be a promising candidate to be established as a model organism for natural product discovery in cyanobacteria. By utilizing a combination of genome-mining, bioactivity-screening, variations of culture conditions, as well as metabolic engineering, not only two new polyketides were discovered, but also first-time insights into the regulation of the specialized metabolism in N. punctiforme were gained during this study. The cultivation of N. punctiforme to very high densities by utilizing increasing light intensities and CO2 levels, led to an enhanced metabolite production, causing rather complex metabolite extracts. By utilizing a library of CFP reporter mutant strains, each strain reporting for one of the predicted BGCs, it was shown that eight out of 15 BGCs were upregulated under high density (HD) cultivation conditions. Furthermore, it could be demonstrated that the supernatant of an HD culture can increase the expression of four of the influenced BGCs, even under conventional cultivation conditions. This led to the hypothesis that a chemical mediator encoded by one of the affected BGCs is accumulating in the HD supernatant and is able to increase the expression of other BGCs as part of a cell-density dependent regulatory circuit. To identify which of the BGCs could be a main trigger of the presumed regulatory circuit, it was tried to activate four BGCs (pks1, pks2, ripp3, ripp4) selectively by overexpression of putative pathway-specific regulatory genes that were found inside the gene clusters. Transcriptional analysis of the mutants revealed that only the mutant strain targeting the pks1 BGC, called AraC_PKS1, was able to upregulate the expression of its associated BGC. From an RNA sequencing study of the AraC_PKS1 mutant strain, it was discovered that beside pks1, the orphan BGCs ripp3 and ripp4 were also upregulated in the mutant strain. Furthermore, it was observed that secondary metabolite production in the AraC_PKS1 mutant strain is further enhanced under high-light and high-CO2 cultivation conditions. The increased production of the pks1 regulator NvlA also had an impact on other regulatory factors, including sigma factors and the RNA chaperone Hfq. Analysis of the AraC_PKS1 cell and supernatant extracts led to the discovery of two novel polyketides, nostoclide and nostovalerolactone, both encoded by the pks1 BGC. Addition of the polyketides to N. punctiforme WT demonstrated that the pks1-derived compounds are able to partly reproduce the effects on secondary metabolite production found in the AraC_PKS1 mutant strain. This indicates that both compounds are acting as extracellular signaling factors as part of a regulatory network. Since not all transcriptional effects that were found in the AraC_PKS1 mutant strain could be reproduced by the pks1 products, it can be assumed that the regulator NvlA has a global effect and is not exclusively specific to the pks1 pathway. This study was the first to use a putative pathway specific regulator for the specific activation of BGC expression in cyanobacteria. This strategy did not only lead to the detection of two novel polyketides, it also gave first-time insights into the regulatory mechanism of the specialized metabolism in N. punctiforme. This study illustrates that understanding regulatory pathways can aid in the discovery of novel natural products. The findings of this study can guide the design of new screening strategies for bioactive compounds in cyanobacteria and help to develop high-titer production platforms for cyanobacterial natural products. N2 - Sekundärmetabolite, auch Naturstoffe genannt, werden von einer Vielzahl an Organismen, darunter Bakterien und Pilzen, hergestellt. Aufgrund ihrer Vielzahl an verschiedenen Bioaktivitäten, einschließlich pharmakologisch relevanter Wirkungen, sind mikrobielle Naturstoffe eine wichtige Grundlage für die Arzneimittelentwicklung. Naturstoffe werden durch eine Ansammlung lokal gruppierter Gene, sogenannten Biosynthese-Genclustern (BGC), im Genom kodiert. Moderne bioinformatische Methoden durchsuchen Genom-Daten nach Genen, die typische biosynthetische Enzyme kodieren. Auf Grundlage dessen können verschiedenste BGCs vorhergesagt werden. Bislang konnte allerdings nur für einen kleinen Teil der vorhergesagten BGCs das dazugehörige Produkt identifiziert und charakterisiert werden. Cyanobakterien sind nachweislich eine reichhaltige, aber weitestgehend unerschlossene Quelle für Naturstoffe. Insbesondere mehrzellige Gattungen, wie Nostoc, tragen eine Vielzahl an BGCs in ihren Genomen. Ein Hauptziel dieser Studie war es, neue Konzepte für die Entdeckungen von Naturstoffen in Cyanobakterien zu entwickeln. Nostoc punctiforme PCC 73102 (N. punctiforme) erwies sich als besonders geeigneter Stamm für diese Aufgabe, da er eine Vielzahl weitestgehend ununtersuchter Gencluster besitzt und zugänglich für genetische Modifikationen ist. Eine Kombination aus Genome Mining, Bioaktivitäts-Screening, verschiedenen Kultivierungsbedingungen und Metabolic Engineering führte zur Entdeckung zweier neuer Polyketide und gewährte im Verlauf der Studie erstmals Einblicke in den spezialisierten Metabolismus von N. punctiforme. Die Kultivierung von N. punctiforme in sehr hohen Zelldichten, ermöglicht durch sehr hohe Lichtintensitäten und erhöhte CO2-Verfügbarkeit, führte zu einer verstärkten Metabolitproduktion und komplexen Metabolitextrakten. Unter Verwendung einer Bibliothek von CFP-Reportermutanten, bei der jede Mutante eines der vorhergesagten BGCs repräsentiert, konnte gezeigt werden, dass 8 von 15 BGCs unter Hochzelldichte-Kultivierungsbedingungen hochreguliert wurden. Zudem zeigte sich, dass der Überstand einer dichten Kultur, auch unter konventionellen Kultivierungsbedingungen, vier der regulierten BGCs beeinflussen kann. Dies lässt vermuten, dass sich unter Hochzelldichte-Kultivierungsbedingungen ein chemischer Mediator, welcher von einem der beeinflussten BGCs produziert wird, im Überstand anhäuft und die Expression anderer BGCs als Teil eines zelldichte-abhängigen Regelkreises kontrollieren kann. Um herauszufinden, welches der BGCs ein Hauptauslöser des vermuteten Regelkreises sein könnte, wurde versucht die Expression von vier BGCs (pks1, pks2, ripp3, ripp4) mittels Überexpression von potentiell biosynthese-spezifischen regulatorischen Genen zu aktivieren. Eine transkriptionelle Analyse der Mutanten ergab, dass nur der Stamm, welcher das pks1 BGC aktivieren sollte (AraC_PKS1), einen positiven Effekt auf die Expression des zu erwartenden BGCs hatte. Eine RNA-Sequenzierungsstudie ergab, dass in der AraC_PKS1 Mutante neben dem pks1 BGC auch die kryptischen BGCs ripp3 und ripp4 eine erhöhte Transkription aufwiesen. Zudem wurde beobachtet, dass sich die Sekundärmetabolitproduktion in der Mutante durch Kultivierung unter erhöhten Licht-Intensitäten und CO2-Leveln erweitern lässt. Unabhängig von den Kultivierungsbedingungen, hat die erhöhte Produktion des pks1 Regulators NvlA in der Mutante einen Einfluss auf andere regulatorische Faktoren, wie Sigma-Faktoren und das RNA-Chaperon Hfq. Die Analyse des Zell- und Überstandsextrakts der AraC_PKS1 Mutante führte zur Entdeckung zweier neuer Polyketide, Nostoclid und Nostovalerolacton, welche beide vom pks1 BGC codiert werden. Die Zugabe dieser Polyketide zum N. punctiforme Wildtyp zeigte, dass diese in der Lage sind einen Teil der Sekundärmetabolit-Effekte der AraC_PKS1 Mutante zu reproduzieren. Dies lässt darauf schließen, dass beide Polyketide als Signalstoffe innerhalb eines regulatorischen Netzwerks agieren. Da nicht alle transkriptionellen Effekte der AraC_PKS1 Mutante durch die Zugabe der pks1 Produkte reproduziert werden konnten, ist anzunehmen, dass der Regulator NvlA einen globalen Effekt hat und nicht ausschließlich die pks1 Biosynthese reguliert. Diese Studie war die erste, welche einen potentiell biosynthese-spezifischen Regulator für die gezielte Aktivierung von BGC-Expression in Cyanobakterien verwendet hat. Diese Strategie führte neben der Entdeckung zweier neuer Polyketide, zu ersten Einblicken in den regulatorischen Mechanismus, der den spezialisierten Metabolismus in N. punctiforme kontrolliert. Diese Studie veranschaulicht, dass das Verstehen regulatorischer Mechanismen für die Entdeckung neuer Naturstoffe hilfreich sein kann. Die Studien-Ergebnisse können die Entwicklung neuer Screening-Strategien für bioaktive Metabolite in Cyanobakterien anregen und können dabei helfen Hochtiter-Produktionsplattformen für cyanobakterielle Naturstoffe zu entwickeln. KW - cyanobacteria KW - natural products KW - specialized metabolites KW - gene cluster activation KW - Nostoc punctiforme KW - Cyanobakterien KW - Sekundärmetabolite KW - Naturstoffe KW - Gencluster-Aktivierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-540240 ER - TY - THES A1 - Dehm, Daniel T1 - Development of concepts for the genomic mining of novel secondary metabolites in symbiotic cyanobacteria N2 - Naturstoffe sind seit der goldenen Ära der Antibiotika von immer größerem Interesse, sowohl für die Grundlagenforschung als auch die Angewandten Wissenschaften, da sie die Hauptquelle für neuartige Pharmazeutika mit starken antibiotischen, anti-entzündlichen und Antitumor-Aktivitäten darstellen. Neben den technologischen Fortschritten im Bereich der Hochdurchsatz Genomsequenzierung und dem verbesserten Verständnis des modularen Aufbaus der Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten, kam es auch zu einem Wechsel vom labor-gestützten Screening aktiver Zellextrakte hin zum Algorithmen-basierten in silico Screening nach neuen Naturstoff-Biosyntheseclustern. Obwohl die steigende Zahl verfügbarer Genomsequenzen zeigte, dass nicht-ribosomale Peptid-Synthetasen (NRPS), Polyketid-Synthasen (PKS), und ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) ubiquitär in allen Sparten des Lebens gefunden werden können, so zeigen einige Phyla wie Actinobakterien oder Cyanobakterien eine besonders hohe Dichte an Sekundärmetabolitclustern. Der fakultativ symbiotische, N2-fixierende Modellorganismus N. punctiforme PCC73102 ist ein terrestrisches typ-IV Cyanobakterium, welches nicht nur einen besonders hohen Anteil seines Genoms der Produktion von Sekundärmetaboliten widmet, sondern zusätzlich noch genetisch modifizierbar ist. Eine AntiSMASH Analyse des Genoms zeigte, dass N. punctiforme insgesamt sechzehn potentielle Sekundärmetabolitcluster besitzt, von denen aber bis heute nur zweien ein spezifisches Produkt zugewiesen werden konnte. Das macht N. punctiforme zu einem perfekten Testorganismus für die Entwicklung eines neuartigen kombinatorischen Genomic Mining Ansatzes zur Detektion von bislang unbeschriebenen Naturstoffen. Der neuartige Ansatz, der im Rahmen dieser Studie entwickelt wurde, stellt eine Kombination aus Genomic Mining, unabhängigen Monitoring-Techniken sowie modifizierten Kultivierungsbedingungen dar und führte nicht nur zu neuen Erkenntnissen im Bereich cyanobakterieller Naturstoffsynthese, sondern letztlich auch zur Entdeckung eines neuen, von N. punctiforme produzierten, Naturstoffs. Die Herstellung und Untersuchung einer Reporterstamm Bibliothek, bestehend aus je einem CFP-produzierenden Transkriptionsreporter für jedes der sechzehn Sekundärmetabolitcluster von N. punctiforme, zeigte, dass im Gegensatz zur Erwartung nicht alle Biosynthesecluster für die man kein Produkt nachweisen kann auch nicht exprimiert werden. Stattdessen konnten klar definierbare Expressionsmuster beschrieben werden, was deutlich machte, dass die Naturstoffproduktion einer engen Regulation unterliegt und nur ein kleiner Teil der Biosynthesecluster unter Standardbedingungen tatsächlich still sind. Darüber hinaus führte die Erhöhung der Lichtintensität sowie der Kohlenstoffdioxid-Verfügbarkeit zusammen mit der Kultivierung von N. punctiforme zu extrem hohen Zelldichten zu einer starken Erhöhung der gesamten metabolischen Aktivität des Organismus. Nähere Untersuchungen der Zellextrakte dieser hoch-dichte Kultivierungen führten letztlich zur Entdeckung einer neuartigen Gruppe von Microviridinen mit verlängerter Peptidsequenz, welche Microviridin N3-N9 genannt wurden. Sowohl die Kultivierung der Transkriptionsreporter als auch die RTqPCR-basierte Untersuchung der Transkriptionslevel der verschiedenen Biosynthesecluster zeigten, dass die hoch-Zelldichte Kultivierung von N. punctiforme zu einer Aktivierung von 50% der vorhandenen Sekundärmetabolitcluster führt. Im Gegensatz zu dieser sehr breit-gefächerten Aktivierung, führt die Co-Kultivierung von N. punctiforme in chemischen oder physischen Kontakt zu einer N-gehungerten Wirtspflanze (Blasia pusilla) zu einer sehr spezifischen Aktivierung der RIPP4 und RiPP3 Biosynthesecluster. Obwohl dieser Effekt mittels verschiedener unabhängiger Methoden bestätigt werden konnte und trotz intensiver Analysebemühungen, konnte jedoch keinem der beiden Cluster ein Produkt zugeordnet werden. Diese Studie stellt die erste weitreichende, systematische Analyse eines cyanobakteriellen Sekundärmetaboloms durch einen kombinatorischen Ansatz aus Genomic Mining und unabhängigen Monitoring-Techniken dar und kann als neue strategische Herangehensweise für die Untersuchung anderer Organismen hinsichtlich ihrer Sekundärmetabolit-Produktion dienen. Obwohl es bereits gut beschriebene einzelne Sekundärmetabolite gibt, wie beispielweise den Zelldifferenzierungsfaktor PatS in Anabaena sp. PCC7120, so ist der Grad an Regulation der in dieser Studie gezeigt werden konnte bislang beispiellos und die Entschlüsselung dieser Mechanismen könnte die Entdeckung neuer Naturstoffe stark beschleunigen. Daneben lassen die Ergebnisse aber auch darauf schließen, dass die Induktion der Biosynthesewege nicht das eigentliche Problem darstellt, sondern vielmehr die verlässliche Detektion deren Produkte. Die Erarbeitung neuer Analytik-Strategien könnte somit auch einen deutlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Entdeckung neuer Naturstoffe haben. N2 - Since the golden era of antibiotics natural products are of ever growing interest to both basic research and applied sciences as they are the main source of new bioactive compounds delivering lead structures for new pharmaceuticals with potent antibiotic, anti-inflammatory or anti-cancer activities. Alongside the technological advances in high-throughput genome sequencing and the better understanding of the general organization of those modular biosynthetic assembly lines of secondary metabolites, there was also a shift from wet-lab screening of active cell extracts towards algorithm-based in silico screening for new natural product biosynthesis gene clusters (BGCs). Although the increasing availability of full genome sequences revealed that such non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), polyketide synthases (PKS) and ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) can be found in all three kingdoms of life, certain phyla like actinobacteria and cyanobacteria show a very high density of these secondary metabolite BGCs. The facultative symbiotic, N2-fixing model organism N. punctiforme PCC73102 is a terrestrial type IV cyanobacterium that not only dedicates are very large fraction of its genome to secondary metabolite production but is also amenable to genetic modification. AntiSMASH analysis of the genome showed that there are sixteen potential secondary metabolite BGCs encoded in N. punctiforme, but until now there were only two compounds assigned to their respective BGC leaving the remaining fourteen orphan. This makes the organism a perfect subject for the establishment of a novel combinatorial genomic mining approach for the detection of new natural products. In the course of this study a combinatorial approach of genomic mining, independent monitoring techniques and alteration of cultivation conditions lead to new insights in cyanobacterial natural product biosynthesis and ultimately to the description of a novel compound produced by N. punctiforme. With the generation and investigation of a reporter strain library consisting of CFP-producing transcriptional reporter mutants for every predicted secondary metabolite BGC of N. punctiforme, it could be shown that natural product expression is in fact not silent for all those BGCs where no compound can be detected. Instead several distinct expression patterns could be described highlighting that secondary metabolite production is under tight regulation and only a minor fraction of these BGCs is in fact silent under standard laboratory conditions. Furthermore, increasing light intensity and carbon dioxide availability and cultivating N. punctiforme to very high cell densities had a tremendous impact on the overall metabolic activity of the organism. Investigation of high density cultivated cell extracts ultimately lead to the detection of a so far undescribed set of microviridins with unusual extended peptide sequences named Microviridin N3 – N9. Both cultivation of the transcriptional reporter mutants as well as RTqPCR-based detection of secondary metabolite BGC transcription levels revealed that in fact 50% of N. punctiforme’s natural product BGCs are upregulated under high cell density conditions. In contrast to this very broad response, co-cultivation of N. punctiforme in chemical or physical contact with a N-deprived host plant (Blasia pusilla) lead to a very specific upregulation of two natural product BGCs, namely RIPP3 and RIPP4. Although this response could be confirmed by various independent monitoring techniques and heavy analytical efforts were spent, no compound could be assigned to either of these BGCs. This study is the first in-depth systematic investigation of a cyanobacterial secondary metabolome by a combinatorial approach of genome mining and independent monitoring techniques that can serve as a new strategic approach to gain further insight into natural product synthesis of various organisms. Although there are single well described examples of secondary metabolites like the cell differentiation factor PatS in Anabaena sp. strain PCC 7120, the level and extent of regulation observed in this study is unprecedented and understanding of these mechanisms might be the key to streamline natural product discovery. However, the results of this study also highlight that induction of secondary metabolite BGCs is not the real challenge. Instead the new insights point towards analytical issues being a severe hurdle and finding reliable strategies to overcome these problems might as well drive natural product discovery. T2 - Entwicklung von Konzepten für das Genomic Mining von neuartigen Sekundärmetaboliten in symbiotischen Cyanobakterien KW - Cyanobacteria KW - Cyanobakterien KW - Natural Products KW - Naturstoffe KW - Genomic Mining KW - Secondary Metabolites KW - Sekundärmetabolite KW - Nostoc punctiforme Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-478342 ER -