TY  - THES
A1  - Martínez Guajardo, Alejandro
T1  - New zwitterionic polymers for antifouling applications
T1  - Neue zwitterionische Polymere für Antifouling-Anwendungen
N2  - The remarkable antifouling properties of zwitterionic polymers in controlled environments are often counteracted by their delicate mechanical stability. In order to improve the mechanical stabilities of zwitterionic hydrogels, the effect of increased crosslinker densities was thus explored. In a first approach, terpolymers of zwitterionic monomer 3-[N -2(methacryloyloxy)ethyl-N,N-dimethyl]ammonio propane-1-sulfonate (SPE), hydrophobic monomer butyl methacrylate (BMA), and photo-crosslinker 2-(4-benzoylphenoxy)ethyl methacrylate (BPEMA) were synthesized. Thin hydrogel coatings of the copolymers were then produced and photo-crosslinked. Studies of the swollen hydrogel films showed that not only the mechanical stability but also, unexpectedly, the antifouling properties were improved by the presence of hydrophobic BMA units in the terpolymers.

Based on the positive results shown by the amphiphilic terpolymers and in order to further test the impact that hydrophobicity has on both the antifouling properties of zwitterionic hydrogels and on their mechanical stability, a new amphiphilic zwitterionic methacrylic monomer, 3-((2-(methacryloyloxy)hexyl)dimethylammonio)propane-1-sulfonate (M1), was synthesized in good yields in a multistep synthesis. Homopolymers of M1 were obtained by free-radical polymerization. Similarly, terpolymers of M1, zwitterionic monomer SPE, and photo-crosslinker BPEMA were synthesized by free-radical copolymerization and thoroughly characterized, including its solubilities in selected solvents.

Also, a new family of vinyl amide zwitterionic monomomers, namely 3-(dimethyl(2-(N -vinylacetamido)ethyl)ammonio)propane-1-sulfonate (M2), 4-(dimethyl(2-(N-vinylacetamido)ethyl)ammonio)butane-1-sulfonate (M3), and 3-(dimethyl(2-(N-vinylacetamido)ethyl)ammonio)propyl sulfate (M4), together with the new photo-crosslinker 4-benzoyl-N-vinylbenzamide (M5) that is well-suited for copolymerization with vinylamides, are introduced within the scope of the present work. The monomers are synthesized with good yields developing a multistep synthesis. Homopolymers of the new vinyl amide zwitterionic monomers are obtained by free-radical polymerization and thoroughly characterized. From the solubility tests, it is remarkable that the homopolymers produced are fully soluble in water, evidence of their high hydrophilicity. Copolymerization of the vinyl amide zwitterionic monomers, M2, M3, and M4 with the vinyl amide photo-crosslinker M5 proved to require very specific polymerization conditions. Nevertheless, copolymers were successfully obtained by free-radical copolymerization under appropriate conditions.

Moreover, in an attempt to mitigate the intrinsic hydrophobicity introduced in the copolymers by the photo-crosslinkers, and based on the proven affinity of quaternized diallylamines to copolymerize with vinyl amides, a new quaternized diallylamine sulfobetaine photo-crosslinker 3-(diallyl(2-(4-benzoylphenoxy)ethyl)ammonio)propane-1-sulfonate (M6) is synthesized. However, despite a priori promising copolymerization suitability, copolymerization with the vinyl amide zwitterionic monomers could not be achieved.
N2  - Die hervorragenden Antifouling-Eigenschaften zwitterionischer Polymere in kontrollierten Bedingungen werden häufig durch ihre geringe mechanische Stabilität beeinträchtigt. Um die mechanische Eigenschaften zwitterionischer Hydrogele zu verbessern, wurde daher der Effekt einer erhöhten Vernetzungsdichte untersucht. In einem ersten Ansatz wurden Terpolymere aus dem zwitterionischen Monomer 3-[N -2(Methacryloyloxy)ethyl-N,N-dimethyl]ammonio propan-1-sulfonat (SPE), dem hydrophoben Monomer Butylmethacrylat (BMA) und dem Photovernetzer 2-(4-Benzoylphenoxy)ethylmethacrylat (BPEMA) synthetisiert. Daraufhin wurden dünne Beschichtungen der Copolymere hergestellt und photovernetzt. Die Untersuchung der gequollenen Hydrogelfilme zeigte, dass nicht nur die mechanischen Eigenschaften, sondern überraschenderweise auch die Antifouling-Eigenschaften der Hydrogele durch den Einbau von hydrophoben BMA-Einheiten in die Terpolymere verbessert wurden. 

Aufgrund der positiven Ergebnisse der amphiphilen Terpolymere und um die Auswirkungen der Hydrophobie sowohl auf die Antifouling- als auch auf die mechanische Eigenschaften der zwitterionischen Hydrogele zu testen, wurde ein neues amphiphiles zwitterionisches Methacrylat, nämlich 3-((2-(Methacryloyloxy)hexyl)dimethylammonio)propan-1-sulfonat (M1), in guter Ausbeute synthetisiert. Homopolymere von M1 wurden durch radikalische Polymerisation erhalten. In ähnlicher Weise wurden Terpolymere aus M1, dem zwitterionischen Monomer SPE und dem Photovernetzer BPEMA durch radikalische Copolymerisation synthetisiert und gründlich charakterisiert, einschließlich ihrer Löslichkeiten in ausgewählten Lösungsmitteln. 

Außerdem wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine neue Familie von zwitterionischen Vinylamidmonomeren, nämlich 3-(Dimethyl(2-(N-vinylacetamido)ethyl)ammonio)propan-1-sulfonat (M2), 4-(Dimethyl(2-(N -vinylacetamido)ethyl)ammonio)butan-1-sulfonat (M3) und 3-(Dimethyl(2-(N -vinylacetamido)ethyl)ammonio)propylsulfat (M4), zusammen mit einem geeigneten Vinylamid-Photovernetzer, nämlich 4-Benzoyl-N -vinylbenzamide (M5) entwickelt. Die Monomere wurden in einer Mehrstufen-Synthese mit guten Ausbeuten synthetisiert. Homopolymere der neuen zwitterionischen Vinylamidmonomere wurden durch radikalische Polymerisation erhalten und eingehend charakterisiert. Die Löslichkeitstests zeigen, dass die hergestellten Homopolymere bemerkenswerterweise vollständig in reinem Wasser löslich sind, was ihre hohe Hydrophilie beweist. Die Copolymerisation der zwitterionischen Vinylamidmonomere M2, M3 und M4 mit dem Vinylamid-Photovernetzer M5 erwies sich als schwierig. Die Copolymere lassen sich dennoch unter sehr spezifische Bedingungen durch radikalische Copolymerisation herstellen. 

Des Weiteren, um die durch die Photovernetzer in die Copolymere eingebrachte inhärente Hydrophobie zu mindern und aufgrund ihrer nachgewiesenen Affinität zur Copolymerisation mit Vinylamiden, wurde ein neuer quaternisierter Diallylaminsulfobetain-Photovernetzer 3-(Diallyl(2-(4-benzoylphenoxy)ethyl)ammonio)propan-1-sulfonat (M6) synthetisiert. Trotz a priori vielversprechender Copolymerisationseignung konnte jedoch keine Copolymerisation mit den zwitterionischen Vinylamidmonomeren erreicht werden.
KW  - antifouling
KW  - Antifouling
KW  - copolymers
KW  - Copolymere
KW  - hydrogels
KW  - Hydrogele
KW  - zwitterions
KW  - Zwitterionen
KW  - synthesis
KW  - Synthese
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-626820
ER  - 
TY  - THES
A1  - Folikumah, Makafui Yao
T1  - Stimuli-promoted in situ formation of hydrogels with thiol/thioester containing peptide precursors
T1  - Stimuli-induzierte In-Situ-Bildung von Hydrogelen durch Peptid-Prekursor mit Thiol/Thioestergruppen
N2  - Hydrogels are potential synthetic ECM-like substitutes since they provide functional and structural similarities compared to soft tissues. They can be prepared by crosslinking of macromolecules or by polymerizing suitable precursors. The crosslinks are not necessarily covalent bonds, but could also be formed by physical interactions such as π-π interactions, hydrophobic interactions, or H-bonding. On demand in situ forming hydrogels have garnered increased interest especially for biomedical applications over preformed gels due to the relative ease of in vivo delivery and filling of cavities. The thiol-Michael addition reaction provides a straightforward and robust strategy for in situ gel formation with its fast reaction kinetics and ability to proceed under physiological conditions. The incorporation of a trigger function into a crosslinking system becomes even more interesting since gelling can be controlled with stimulus of choice. The use of small molar mass crosslinker precursors with active groups orthogonal to thiol-Michael reaction type electrophile provides the opportunity to implement an on-demand in situ crosslinking without compromising the fast reaction kinetics.
It was postulated that short peptide sequences due to the broad range structural-function relations available with the different constituent amino acids, can be exploited for the realisation of stimuli-promoted in situ covalent crosslinking and gelation applications. The advantages of this system over conventional polymer-polymer hydrogel systems are the ability tune and predict material property at the molecular level.
The main aim of this work was to develop a simplified and biologically-friendly stimuli-promoted in situ crosslinking and hydrogelation system using peptide mimetics as latent crosslinkers. The approach aims at using a single thiodepsipeptide sequence to achieve separate pH- and enzyme-promoted gelation systems with little modification to the thiodepsipeptide sequence. The realization of this aim required the completion of three milestones. 
In the first place, after deciding on the thiol-Michael reaction as an effective in situ crosslinking strategy, a thiodepsipeptide, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) with expected propensity towards pH-dependent thiol-thioester exchange (TTE) activation, was proposed as a suitable crosslinker precursor for pH-promoted gelation system. Prior to the synthesis of the proposed peptide-mimetic, knowledge of the thiol-Michael reactivity of the would-be activated thiol moiety SH-Leu, which is internally embedded in the thiodepsipeptide was required. In line with pKa requirements for a successful TTE, the reactivity of a more acidic thiol, SH-Phe was also investigated to aid the selection of the best thiol to be incorporated in the thioester bearing peptide based crosslinker precursor. Using ‘pseudo’ 2D-NMR investigations, it was found that only reactions involving SH-Leu yielded the expected thiol-Michael product, an observation that was attributed to the steric hindrance of the bulkier nature of SH-Phe. The fast reaction rates and complete acrylate/maleimide conversion obtained with SH-Leu at pH 7.2 and higher aided the direct elimination of SH-Phe as a potential thiol for the synthesis of the peptide mimetic. 
Based on the initial studies, for the pH-promoted gelation system, the proposed Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH was kept unmodified. The subtle difference in pKa values between SH-Leu (thioester thiol) and the terminal cysteamine thiol from theoretical conditions should be enough to effect a ‘pseudo’ intramolecular TTE. In polar protic solvents and under basic aqueous conditions, TDP successfully undergoes a ‘pseudo’ intramolecular TTE reaction to yield an α,ω-dithiol tripeptide, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH. The pH dependence of thiolate ion generation by the cysteamine thiol aided the incorporation of the needed stimulus (pH) for the overall success of TTE (activation step) – thiol-Michael addition (crosslinking) strategy. 
Secondly, with potential biomedical applications in focus, the susceptibility of TDP, like other thioesters, to intermolecular TTE reaction was probed with a group of thiols of varying thiol pKa values, since biological milieu characteristically contain peptide/protein thiols. L-cysteine, which is a biologically relevant thiol, and a small molecular weight thiol, methylthioglycolate both with relatively similar thiol pKa, values, led to an increase concentration of the dithiol crosslinker when reacted with TDP. In the presence of acidic thiols (p-NTP and 4MBA), a decrease in the dithiol concentration was observed, an observation that can be attributed to the inability of the TTE tetrahedral intermediate to dissociate into exchange products and is in line with pKa requirements for successful TTE reaction. These results additionally makes TDP more attractive and the potentially the first crosslinker precursor for applications in biologically relevant media. 
Finally, the ability of TDP to promote pH-sensitive in situ gel formation was probed with maleimide functionalized 4-arm polyethylene glycol polymers in tris-buffered media of varying pHs. When a 1:1 thiol: maleimide molar ratio was used, TDP-PEG4MAL hydrogels formed within 3, 12 and 24 hours at pH values of 8.5, 8.0 and 7.5 respectively. However, gelation times of 3, 5 and 30 mins were observed for the same pH trend when the thiol: maleimide molar was increased to 2:1. 
A direct correlation of thiol content with G’ of the gels at each pH could also be drawn by comparing gels with thiol: maleimide ratios of 1:1 to those with 2:1 thiol: maleimide mole ratios. This is supported by the fact that the storage modulus (G') is linearly dependent on the crosslinking density of the polymer. The values of initial G′ for all gels ranged between (200 – 5000 Pa), which falls in the range of elasticities of certain tissue microenvironments for example brain tissue 200 – 1000 Pa and adipose tissue (2500 – 3500 Pa). 
Knowledge so far gained from the study on the ability to design and tune the exchange reaction of thioester containing peptide mimetic will give those working in the field further insight into the development of new sequences tailored towards specific applications. 
TTE substrate design using peptide mimetic as presented in this work has revealed interesting new insights considering the state-of-the-art. Using the results obtained as reference, the strategy provides a possibility to extend the concept to the controlled delivery of active molecules needed for other robust and high yielding crosslinking reactions for biomedical applications. Application for this sequentially coupled functional system could be seen e.g. in the treatment of inflamed tissues associated with urinary tract like bladder infections for which pH levels above 7 were reported. By the inclusion of cell adhesion peptide motifs, the hydrogel network formed at this pH could act as a new support layer for the healing of damage epithelium as shown in interfacial gel formation experiments using TDP and PEG4MAL droplets.
The versatility of the thiodepsipeptide sequence, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) was extended for the design and synthesis of a MMP-sensitive 4-arm PEG-TDPo conjugate. The purported cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond yields active thiol units for subsequent reaction of orthogonal Michael acceptor moieties. One of the advantages of stimuli-promoted in situ crosslinking systems using short peptides should be the ease of design of required peptide molecules due to the predictability of peptide functions their sequence structure. Consequently the functionalisation of a 4-arm PEG core with the collagenase active TDPo sequence yielded an MMP-sensitive 4-arm thiodepsipeptide-PEG conjugate (PEG4TDPo) substrate. 
Cleavage studies using thiol flourometric assay in the presence of MMPs -2 and -9 confirmed the susceptibility of PEG4TDPo towards these enzymes. The resulting time-dependent increase in fluorescence intensity in the presence of thiol assay signifies the successful cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond as expected. It was observed that the cleavage studies with thiol flourometric assay introduces a sigmoid non-Michaelis-Menten type kinetic profile, hence making it difficult to accurately determine the enzyme cycling parameters, kcat and KM .  
Gelation studies with PEG4MAL at 10 % wt. concentrations revealed faster gelation with MMP-2 than MMP-9 with 28 and 40 min gelation times respectively. Possible contributions by hydrolytic cleavage of PEG4TDPo has resulted in the gelation of PEG4MAL blank samples but only after 60 minutes of reaction. From theoretical considerations, the simultaneous gelation reaction would be expected to more negatively impact the enzymatic than hydrolytic cleavage. The exact contributions from hydrolytic cleavage of PEG4TDPo would however require additional studies. 
In summary this new and simplified in situ crosslinking system using peptide-based crosslinker precursors with tuneable properties exhibited in situ crosslinking gelation kinetics on similar levels with already active dithiols reported. The advantageous on-demand functionality associated with its pH-sensitivity and physiological compatibility makes it a strong candidate worth further research as biomedical applications in general and on-demand material synthesis is concerned. 
Results from MMP-promoted gelation system unveils a simple but unexplored approach for in situ synthesis of covalently crosslinked soft materials, that could lead to the development of an alternative pathway in addressing cancer metastasis by making use of MMP overexpression as a trigger. This goal has so far not being reach with MMP inhibitors despite the extensive work this regard.
N2  - Hydrogele sind synthetische, potenziell ECM-ähnliche Substituenten, die funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit Weichteilgeweben aufweisen. Sie können durch Vernetzung von Makromolekülen oder durch Polymerisation geeigneter Precursoren hergestellt werden. Die Vernetzungen müssen nicht unbedingt aus kovalenten Bindungen bestehen, sondern können auch durch physikalische Wechselwirkungen wie π-π-Wechselwirkungen, hydrophoben Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brückenbindungen entstehen. In-situ-Hydrogele, die on-demand gebildet werden, haben vor allem für biomedizinische Anwendungen gegenüber vorgefertigten Gelen zunehmend an Interesse gewonnen, da sie relativ einfach in-vivo eingebracht und somit Fehlstellen gefüllt werden können. Die Thiol-Michael-Additionsreaktion bietet mit ihrer schnellen Reaktionskinetik und ihrer Fähigkeit, unter physiologischen Bedingungen abzulaufen, eine unkomplizierte und robuste Strategie für die in-situ-Gelbildung. Der Einbau einer Triggerfunktion in ein Vernetzungssystem ist besonders interessant, da die Gelierung durch einen gewählten Stimulus gesteuert werden kann. Die Verwendung eines Precursors mit geringer Molmasse und aktiven Gruppen, die orthogonal zu den Elektrophilen des Thiol-Michael-Reaktionstyps sind, bietet die Möglichkeit, eine bedarfsgesteuerte in-situ-Vernetzung zu realisieren, ohne die schnelle Reaktionskinetik zu beeinträchtigen.
Es wurde postuliert, dass kurze Peptidsequenzen aufgrund der weitreichenden Struktur-Funktions-Beziehungen, die mit den verschiedenen konstituierenden Aminosäuren zur Verfügung stehen, für die Realisierung von Stimulus-ausgelösten, in-situ kovalenten Vernetzungs- und Gelierungsanwendungen genutzt werden können. Die Vorteile dieses Systems gegenüber herkömmlichen Polymer-Polymer-Hydrogelsystemen liegen in der Möglichkeit, die Materialeigenschaften auf molekularer Ebene zu justieren und vorherzusagen.

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vereinfachten und biologisch-geeigneten, stimulierungsgeförderten in-situ-Vernetzungs- und Hydrogelierungssystems unter Verwendung von Peptidmimetika als latente Vernetzer. Der Ansatz zielt darauf ab, eine einzige Thiodepsipeptidsequenz zu verwenden, um getrennte pH- und enzymausgelöste Gelierungssysteme mit geringen Modifikationen der Thiodepsipeptidsequenz zu erreichen. Zur Verwirklichung dieses Ziels, mussten drei Meilensteine erreicht werden. 
Nach der Wahl der Thiol-Michael-Reaktion als in-situ-Vernetzungsstrategie, musste ein Thiodepsipeptid, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) mit einer zu erwartenden Neigung zu einer pH-abhängigen Thiol-Thioester-Austausch-Aktivierung (TTE), als geeignetem Vernetzer-Precursor für das pH-unterstützte Gelierungssystem designt werden. Vor der Synthese dieses Peptid-Mimetikums war die Untersuchung der Thiol-Michael-Reaktivität der potenziell aktivierten Thiolkomponente SH-Leu erforderlich, die intern in das Thiodepsipeptid eingebettet ist. In Übereinstimmung mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE wurde auch die Reaktivität eines saureren Thiols, SH-Phe, untersucht, um die Auswahl des besten Thiols zu ermöglichen, das in den Thioester-tragenden Peptid-basierten Vernetzer-Precursor eingebaut werden sollte. Pseudo-2D-NMR-Untersuchungen zeigten, dass nur Reaktionen mit SH-Leu das erwartete Thiol-Michael-Produkt ergaben, eine Beobachtung, die auf die sterische Hinderung durch die sperrige Natur von SH-Phe zurückzuführen ist. Wegen der schnellen Reaktionsgeschwindigkeiten und der vollständigen Acrylat/Maleimid-Umwandlung, die mit SH-Leu bei einem pH-Wert von 7,2 und höher erzielt wurde, kam SH-Phe als potenzielles Thiol für die Synthese des Peptidmimetikums nicht mehr infrage. 
Auf der Grundlage der ersten Studien wurde für das pH-basierte Gelierungssystem das vorgeschlagene Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH unverändert beibehalten. Der geringe Unterschied in den pKa-Werten zwischen SH-Leu (Thioesterthiol) und dem terminalen Cysteaminthiol sollte ausreichen, um eine "pseudo"-intramolekulare TTE zu bewirken. In polaren protischen Lösungsmitteln und unter basischen wässrigen Bedingungen verläuft die "pseudo"-intramolekulare TTE-Reaktion bei TDP erfolgreich, bei der ein α,ω-Dithiol-Tripeptid, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH, entsteht. Die pH-Abhängigkeit der Thiolat-Ionen-Generierung durch das Cysteamin-Thiol trug dazu bei, den notwendigen Stimulus (pH) für den Gesamterfolg der TTE (Aktivierungsschritt) - Thiol-Michael-Addition (Vernetzung) Strategie einzubauen. 
Zweitens wurde mit Blick auf potenzielle biomedizinische Anwendungen die Empfindlichkeit von TDP, wie auch anderer Thioester, für die intermolekulare TTE-Reaktion mit einer Gruppe von Thiolen mit unterschiedlichen Thiol-pKa-Werten untersucht, da biologische Milieus typischerweise Peptid-/Proteinthiole enthalten. L-Cystein, ein biologisch relevantes Thiol, und ein Thiol mit geringem Molekulargewicht, Methylthioglykolat, die beide relativ ähnliche Thiol-pKa-Werte besitzen, führten bei der Reaktion mit TDP zu einer erhöhten Konzentration des Dithiol-Vernetzers. In Gegenwart von sauren Thiolen (p-NTP und 4MBA) wurde eine Abnahme der Dithiolkonzentration beobachtet, eine Beobachtung, die auf die Unfähigkeit des tetraedrischen TTE-Zwischenprodukts in Austauschprodukte zu dissoziieren zurückgeführt werden kann und mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE-Reaktion in Einklang steht. Diese Ergebnisse machen TDP noch attraktiver und zum potenziell ersten Vernetzer-Precursor für Anwendungen in biologisch relevanten Medien. 
Schließlich wurde die Fähigkeit von TDP, die pH-empfindliche in-situ-Gelbildung zu fördern, mit Maleimid-funktionalisierten 4-armigen Polyethylenglykolpolymeren in tris-gepufferten Medien mit unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Bei einem Molverhältnis von 1:1 Thiol zu Maleimid bildeten sich TDP-PEG4MAL-Hydrogele innerhalb von 3, 12 und 24 Stunden bei pH-Werten von 8,5, 8,0 bzw. 7,5. Bei einer Erhöhung des Molverhältnisses von Thiol zu Maleimid auf 2:1 wurden jedoch Gelierzeiten von 3, 5 und 30 Minuten für denselben pH-Trend beobachtet. 
Ein direkter Zusammenhang zwischen dem Thiolgehalt und G' der Gele bei jedem pH-Wert konnte auch durch den Vergleich von Gelen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 1:1 mit solchen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 2:1 hergestellt werden. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass der Speichermodulus (G') linear von der Vernetzungsdichte des Polymers abhängig ist. Die Werte des anfänglichen G′ für alle Gele lagen bei 200 - 5000 Pa, was in den Bereich der Elastizitäten bestimmter Gewebe-Mikroumgebungen fällt, z. B. Gehirngewebe (200 - 1000 Pa) und Fettgewebe (2500 - 3500 Pa). 
Die bisher aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse über die Möglichkeit, die Austauschreaktion von Thioester-haltigen Peptidmimetika zu entwerfen und abzustimmen, geben weitere Einblicke in die Entwicklung neuer, auf spezifische Anwendungen zugeschnittener Sequenzen. 
Das Design von TTE-Substraten unter Verwendung von Peptidmimetika, wie es in dieser Arbeit vorgestellt wurde, hat interessante neue Erkenntnisse im Hinblick auf den Stand der Technik gebracht. Mit den erzielten Ergebnissen als Basis bietet die Strategie die Möglichkeit, das Konzept auf die kontrollierte Freisetzung aktiver Moleküle zu erweitern, die für andere robuste Vernetzungsreaktionen mit hohem Umsatz für biomedizinische Anwendungen benötigt werden. Dieses sequentiell gekoppelte funktionelle System könnte z. B. bei der Behandlung von entzündetem Gewebe im Zusammenhang mit Harnwegsinfektionen wie Blasenentzündungen eingesetzt werden, für die pH-Werte über 7 berichtet wurden. Durch die Einbeziehung von Zelladhäsionspeptidmotiven könnte das bei diesem pH-Wert gebildete Hydrogelnetz als neue Stützschicht für die Heilung von geschädigtem Epithel fungieren, wie in Experimenten zur Bildung von Grenzflächengelen mit TDP- und PEG4MAL-Tropfen gezeigt wurde.
Die Vielseitigkeit der Thiodepsipeptidsequenz Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) wurde um Design und die Synthese eines MMP-empfindlichen 4-armigen PEG-TDPo-Konjugats erweitert. Die beabsichtigte Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung liefert aktive Thiol-Einheiten für die anschließende Reaktion orthogonaler Michael-Akzeptor-Einheiten. Einer der Vorteile stimulierungsgestützter in-situ-Vernetzungssysteme unter Verwendung kurzer Peptide dürfte darin liegen, dass sich die erforderlichen Peptidmoleküle aufgrund der Vorhersagbarkeit der Peptidfunktionen und ihrer Sequenzstruktur leicht entwerfen lassen. Die Funktionalisierung eines vierarmigen PEG-Kerns mit der kollagenaseaktiven TDPo-Sequenz führte zu einem MMP-empfindlichen vierarmigen Thiodepsipeptid-PEG-Konjugat (PEG4TDPo). 
Spaltungs-Studien unter Verwendung eines thiolfluorimetrischen Assays in Gegenwart der MMPs -2 und -9 bestätigten die Spaltbarkeit von PEG4TDPo durch diese Enzyme. Der daraus resultierende zeitabhängige Anstieg der Fluoreszenzintensität in Anwesenheit des Thiol-Assays deutet auf die erfolgreiche Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung hin. Es wurde festgestellt, dass die Spaltungsstudien mit dem thiol-fluorimetrischen Assay ein sigmoides, nicht-Michaelis-Menten-artiges kinetisches Profil ergeben, was eine genaue Bestimmung der Enzymzyklusparameter, kcat und KM, erschwert.  
Gelierungsstudien mit PEG4MAL in einer Konzentration von 10 Gew.-% ergaben eine schnellere Gelierung mit MMP-2 als mit MMP-9 mit Gelierungszeiten von 28 bzw. 40 Minuten. Eventuelle Beiträge durch hydrolytische Spaltung von PEG4TDPo an der Gelierung wurden an PEG4MAL-Blindproben untersucht und führten erst nach 60 Minuten Reaktionszeit zu einer Gelierung. Aus theoretischen Überlegungen heraus wäre zu erwarten, dass sich die gleichzeitige Gelierungsreaktion negativer auf die enzymatische als auf die hydrolytische Spaltung auswirkt. Genaues zum Beitrag der hydrolytischen Spaltung von PEG4TDPo bedürfte jedoch weiterer Untersuchungen. 
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue in-situ-Vernetzungssystem, bei dem Peptid-basierte Vernetzungs-Precursor mit einstellbaren Eigenschaften verwendet werden, eine in-situ-Vernetzungs-Gelierungskinetik auf ähnlichem Niveau wie bei bereits berichteten aktiven Dithiole aufweist. Die vorteilhafte On-Demand-Funktionalität in Verbindung mit ihrer pH-Sensitivität und physiologischen Verträglichkeit macht sie zu einem interessanten Kandidaten für weitere Forschungen im Bereich biomedizinischer Anwendungen im Allgemeinen und der On-Demand-Materialsynthese. 
Die Ergebnisse des MMP-geförderten Gelierungssystems weisen einen einfachen, aber unerforschten Ansatz für die in-situ-Synthese kovalent vernetzter weicher Materialien, der zur Entwicklung eines alternativen Weges zur Bekämpfung der Krebsmetastasierung führen könnte, indem er die MMP-Überexpression als Auslöser nutzt. Mit MMP-Inhibitoren wurde dieses Ziel trotz umfangreicher Arbeiten in dieser Hinsicht bisher nicht erreicht.
KW  - hydrogels
KW  - stimuli
KW  - peptide
KW  - thioester
KW  - crosslinker
KW  - Hydrogele
KW  - Vernetzer
KW  - Peptid
KW  - Thioester
KW  - Stimuli
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569713
ER  - 
TY  - THES
A1  - Leiendecker, Mai-Thi
T1  - Physikalische Hydrogele auf Polyurethan-Basis
T1  - Physical hydrogels based on polyurethanes
N2  - Physical hydrogels have gained recent attention as cell substrates, since viscoelasticity or stress relaxation is a powerful parameter in mechanotransduction, which has long been neglected. We designed multi-functional polyurethanes to form physical hydrogels via a unique tunable gelation mechanism. The anionic polyurethanes spontaneously form aggregates in water that are kept in a soluble state through electrostatic repulsion. Fast subsequent gelation can be triggered by charge shielding which allows the aggregation and network building to proceed. This can be induced by adding either acids or salts, resulting in acidic (pH 4-5) or pH-neutral hydrogels, respectively. Whereas conventional polyurethane-based hydrogels are commonly prepared from toxic isocyanate precursors, the physical hydrogelation mechanism described here does not involve chemically reactive species which is ideal for in situ applications in sensitive environments. Both stiffness and stress relaxation can be tuned independently over a broad range and the gels exhibit excellent stress recovery behavior.
N2  - Physikalische Hydrogele gewinnen derzeit als Zellsubstrate zunehmend an Interesse, da Viskoelastizität oder Stressrelaxation ein bedeutender Parameter in der Mechanotransduktion ist, der bisher vernachlässigt wurde. In dieser Arbeit wurden multi-funktionelle Polyurethane entworfen, die über einen neuartigen Gelierungsmechanismus physikalische Hydrogele bilden. In Wasser bilden die anionischen Polyurethane spontan Aggregate, welche durch elektrostatische Abstoßung in Lösung gehalten werden. Eine schnelle Gelierung kann von hier aus durch Ladungsabschirmung erreicht werden, wodurch die Aggregation voranschreitet und ein Netzwerk ausgebildet wird. Dies kann durch die Zugabe von verschiedenen Säuren oder Salzen geschehen, sodass sowohl saure (pH 4 - 5) als auch pH-neutrale Hydrogele erhalten werden können. Während konventionelle Hydrogele auf Polyurethan-Basis in der Regel durch toxische isocyanat-haltige Präpolymere hergestellt werden, eignet sich der hier beschriebene physikalische Gelierungsmechanismus für in situ Anwendungen in sensitiven Umgebungen. Sowohl Härte als auch Stressrelaxation der Hydrogele können unabhängig voneinander über einen breiten Bereich eingestellt werden. Darüberhinaus zeichnen sich die Hydrogele durch exzellente Stressregeneration aus.
KW  - Polyurethane
KW  - Hydrogele
KW  - physikalische Hydrogele
KW  - Kolloidchemie
KW  - Viskoelastizität
KW  - Stressrelaxation
KW  - Stressrelaxierung
KW  - Bulkgele
KW  - Mikrogele
KW  - Mechanotransduktion
KW  - polyurethanes
KW  - hydrogels
KW  - physical hydrogels
KW  - colloidal chemistry
KW  - viscoelasticity
KW  - stress-relaxation
KW  - stress relaxation
KW  - bulk gels
KW  - microgels
KW  - mechanotransduction
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-103917
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tronci, Giuseppe
T1  - Synthesis, characterization, and biological evaluation of gelatin-based scaffolds
T1  - Synthese, Charakterisierung und biologische Evaluierung Gelatine-basierter Scaffolds
N2  - This work presents the development of entropy-elastic gelatin based networks in the form of films or scaffolds. The materials have good prospects for biomedical applications, especially in the context of bone regeneration. Entropy-elastic gelatin based hydrogel films with varying crosslinking densities were prepared with tailored mechanical properties. Gelatin was covalently crosslinked above its sol gel transition, which suppressed the gelatin chain helicity. Hexamethylene diisocyanate (HDI) or ethyl ester lysine diisocyanate (LDI) were applied as chemical crosslinkers, and the reaction was conducted either in dimethyl sulfoxide (DMSO) or water. Amorphous films were prepared as measured by Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), with tailorable degrees of swelling (Q: 300-800 vol. %) and wet state Young’s modulus (E: 70 740 kPa). Model reactions showed that the crosslinking reaction resulted in a combination of direct crosslinks (3-13 mol.-%), grafting (5-40 mol.-%), and blending of oligoureas (16-67 mol.-%). The knowledge gained with this bulk material was transferred to the integrated process of foaming and crosslinking to obtain porous 3-D gelatin-based scaffolds. For this purpose, a gelatin solution was foamed in the presence of a surfactant, Saponin, and the resulting foam was fixed by chemical crosslinking with a diisocyanate. The amorphous crosslinked scaffolds were synthesized with varied gelatin and HDI concentrations, and analyzed in the dry state by micro computed tomography (µCT, porosity: 65±11–73±14 vol.-%), and scanning electron microscopy (SEM, pore size: 117±28–166±32 µm). Subsequently, the work focused on the characterization of the gelatin scaffolds in conditions relevant to biomedical applications. Scaffolds showed high water uptake (H: 630-1680 wt.-%) with minimal changes in outer dimension. Since a decreased scaffold pore size (115±47–130±49 µm) was revealed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) upon wetting, the form stability could be explained. Shape recoverability was observed after removal of stress when compressing wet scaffolds, while dry scaffolds maintained the compressed shape. This was explained by a reduction of the glass transition temperature upon equilibration with water (dynamic mechanical analysis at varied temperature (DMTA)). The composition dependent compression moduli (Ec: 10 50 kPa) were comparable to the bulk micromechanical Young’s moduli, which were measured by atomic force microscopy (AFM). The hydrolytic degradation profile could be adjusted, and a controlled decrease of mechanical properties was observed. Partially-degraded scaffolds displayed an increase of pore size. This was likely due to the pore wall disintegration during degradation, which caused the pores to merge. The scaffold cytotoxicity and immunologic responses were analyzed. The porous scaffolds enabled proliferation of human dermal fibroblasts within the implants (up to 90 µm depth). Furthermore, indirect eluate tests were carried out with L929 cells to quantify the material cytotoxic response. Here, the effect of the sterilization method (Ethylene oxide sterilization), crosslinker, and surfactant were analyzed. Fully cytocompatible scaffolds were obtained by using LDI as crosslinker and PEO40 PPO20-PEO40 as surfactant. These investigations were accompanied by a study of the endotoxin material contamination. The formation of medical-grade materials was successfully obtained (<0.5 EU/mL) by using low-endotoxin gelatin and performing all synthetic steps in a laminar flow hood.
N2  - Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung Entropie-elastischer Gelatine-basierter Netzwerke als Filme und Scaffolds. Mögliche Anwendungen für die entwickelten Materialien liegen im biomedizinischen Bereich, insbesondere der Knochenregeneration. Im ersten Schritt der Arbeit wurden Entropie-elastische, Gelatine-basierte Hydrogel-Filme entwickelt, deren mechanische Eigenschaften durch die Veränderung der Quervernetzungsdichte eingestellt werden konnten. Dazu wurde Gelatine in Lösung oberhalb der Gel-Sol-Übergangstemperatur kovalent quervernetzt, wodurch die Ausbildung helikaler Konformationen unterdrückt wurde. Als Quervernetzer wurden Hexamethylendiisocyanat (HDI) oder Lysindiisocyanat ethylester (LDI) verwendet, und die Reaktionen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Wasser durchgeführt. Weitwinkel Röntgenstreuungs Spektroskopie (WAXS) zeigte, dass die Netzwerke amorph waren. Der Quellungsgrad (Q: 300-800 vol. %) und der Elastizitätsmodul (E: 70 740 kPa) konnten dabei durch die systematische Veränderung der Quervernetzungsdichte eingestellt werden. Die Analyse der Quervernetzungsreaktion durch Modellreaktionen zeigte, dass die Stabilisierung der Hydrogele sowohl auf kovalente Quervernetzungen (3-13 mol.-%) als auch auf Grafting von (5-40 mol.-%) und Verblendung mit Oligoharnstoffen (16-67 mol.-%) zurückgeführt werden kann. Die Erkenntnisse aus dem Umgang mit dem Bulk-Material wurden dann auf einen integrierten Prozess der Verschäumung und chemischen Quervernetzung transferiert, so dass poröse, dreidimensionale Scaffolds erhalten wurden. Dafür wurde eine wässrige Gelatinelösung in Gegenwart eines Tensids, Saponin, verschäumt, und durch chemische Quervernetzung mit einem Diisocyanat zu einem Scaffold fixiert. Die Scaffolds hergestellt mit unterschiedlichen Mengen HDI und Gelatine, wurden im trockenen Zustand mittels Mikro Computertomographie (µCT, Porosität: 65±11–73±14 vol.-%) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM, Porengröße: 117±28–166±32) charakterisiert. Anschließend wurden die Scaffolds unter Bedingungen charakterisiert, die für biomedizinische Anwendungen relevant sind. Die Scaffolds nahmen große Mengen Wasser auf (H: 630 1680 wt.-%) bei nur minimalen Änderungen der äußeren Dimensionen. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie zeigte, dass die Wasseraufnahme zu einer verminderten Porengröße führte (115±47–130±49 µm), wodurch die Formstabilität erklärbar ist. Eine Formrückstellung der Scaffolds wurde beobachtet, wenn Scaffolds im nassen Zustand komprimiert wurden und dann entlastet wurden, während trockene Proben in der komprimierten Formen blieben (kalte Deformation). Dieses Entropie-elastische Verhalten der nassen Scaffolds konnte durch die Verminderung der Glasübergangstemperatur des Netzwerks nach Wasseraufnahme erklärt werden (DMTA). Die zusammensetzungsabhängigen Kompressionsmoduli (Ec: 10 50 kPa) waren mit den mikromechanischen Young’s moduli vergleichbar, die mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen wurden. Das hydrolytische Degradationsprofil konnte variiert werden, und während des Abbaus kam es nur zu kontrolliert-graduellen Änderungen der mechanischen Eigenschaften. Während der Degradation konnte ein Anstieg der mittleren Porengröße beobachtet werden, was durch das Verschmelzen von Poren durch den Abbau der Wände erklärt werden kann. Die Endotoxinbelastung und die Zytotoxizität der Scaffolds wurden untersucht. Humane Haut-Fibroblasten wuchsen auf und innerhalb der Scaffolds (bis zu einer Tiefe von 90 µm). Indirekte Eluat-Tests mit L929 Mausfibroblasten wurden genutzt, um die Zytotoxizität der Materialien, insbesondere den Einfluss des Quervernetzertyps und des Tensids, zu bestimmen. Vollständig biokompatible Materialien wurden erzielt, wenn LDI als Quervernetzer und PEO40 PPO20-PEO40 als Tensid verwendet wurden. Durch den Einsatz von Gelatine mit geringem Endotoxin-Gehalt, und die Synthese in einer Sterilarbeitsblank konnten Materialien für medizinische Anwendungen (Endotoxin-Gehalt < 0.5 EU/mL) hergestellt werden.
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Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-49727
ER  -