@phdthesis{Lossow2011, author = {Loßow, Kristina}, title = {Erzeugung und Charakterisierung von Mausmodellen mit lichtsensitivem Geschmackssystem zur Aufkl{\"a}rung der neuronalen Geschmackskodierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-58059}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2011}, abstract = {Die Wahrnehmung von Geschmacksempfindungen beruht auf dem Zusammenspiel verschiedener Sinneseindr{\"u}cke wie Schmecken, Riechen und Tasten. Diese Komplexit{\"a}t der gustatorischen Wahrnehmung erschwert die Beantwortung der Frage wie Geschmacksinformationen vom Mund ins Gehirn weitergeleitet, prozessiert und kodiert werden. Die Analysen zur neuronalen Prozessierung von Geschmacksinformationen erfolgten zumeist mit Bitterstimuli am Mausmodell. Zwar ist bekannt, dass das Genom der Maus f{\"u}r 35 funktionelle Bitterrezeptoren kodiert, jedoch war nur f{\"u}r zwei unter ihnen ein Ligand ermittelt worden. Um eine bessere Grundlage f{\"u}r tierexperimentelle Arbeiten zu schaffen, wurden 16 der 35 Bitterrezeptoren der Maus heterolog in HEK293T-Zellen exprimiert und in Calcium-Imaging-Experimenten funktionell charakterisiert. Die Daten belegen, dass das Funktionsspektrum der Bitterrezeptoren der Maus im Vergleich zum Menschen enger ist und widerlegen damit die Aussage, dass humane und murine orthologe Rezeptoren durch das gleiche Ligandenspektrum angesprochen werden. Die Interpretation von tierexperimentellen Daten und die {\"U}bertragbarkeit auf den Menschen werden folglich nicht nur durch die Komplexit{\"a}t des Geschmacks, sondern auch durch Speziesunterschiede verkompliziert. Die Komplexit{\"a}t des Geschmacks beruht u. a. auf der Tatsache, dass Geschmacksstoffe selten isoliert auftreten und daher eine Vielzahl an Informationen kodiert werden muss. Um solche geschmacksstoffassoziierten Stimuli in der Analyse der gustatorischen Kommunikationsbahnen auszuschließen, sollten Opsine, die durch Licht spezifischer Wellenl{\"a}nge angeregt werden k{\"o}nnen, f{\"u}r die selektive Ersetzung von Geschmacksrezeptoren genutzt werden. Um die Funktionalit{\"a}t dieser angestrebten Knockout-Knockin-Modelle zu evaluieren, die eine Kopplung von Opsinen mit dem geschmacksspezifischen G-Protein Gustducin voraussetzte, wurden Oozyten vom Krallenfrosch Xenopus laevis mit dem Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Verfahren hinsichtlich dieser Interaktion analysiert. Der positiven Bewertung dieser Kopplung folgte die Erzeugung von drei Mauslinien, die in der kodierenden Region eines spezifischen Geschmacksrezeptors (Tas1r1, Tas1r2, Tas2r114) Photorezeptoren exprimierten. Durch RT-PCR-, In-situ-Hybridisierungs- und immunhistochemische Experimente konnte der erfolgreiche Knockout der Rezeptorgene und der Knockin der Opsine belegt werden. Der Nachweis der Funktionalit{\"a}t der Opsine im gustatorischen System wird Gegenstand zuk{\"u}nftiger Analysen sein. Bei erfolgreichem Beleg der Lichtempfindlichkeit von Geschmacksrezeptorzellen dieser Mausmodelle w{\"a}re ein System geschaffen, dass es erm{\"o}glichen w{\"u}rde, gustatorische neuronale Netzwerke und Hirnareale zu identifizieren, die auf einen reinen geschmacks- und qualit{\"a}tsspezifischen Stimulus zur{\"u}ckzuf{\"u}hren w{\"a}ren.}, language = {de} } @phdthesis{Baumgart2013, author = {Baumgart, Natalie}, title = {Faltungseigenschaften des extrazellul{\"a}ren Proteins Internalin J und seine Cysteinleiter}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-69603}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2013}, abstract = {Internalin J (InlJ) geh{\"o}rt zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Dom{\"a}ne von InlJ ist aus 15 regelm{\"a}ßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminos{\"a}uren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungew{\"o}hnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die H{\"a}ufigkeit von Cysteinen in InlJ ist f{\"u}r ein extrazellul{\"a}res Protein von L. monocytogenes außergew{\"o}hnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquit{\"a}ren Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilit{\"a}t und Faltung nicht {\"a}quivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilit{\"a}tsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine n{\"a}her beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zug{\"a}nglich ist. Die thermodynamische Stabilit{\"a}t wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments m{\"o}glich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts" Prinzip folgt. Die G{\"u}ltigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung best{\"a}tigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilit{\"a}t von InlJ geht mit hoher Kooperativit{\"a}t einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativit{\"a}t haupts{\"a}chlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberfl{\"a}chen{\"a}nderung w{\"a}hrend der Faltung bereits zum gr{\"o}ßten Teil erfolgt ist, bevor der {\"U}bergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen {\"u}ber den {\"U}bergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im {\"U}bergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilit{\"a}t und ein stark-kooperatives Verhalten f{\"u}r das extrazellul{\"a}re Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse k{\"o}nnten wichtige Beitr{\"a}ge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.}, language = {de} } @phdthesis{Zemella2019, author = {Zemella, Anne}, title = {Fluoreszenzmarkierung und Modifizierung von komplexen Proteinen in eukaryotischen zellfreien Systemen durch die Etablierung von orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paaren}, doi = {10.25932/publishup-44236}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-442361}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XI, 141}, year = {2019}, abstract = {Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in ad{\"a}quaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren k{\"o}nnen. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abh{\"a}ngige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. F{\"u}r diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, k{\"o}nnten diese zuk{\"u}nftig in zellfreien Systemen f{\"u}r die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden k{\"o}nnen. Neben der reinen Proteinherstellung k{\"o}nnen Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, f{\"u}r den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden. Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminos{\"a}ure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zus{\"a}tzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminos{\"a}ure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders f{\"u}r eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformations{\"a}nderung im Adora2a {\"u}ber einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde dar{\"u}ber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilit{\"a}t und Halbwertszeit des Proteins ver{\"a}ndert wurden. Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminos{\"a}uren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue M{\"o}glichkeiten f{\"u}r die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden.}, language = {de} } @phdthesis{Albers2018, author = {Albers, Philip}, title = {Funktionelle Charakterisierung des bakteriellen Typ-III Effektorproteins HopZ1a in Nicotiana benthamiana}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {viii, 134}, year = {2018}, abstract = {Um das Immunsystem der Pflanze zu manipulieren translozieren gram-negative pathogene Bakterien Typ-III Effektorproteine (T3E) {\"u}ber ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die pflanzliche Wirtszelle. Dort lokalisieren T3Es in verschiedenen subzellul{\"a}ren Kompartimenten, wo sie Zielproteine modifizieren und so die Infektion beg{\"u}nstigen. HopZ1a, ein T3E des Pflanzenpathogens Pseudomonas syringae pv. syringae, ist eine Acetyltransferase und lokalisiert {\"u}ber ein Myristolierungsmotiv an der Plasmamembran der Wirtszelle. Obwohl gezeigt wurde, dass HopZ1a die fr{\"u}he Signalweiterleitung an der Plasmamembran st{\"o}rt, wurde bisher kein mit der Plasmamembran assoziiertes Zielprotein f{\"u}r diesen T3E identifiziert. Um bisher unbekannte HopZ1a-Zieleproteine zu identifizieren wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit einer cDNA-Bibliothek aus Tabak durchgef{\"u}hrt, wobei ein nicht n{\"a}her charakterisiertes Remorin als Interaktor gefunden wurde. Bei dem Remorin handelt es sich um einen Vertreter der Gruppe 4 der Remorin-Familie, weshalb es in NbREM4 umbenannt wurde. Durch den Einsatz verschiedener Interaktionsstudien konnte demonstriert werden, dass HopZ1a mit NbREM4 in Hefe, in vitro und in planta wechselwirkt. Es wurde ferner deutlich, dass HopZ1a auf spezifische Weise mit dem konservierten C-Terminus von NbREM4 interagiert, das Remorin jedoch in vitro nicht acetyliert. Analysen mittels BiFC haben zudem ergeben, dass NbREM4 in Homodimeren an der Plasmamembran lokalisiert, wo auch die Interaktion mit HopZ1a stattfindet. Eine funktionelle Charakterisierung von NbREM4 ergab, dass das Remorin eine spezifische Rolle im Immunsystem der Pflanze einnimmt. Die transiente Expression in N. benthamiana induziert die Expression von Abwehrgenen sowie einen ver{\"a}nderten Blattph{\"a}notyp. In A. thaliana wird HopZ1a {\"u}ber das Decoy ZED1 und das R-Protein ZAR1 erkannt, was zur Ausl{\"o}sung einer starken Hypersensitiven Antwort (HR von hypersensitive response) f{\"u}hrt. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ZAR1 in N. benthamiana konserviert ist, NbREM4 jedoch nicht in der ETI als Decoy fungiert. Mit Hilfe einer Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit NbZAR1 als K{\"o}der konnten zwei Proteine, die Catalase CAT1 und der Protonenpumpeninteraktor PPI1, als Interaktoren von NbZAR1 identifiziert werden, welche m{\"o}glicherweise in der Regulation der HR eine Rolle spielen. Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass NbREM4 mit weiteren, nicht n{\"a}her charakterisierten Proteinen aus Tabak interagieren k{\"o}nnte. Eine phylogenetische Einordnung hat gezeigt, dass es sich um die bekannte Immun-Kinase PBS1 sowie zwei E3-Ubiquitin-Ligasen, NbSINA1 und NbSINAL3, handelt. PBS1 interagiert mit NbREM4 an der Plasmamembran und phosphoryliert das Remorin innerhalb des intrinsisch ungeordneten N-Terminus. Mittels Massenspektrometrie konnten die Serine an Position 64 und 65 innerhalb der Aminos{\"a}uresequenz von NbREM4 als PBS1-abh{\"a}ngige Phosphorylierungsstellen identifiziert wurden. NbSINA1 und NbSINAL3 besitzen in vitro Ubiquitinierungsaktivit{\"a}t, bilden Homo- und Heterodimere und interagieren ebenfalls mit dem N-terminalen Teil von NbREM4, wobei sie das Remorin in vitro nicht ubiquitinieren. Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen l{\"a}sst sich ableiten, dass der bakterielle T3E HopZ1a gezielt mit dem Tabak-Remorin NbREM4 an der Plasmamembran interagiert und {\"u}ber einen noch unbekannten Mechanismus mit dem Immunsystem der Pflanze interferiert, wobei NbREM4 m{\"o}glicherweise eine Rolle als Adapter- oder Ankerprotein zukommt, {\"u}ber welches HopZ1a mit weiteren Immunkomponenten interagiert. NbREM4 ist Teil eines gr{\"o}ßeren Immunnetzwerkes, zu welchem die bekannte Immun-Kinase PBS1 und zwei E3-Ubiquitin-Ligasen geh{\"o}ren. Mit NbREM4 konnte damit erstmalig ein membranst{\"a}ndiges Protein mit einer Funktion im Immunsystem der Pflanze als Zielprotein von HopZ1a identifiziert werden.}, language = {de} } @phdthesis{Raffeiner2021, author = {Raffeiner, Margot}, title = {Funktionelle Charakterisierung des Xanthomonas Typ-III Effektorproteins XopS}, doi = {10.25932/publishup-52553}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525532}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {IX, 185}, year = {2021}, abstract = {Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdr{\"u}cken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort st{\"o}ren diese die Immunantwort des Wirts oder f{\"o}rdern die Etablierung einer f{\"u}r das Pathogen g{\"u}nstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunit{\"a}t gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu st{\"o}ren. Die Aufkl{\"a}rung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv w{\"a}hrend der pr{\"a}invasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfl{\"a}che suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abh{\"a}ngigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die pr{\"a}-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen w{\"a}hrend des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis f{\"u}hrte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmons{\"a}ure (JA), w{\"a}hrend eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicyls{\"a}ure (SA)-Gehalts f{\"u}hrte. So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv f{\"o}rdert, indem JA-abh{\"a}ngige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdr{\"u}ckung SA-abh{\"a}ngiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erh{\"o}hte die Toleranz der Pflanze gegen{\"u}ber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier {\"u}ber verschiedene experimentelle Ans{\"a}tze bekr{\"a}ftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abh{\"a}ngigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gew{\"a}hrleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 {\"u}ber das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter best{\"a}tigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins f{\"u}hrt, indem er auf bislang ungekl{\"a}rte Weise dessen Abbau {\"u}ber das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu f{\"u}hrt, dass eine dar{\"u}ber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen f{\"o}rdert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die f{\"u}r seine Interaktion mit WRKY40 bzw. f{\"u}r die Aufschl{\"u}sselung seines Wirkmechanismus relevant sein k{\"o}nnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion k{\"o}nnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. W{\"a}hrend einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion f{\"u}hrte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegen{\"u}ber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung w{\"a}hrend der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zus{\"a}tzlich verst{\"a}rkt wird. Weiterf{\"u}hrende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgef{\"u}hrt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschl{\"u}sseln.}, language = {de} } @phdthesis{Schumann2008, author = {Schumann, Silvia}, title = {Funktionelle Charakterisierung von prokaryotischen und eukaryotischen Molybdoflavoenzymen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-43427}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die Xanthin-Dehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches ein (αβ)₂ Heterotetramer mit einer Gr{\"o}ße von 275 kDa bildet. Die drei Kofaktoren (Moco, 2[2Fe2S], FAD) sind auf zwei unterschiedlichen Polypeptidketten gebunden. So sind die beiden spektroskopisch unterscheidbaren Eisen-Schwefel-Zentren und das FAD in der XdhA-Untereinheit und der Moco in der XdhB-Untereinheit gebunden. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum die R. capsulatus XDH ein Dimer bildet und ob ein intramolekularer Elektronentransfer existiert. Daf{\"u}r wurde eine chim{\"a}re XDH-Variante [(α)₂(β₁wt/β₂E730A)] erzeugt, welche eine aktive und eine inaktive XdhB-Untereinheit tr{\"a}gt. Mit Hilfe von Reduktionsspektren sowie mit der Bestimmung der kinetischen Parameter f{\"u}r die Substrate Xanthin und NAD+ konnte gezeigt werden, dass die chim{\"a}re XDH-Variante katalytisch halb so aktiv war, wie der auf gleiche Weise gereinigte XDH-Wildtyp. Dies verdeutlicht, dass die noch aktive Untereinheit der Chim{\"a}ren selbstst{\"a}ndig und unabh{\"a}ngig Substrat binden und hydroxylieren kann und ein intramolekularer Elektronentransfer zwischen den beiden XdhB-Untereinheiten nicht stattfindet. Ein weiteres Ziel war die funktionelle Charakterisierung der Mus musculus AOX1 sowie der humanen AOX1 hinsichtlich ihrer Substratspezifit{\"a}ten und ihrer biophysikalischen Eigenschaften sowie der Charakterisierung der konservierten Aminos{\"a}uren im aktiven Zentrum der mAOX1. Da bislang noch kein heterologes Expressionssystem f{\"u}r ein aktives und stabiles rekombinantes AO-Protein existierte, wurde ein E. coli Expressionssystem mit der gleichzeitigen Expression der entsprechenden Mocosulfurase f{\"u}r mAOX1 und hAOX1 in dieser Arbeit etabliert. Mit Hilfe dieser Koexpression konnte die Aktivit{\"a}t der rekombinanten mAOX1 um 50 \% gesteigert werden, wenn gleich auch der sulfurierte Moco-Anteil nur 20 \% betrug. Um die konservierten Aminos{\"a}uren im aktiven Zentrum hinsichtlich ihrer Funktion der Substratbindung zu charakterisieren, wurden folgende Varianten erzeugt: V806E, M884R, V806/M884R sowie E1265Q. Mit Hilfe von kinetischen Substratuntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die beiden Aminos{\"a}uren Val806 und Met884 f{\"u}r die Erkennung und die Stabilisierung von Aldehyden und N-Heterozyklen essentiell sind. Ein Austausch dieser beiden gegen Glutamat bzw. Arginin (wie bei R. capsulatus XDH) zeigte jedoch keine Xanthin- oder Hypoxanthinumsetzung. F{\"u}r das Glu1265 wurde ebenfalls die Rolle als die Katalyse initiierende Aminos{\"a}ure belegt.}, language = {de} } @phdthesis{Bertz2018, author = {Bertz, Martin}, title = {Funktion von Selenoproteinen  w{\"a}hrend der kolorektalen Karzinogenese}, doi = {10.25932/publishup-42780}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-427808}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {VII, 109}, year = {2018}, abstract = {Kolorektalkrebs (CRC) ist die dritth{\"a}ufigste Tumorerkrankung weltweit. Neben dem Alter spielt auch die Ern{\"a}hrung eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. Eine vermutlich krebspr{\"a}ventive Wirkung wird dabei dem Spurenelement Selen zugeschrieben, das fast ausschließlich {\"u}ber Lebensmittel aufgenommen wird. So h{\"a}ngt beispielsweise ein niedriger Selenstatus mit dem Risiko, im Laufe des Lebens an CRC zu erkranken, zusammen. Seine Funktionen vermittelt Selen dabei {\"u}berwiegend durch Selenoproteine, in denen es in Form von Selenocystein eingebaut wird. Zu den bisher am besten untersuchten Selenoproteinen mit m{\"o}glicher Funktion w{\"a}hrend CRC z{\"a}hlen die Glutathionperoxidasen (GPXen). Die Mitglieder dieser Familie tragen aufgrund ihrer Hydroperoxid-reduzierenden Eigenschaften entscheidend zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress bei. Dies kann je nach Art und Stadium des Tumors entweder krebshemmend oder -f{\"o}rdernd wirken, da auch transformierte Zellen von dieser Schutzfunktion profitieren. In dieser Arbeit wurde die GPX2 in HT29-Darmkrebszellen mithilfe stabil-transfizierter shRNA herunterreguliert, um die Funktion des Enzyms vor allem in Hinblick auf regulierte Signalwege zu untersuchen. Ein Knockdowns (KD) der strukturell {\"a}hnlichen GPX1 kam ebenfalls zum Einsatz, um gezielt Isoform-spezifische Funktionen unterscheiden zu k{\"o}nnen. Anhand eines PCR-Arrays wurden Signalwege identifiziert, die auf einen Einfluss der beiden Proteine im Zellwachstum hindeuteten. Anschließende Untersuchungen ließen auf einen verminderten Differenzierungsstatus in den GPX1- und GPX2-KDs aufgrund einer geringeren Aktivit{\"a}t der Alkalischen Phosphatase schließen. Zudem war die Zellviabilit{\"a}t im Neutralrot-Assay (NRU) bei Fehlen der GPX1 bzw. GPX2 im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Die Ergebnisse des PCR-Arrays, und speziell f{\"u}r die GPX2 fr{\"u}here Untersuchungen der Arbeitsgruppe, wiesen weiterhin auf eine Rolle der beiden Proteine in der entz{\"u}ndungsgetriebenen Karzinogenese hin. Daher wurden auch m{\"o}gliche Interaktionen mit dem NFκB-Signalweg analysiert. Eine Stimulation der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin IL1β ging mit einer verst{\"a}rkten Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in den Zellen mit GPX1- bzw. GPX2-KD einher. Die gleichzeitige Behandlung mit dem Antioxidans NAC f{\"u}hrte nicht zur R{\"u}cknahme der Effekte in den KDs, sodass m{\"o}glicherweise nicht nur die antioxidativen Eigenschaften der Enzyme bei der Interaktion mit diesen Signalwegsproteinen relevant sind. Weiterhin wurden Analysen zum Substratspektrum der GPX2 in HCT116-Zellen mit einer {\"U}berexpression des Proteins durchgef{\"u}hrt. Dabei zeigte sich mittels NRU-Assay und DNA-Laddering, dass die GPX2 besonders vor den proapoptotischen Effekten einer Behandlung mit den Lipidhydroperoxiden HPODE und HPETE sch{\"u}tzt. Im Gegensatz zur GPX2 l{\"a}sst sich Selenoprotein H (SELENOH) st{\"a}rker durch die aliment{\"a}re Selenzufuhr beeinflussen. Einer m{\"o}glichen Nutzung als Biomarker oder gar als Ansatzpunkt bei der Pr{\"a}vention bzw. Behandlung von CRC steht allerdings unvollst{\"a}ndiges Wissen {\"u}ber die Funktion des Proteins gegen{\"u}ber. Zur genaueren Charakterisierung von SELENOH wurden daher stabil-transfizierte KD-Klone in HT29- und Caco2-Zellen hergestellt und zun{\"a}chst auf ihre Tumorigenit{\"a}t untersucht. Zellen mit SELENOH-KD bildeten mehr und gr{\"o}ßere Kolonien im Soft Agar und zeigten ein erh{\"o}htes Proliferations- und Migrationspotenzial im Vergleich zur Kontrolle. Ein Xenograft in Nacktm{\"a}usen resultierte zudem in einer st{\"a}rkeren Tumorbildung nach Injektion von KD-Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung von SELENOH an der Zellzyklusregulation deuten auf eine hemmende Rolle des Proteins in der G1/S-Phase hin. Die weiterhin beobachtete Hochregulation von SELENOH in humanen Adenokarzinomen und pr{\"a}kanzer{\"o}sem Mausgewebe l{\"a}sst sich m{\"o}glicherweise mit der postulierten Schutzfunktion vor oxidativen Zell- und DNA-Sch{\"a}den erkl{\"a}ren. In gesunden Darmepithelzellen war das Protein vorrangig am Kryptengrund lokalisiert, was zu einer potenziellen Rolle w{\"a}hrend der gastrointestinalen Differenzierung passt.}, language = {de} } @phdthesis{Strehmel2010, author = {Strehmel, Nadine}, title = {GC-TOF-MS basierte Analyse von niedermolekularen Prim{\"a}r- und Sekund{\"a}rmetaboliten agrarwirtschaftlich bedeutsamer Nutzpflanzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-51238}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Die Qualit{\"a}t von Nutzpflanzen ist von zahlreichen Einflussfaktoren wie beispielsweise Lagerbedingungen und Sorteneigenschaften abh{\"a}ngig. Um Qualit{\"a}tsm{\"a}ngel zu minimieren und Absatzchancen von Nutzpflanzen zu steigern sind umfangreiche Analysen hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung notwendig. Chromatographische Techniken gekoppelt an ein Massenspektrometer und die Kernspinresonanzspektroskopie wurden daf{\"u}r bislang verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Gaschromatograph an ein Flugzeitmassenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt, um physiologische Prozesse bzw. Eigenschaften (die Schwarzfleckigkeit, die Chipsbr{\"a}unung, das Physiologische Alter und die Keimhemmung) von Nutzpflanzen aufzukl{\"a}ren. Als Pflanzenmodell wurde daf{\"u}r die Kartoffelknolle verwendet. Dazu wurden neue analytische L{\"o}sungsans{\"a}tze entwickelt, die eine zielgerichtete Auswertung einer Vielzahl von Proben, die Etablierung einer umfangreichen Referenzspektrenbibliothek und die sichere Archivierung aller experimentellen Daten umfassen. Das Verfahren der Probenvorbereitung wurde soweit modifiziert, dass gering konzentrierte Substanzen mittels GC-TOF-MS analysiert werden k{\"o}nnen. Dadurch wurde das durch die Probenvorbereitung limitierte Substanzspektrum erweitert. Anhand dieser L{\"o}sungsans{\"a}tze wurden physiologisch relevante Stoffwechselprodukte identifiziert, welche indikativ (klassifizierend) bzw. pr{\"a}diktiv (vorhersagend) f{\"u}r die physiologischen Prozesse sind. F{\"u}r die Schwarzfleckigkeitsneigung und die Chipseignung wurde jeweils ein biochemisches Modell zur Vorhersage dieser Prozesse aufgestellt und auf eine Z{\"u}chtungspopulation {\"u}bertragen. Ferner wurden f{\"u}r die Schwarzfleckigkeit Stoffwechselprodukte des Respirationsstoffwechsels identifiziert sowie Aminos{\"a}uren, Glycerollipide und Phenylpropanoide f{\"u}r das Physiologische Alter als relevant erachtet. Das physiologische Altern konnte durch die Anwendung h{\"o}herer Temperaturen beschleunigt werden. Durch Anwendung von Keimhemmern (K{\"u}mmel{\"o}l, Chlorpropham) wurde eine Verz{\"o}gerung des physiologischen Alterns beobachtet. Die Applikation von K{\"u}mmel{\"o}l erwies sich dabei als besonders vorteilhaft. K{\"u}mmel{\"o}l behandelte Knollen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Knollen nur Ver{\"a}nderungen im Aminos{\"a}ure-, Zucker- und Sekund{\"a}rstoffwechsel auf. Chlorpropham behandelte Knollen wiesen einen {\"a}hnlichen Stoffwechsel wie die unbehandelten Knollen auf. F{\"u}r die bislang noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit das Verfahren der „gezielten An-/Abreicherung", der „gepaarten NMR/GC-TOF-MS Analyse" und das „Entscheidungsbaumverfahren" entwickelt. Diese erm{\"o}glichen eine Klassifizierung von GC-MS Signalen im Hinblick auf ihre chemische Funktionalit{\"a}t. Das Verfahren der gekoppelten NMR/GC-TOF-MS Analyse erwies sich dabei als besonders erfolgversprechend, da es eine Aufkl{\"a}rung bislang unbekannter gaschromatographischer Signale erm{\"o}glicht. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Stoffwechselprodukte in der Kartoffelknolle identifiziert, wodurch ein wertvoller Beitrag zur Analytik der Metabolomik geleistet wurde.}, language = {de} } @phdthesis{Wende2003, author = {Wende, Hagen}, title = {Genetische Charakterisierung des "Leukocyte Receptor Complex" und Entwicklung einer Methode zum Nachweis seiner Produkte im Einzelzellmaßstab}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001298}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2003}, abstract = {Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine L{\"a}nge von {\"u}ber 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die f{\"u}r die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfl{\"a}che dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine k{\"o}nnen mit Oberfl{\"a}chenproteinen auf anderen K{\"o}rperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zun{\"a}chst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander {\"u}berlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es m{\"o}glich, den gesamten Chromosomenabschnitt {\"a}hnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen l{\"a}ßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum k{\"o}nnen im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem m{\"o}glich, evolution{\"a}re Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuf{\"u}hren. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr {\"a}hnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und k{\"o}nnte somit in der Diagnostik Anwendung finden.}, language = {de} } @phdthesis{Baufeld2005, author = {Baufeld, Ralf}, title = {GIS-gest{\"u}tzte Prognose der Biotopentwicklung auf Grundlage von Biotoptypen- und Vegetationserhebungen auf geplanten R{\"u}ckdeichungsfl{\"a}chen an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2523}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa ver{\"a}ndert worden, wobei insbesondere die Retentionsfl{\"a}chen stark verringert wurden. W{\"a}hrend Auen seit l{\"a}ngerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Bioz{\"o}nosen an die ver{\"a}nderten Standortbedingungen beobachten zu k{\"o}nnen. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergest{\"u}tzte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen R{\"u}ckdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein g{\"u}ltigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells f{\"u}r einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem f{\"u}r die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Fl{\"a}chen an der Mittleren Elbe bei Rog{\"a}tz und Sandau, beide im n{\"o}rdlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgew{\"a}hlt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete fl{\"a}chendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen erg{\"a}nzt. Aus dem Forschungsprojekt "R{\"u}ckgewinnung von Retentionsfl{\"a}chen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums f{\"u}r Bildung und Forschung (BMBF) standen standort{\"o}kologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verf{\"u}gung. Ziel der Auswertung war, Schl{\"u}sselfaktoren f{\"u}r Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Auspr{\"a}gung bestimmter Biotoptypen f{\"u}hren. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell f{\"u}r Biotoptypenpotenziale auf den geplanten R{\"u}ck\–deichungsfl{\"a}chen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standort{\"o}kologie (Hydrologie und Boden) im R{\"u}ckdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung f{\"u}r die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios f{\"u}r die Landschaft nach Deichr{\"u}ckverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensit{\"a}t wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung {\"u}ber sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zus{\"a}tzlich wurde eine zuk{\"u}nftige Potentielle Nat{\"u}rliche Vegetation modelliert. Eine {\"U}berpr{\"u}fung des Modell fand f{\"u}r den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenw{\"a}rtigen Nutzung am n{\"a}chsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgr{\"o}ße in das Modell einbezogen, konnte f{\"u}r viele Biotoptypen eine Trefferquote von {\"u}ber 90 \% erreicht werden. Bei fl{\"a}chenm{\"a}ßig weniger bedeutenden Bio\–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 \%. Als Ergebnis liegt f{\"u}r unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell gepr{\"u}ft, inwieweit die modellierten Biotopfl{\"a}chen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen {\"o}kologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Fl{\"a}cheneinheit zugeordnet. Anteilig l{\"a}sst sich damit die Biotopprognosefl{\"a}che pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit geh{\"o}rt zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine M{\"o}glichkeit auf, Prognosemodelle f{\"u}r Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle k{\"o}nnen zum Verst{\"a}ndnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichr{\"u}ckverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabsch{\"a}tzung unterst{\"u}tzen.}, subject = {Modellierung}, language = {de} } @phdthesis{Drzikova2005, author = {Drzikova, Barbora}, title = {Haferprodukte mit modifiziertem Gehalt an β-Glucanen und resistenter St{\"a}rke und ihre Effekte auf den Gastrointestinaltrakt unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-5926}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {In einer Zeit, in der eine Zunahme von ern{\"a}hrungsbedingten Erkrankungen in steigendem Maße zu beobachten ist, wird dem Getreide als Grundlage der menschlichen Ern{\"a}hrung erh{\"o}hte Aufmerksamkeit gewidmet. Ein hoher Verzehr von Ballaststoffen ist ein wesentlicher Aspekt in der pr{\"a}ventiv-medizinischen Ern{\"a}hrung. Die von der Deutschen Gesellschaft f{\"u}r Ern{\"a}hrung vorgeschlagene t{\"a}gliche Ballaststoffzufuhr liegt bei 30 g. Die Aufnahme von Ballaststoffen ist jedoch in Deutschland deutlich unterhalb dieser empfohlenen Menge. Getreideprodukte, besonders vom Vollkorntyp, sind die wichtigste Quelle f{\"u}r Ballaststoffe. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit direkt verzehrsf{\"a}hige, Ballaststoff-angereicherte Haferprodukte (vorwiegend Extrudate) mit hohen Gehalten an b-Glucanen und resistenter St{\"a}rke hergestellt, analysiert und nachfolgend auf relevante ern{\"a}hrungsphysiologische Wirkungen gepr{\"u}ft werden. Als Basis f{\"u}r die Produkte wurden Hafermehl und Haferkleie eingesetzt. Der erste Teil der Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Analyse der Haferprodukte. Diese wiesen eine hohe Wasserbindungskapazit{\"a}t auf. Bei den Untersuchungen am Tiermodell wurde gezeigt, dass im D{\"u}nndarm eine gr{\"o}ßere Menge an Wasser durch die Haferprodukte gebunden wurde, was zu einem h{\"o}heren Feuchtigkeitsanteil der gastrointestinalen Inhalte der Tiere f{\"u}hrte, die ballaststoffreiches Futter erhielten. Trotz der hydrothermischen Behandlung w{\"a}hrend der Extrusion wurden Produkte gewonnen, deren β-Glucane im hochmolekularen Zustand erhalten blieben und somit eine hohe Viskosit{\"a}t in w{\"a}ssrigen L{\"o}sungen beibehielten. In rheologischen Untersuchungen wurde best{\"a}tigt, dass die aus Haferprodukten isolierten β-Glucane ein pseudoplastisches Fließverhalten besitzen. Demgegen{\"u}ber f{\"u}hrte ein Autoklavieren der Produkte zu einer starken Depolymerisation der b-Glucane, was sich in einer {\"A}nderung der funktionellen Eigenschaften der b-Glucane widerspiegelte. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen ern{\"a}hrungsphysiologische In-vitro- und In-vivo-Experimente mit Extrudaten und Proben auf der Basis von Hafer, die einen erh{\"o}hten Anteil an Ballaststoffen, speziell an b-Glucan und an resistenter St{\"a}rke, besaßen und die direkt verzehrbar sind. Diese Haferprodukte zeigten eine Reihe von ern{\"a}hrungsphysiologisch vorteilhaften und protektiven Wirkungen in In-vitro-Experimenten. So traten sie mit Gallens{\"a}uren unter den Bedingungen des D{\"u}nndarms in Wechselwirkung und waren gut mit Faecesflora vom Menschen fermentierbar. Die In-vitro-Verdauung von Maisst{\"a}rke durch Pankreatin, wurde durch die ballaststoffreichen Haferprodukte partiell gehemmt. Dieser Befund l{\"a}sst eine Abschw{\"a}chung des postprandialen Glukoseanstieges erwarten. In einem sechsw{\"o}chigen F{\"u}tterungsversuch erhielten Ratten Di{\"a}ten, die zu 50 \% aus ballaststoffreichen Haferprodukten bestanden. Diese Haferprodukte bewirkten einen erh{\"o}hten Transport von Gallens{\"a}uren und neutralen Sterolen in den unteren Intestinaltrakt sowie deren verst{\"a}rkte Ausscheidung. Durch den Verzehr der ballaststoffreichen Haferprodukte kam es zu Ver{\"a}nderungen in der Mikroflora, wobei sich besonders die coliformen Keime verminderten und die Keimzahlen der Lactobacillen sowie die Bifidobakterien erh{\"o}hten. Die Fermentation der Ballaststoffe f{\"u}hrte zur erh{\"o}hten Bildung von kurzkettigen Fetts{\"a}uren einschließlich von Butyrat. Die Bildung der kurzkettigen Fetts{\"a}uren geht mit einer pH-Wert-Absenkung im Caecum und Colon einher, die wiederum f{\"u}r eine geringere Bildung von sekund{\"a}ren Gallens{\"a}uren verantwortlich ist. Die Ergebnisse des F{\"u}tterungsversuchs an Ratten wurden prinzipiell durch eine vierw{\"o}chige Pilotstudie am Menschen, in der Probanden t{\"a}glich 100 g Haferextrudat erhielten, best{\"a}tigt. Das Extrudat wurde von den Probanden gut akzeptiert. In der 4. Woche wurden eine geringe Abnahme der Cholesterolfraktionen im Serum, h{\"o}here Keimzahlen f{\"u}r Lactobacillen, Bifidobacterien und Bacteroides, geringere pH-Werte und Trockenmassegehalte in den Faeces, eine Zunahme der individuellen und Gesamt-SCFA sowie des Butyratanteils in den Faeces, eine erh{\"o}hte Ausscheidung an Steroiden, eine Zunahme der prim{\"a}ren Gallens{\"a}uren und eine Abnahme des prozentualen Anteils an sekund{\"a}ren Gallens{\"a}uren sowie der Cholesterol-Metaboliten gefunden. Diese Parameter gingen 2 Wochen nach Beendigung der Intervention mit dem Haferextrudat wieder in Richtung der Ausgangswerte (0. Woche) zur{\"u}ck. Die untersuchten Haferprodukte erwiesen sich als gut fermentierbare Substrate f{\"u}r die intestinale Mikroflora und k{\"o}nnen deshalb als ein Pr{\"a}biotikum mit Ballaststoffcharakter eingesch{\"a}tzt werden. Diese Produkte, die mit einem erh{\"o}hten Anteil an resistenter St{\"a}rke und wertvollen Haferballaststoffen hergestellt wurden, k{\"o}nnen dazu beitragen, die Ballaststoffl{\"u}cke in unserer Ern{\"a}hrung zu schließen und positive ern{\"a}hrungsphysiologische Effekte zu bewirken.}, subject = {Ballaststoffe}, language = {de} } @phdthesis{Kuehnel2005, author = {K{\"u}hnel, Dana}, title = {Histologische und molekulargenetische Analyse von Darmgeweben aus mit dem humanrelevanten Kanzerogen 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) behandelten F344-Ratten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-6956}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren beg{\"u}nstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen geh{\"o}rt das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der H{\"a}ufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen {\"u}berein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endg{\"u}ltig bewiesen werden. F{\"u}tterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgef{\"u}hrt, die weit {\"u}ber der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verf{\"u}ttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte gekl{\"a}rt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, pr{\"a}neoplastische L{\"a}sionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gef{\"u}tterten Tiere wiesen weniger L{\"a}sionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabh{\"a}ngigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegen{\"u}ber der Substanz im Vergleich zu {\"a}hnlichen Studien festgestellt. Beide F{\"u}tterungsgruppen zeigten deutlich weniger L{\"a}sionen; als m{\"o}gliche Gr{\"u}nde wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und -zubereitung sowie in der Tierhaltung und -herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entz{\"u}ndungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse l{\"a}sst vermuten, dass PhIP allein {\"u}ber lange Zeitr{\"a}ume aber in geringen Dosen verabreicht nicht f{\"u}r die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen urs{\"a}chlich ist.}, subject = {Dickdarmkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Kollock2007, author = {Kollock, Ronny}, title = {Humane Alkoholdehydrogenasen und Aldehyddehydrogenasen : Bedeutung f{\"u}r den Metabolismus von Methylpyrenderivaten und von 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-15703}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2007}, abstract = {Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (alk-PAK) kommen zusammen mit rein aromatischen polyzyklischen Kohlenwasserstoffen u.a. im Zigarettenrauch, Dieselabgasen sowie einigen Lebensmitteln (z.B. Freilandgem{\"u}se, planzliche {\"O}le und Fette) vor. Benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfokonjugation ist ein wichtiger Bioaktivierungsweg f{\"u}r einige alk-PAK. Oxidation der benzylischen Alkohole durch Alkoholdehydrogenasen (ADH) und Aldehyddehydrogenasen (ALDH) zur Carbons{\"a}ure k{\"o}nnte einen wichtigen Detoxifizierungsweg in Konkurrenz zur Aktivierung durch Sulfotransferasen (SULT) darstellen, was f{\"u}r 1-Hydroxymethylpyren in der Ratte bereits gezeigt wurde (Ma, L., Kuhlow, A. \& Glatt, H. (2002). Polycyclic Aromat Compnds 22, 933-946). Durch Hemmung der ADH und/oder ALDH ist eine verst{\"a}rkte Aktivierung zu erwarten, wie in der besagten Studie ebenfalls nachgewiesen wurde. Insbesondere Ethanol kommt in diesem Zusammenhang eine Rolle als m{\"o}glicher Risikofaktor f{\"u}r alk-PAK induzierte Kanzerogenese zu. Menschen konsumieren h{\"a}ufig große Mengen Ethanol und oft besteht eine Koexposition mit alk-PAK (z.B. durch Rauchen). {\"A}hnliches gilt f{\"u}r 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural (HMF), einem Pyrolyseprodukt reduzierender Zucker, dem gegen{\"u}ber Menschen in recht hohen Mengen exponiert sind. Auch bei HMF steht der ADH- und ALDH-vermittelte oxidative Metabolismus in Konkurrenz zu einer Aktivierung durch Sulfokonjugation. Um die Bedeutung humaner ADH und ALDH im Metabolismus von alk-PAK und von HMF aufzukl{\"a}ren, wurden alle bekannten humanen ADH sowie die humanen ALDH2 und 3A1 (aus theoretischen {\"U}berlegungen heraus die vielversprechendsten Formen) f{\"u}r kinetische Analysen in Bakterien exprimiert. Als Enzymquelle dienten zytosolische Pr{\"a}parationen und durch Anionenaustauschchromatographie partiell gereinigte Enzyme. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass prim{\"a}re benzylische Alkohole von Methyl- und Dimethylpyrenen gute Substrate humaner ADH sind. Sekund{\"a}re benzylische Alkohole und benzylische Alkohole von alk-PAK mit gr{\"o}ßerem Kohlenwasserstoffgrundger{\"u}st erwiesen sich dagegen als schlechte Substrate. Vier Formen (ADH1C, 2, 3 und 4) wurden n{\"a}her analysiert. Dazu wurden sie partiell gereinigt, prim{\"a}r um die st{\"o}rende endogene Bakterien-ADH zu eliminieren. Alle untersuchten ADH waren in der Lage Pyrenylmethanole zu oxidieren. Insbesondere ADH2 katalysierte die Oxidation der Pyrenylmethanole effizient, aber auch f{\"u}r ADH1C und 4 waren die Pyrenylmethanole gute Substrate. ADH3 oxidierte die Pyrenylmethanole mit geringer katalytischer Effizienz. Die Reduktion der entsprechenden Pyrenaldehyde durch ADH1C, 2 und 4 wurde mit noch h{\"o}herer Effizienz katalysiert als die Oxidation der Pyrenylmethanole, was die Bedeutung von ALDH f{\"u}r die effiziente Detoxifizierung dieser Verbindungen unterstreicht. In einer an diese Arbeit angelehnten Diplomarbeit (Rost, K. (2007). Universit{\"a}t Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakult{\"a}t) wurde auch tats{\"a}chlich gezeigt, dass humane ALDH2 aber auch ALDH3A1 in der Lage sind, die Pyrenaldehyde zu Pyrenylcarbons{\"a}uren zu oxidieren. Die bestimmten kinetischen Parameter legen nahe, dass insbesondere ALDH2 von Bedeutung f{\"u}r die Detoxifizierung von Methyl- und Dimethylpyrenen ist. Schon allein auf Grund der an der Detoxifizierung beteiligten Enzyme ist Ethanolaufnahme bei Koexposition mit Pyrenderivaten als Risiokofaktor anzusehen. Es ist wahrscheinlich, dass Ethanol und, nach dessen Oxidation, Acetaldehyd als konkurrierende Substrate die ADH- und ALDH-katalysierte Oxidation von Pyrenylmethanolen bzw. Pyrenaldehyden inhibieren und somit zu einer verst{\"a}rkten SULT-vermittelten Aktivierung der Pyrenylmethanole f{\"u}hren. In der Tat wurde eine effiziente Inhibition der ADH2-katalysierten Oxidation von 1-Hydroxymethylpyren und von 1-(Hydroxymethyl)-8-methylpyren durch physiologisch relevante Ethanolkonzentrationen nachgewiesen. Drei humane ADH (4, 2 und 3), die HMF effizient zum 2,5-Diformylfuran oxidieren k{\"o}nnen, wurden identifiziert. Durch ALDH-katalysierte Weiteroxidation dieser Substanz entsteht schließlich 2,5-Furandicarbons{\"a}ure, die nach HMF-Exposition auch tats{\"a}chlich im menschlichen Urin gefunden wurde (Jellum, E., B{\o}rresen, H. C. \& Eldjarn, L. (1973). Clin Chim Acta 47, 191-201). Weiter wurde gezeigt, dass ALDH3A1, aber auch ALDH2 HMF effizient zur 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarbons{\"a}ure (HMFA) oxidieren k{\"o}nnen, ein weiterer nachgewiesener HMF Metabolit in vivo. Dass die ADH-katalysierte Oxidation von HMFA und nachfolgende ALDH-katalysierte Oxidation zur Bildung von 2,5-Furandicarbons{\"a}ure einen nennenswerten Anteil betr{\"a}gt, kann aufgrund der kinetischen Daten f{\"u}r HMFA als Substrat humaner ADH ausgeschlossen werden. Die beobachteten Enzymaktivit{\"a}ten lassen den Schluss zu, dass Ethanolaufnahme zu einer Reduktion des oxidativen HMF Metabolismus f{\"u}hrt und somit eine Aktivierung von HMF durch Sulfokonjugation beg{\"u}nstigt.}, language = {de} } @phdthesis{Scheinemann2014, author = {Scheinemann, Hendrik Alexander}, title = {Hygienisierung von Rinderg{\"u}lle und Kl{\"a}rschl{\"a}mmen mittels milchsaurer Fermentation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77949}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {xviii, 172}, year = {2014}, abstract = {Tierische und menschliche F{\"a}kalien aus Landwirtschaft und Haushalten enthalten zahlreiche obligat und opportunistisch pathogene Mikroorganismen, deren Konzentration u. a. je nach Gesundheitszustand der betrachteten Gruppe schwankt. Neben den Krankheitserregern enthalten F{\"a}kalien aber auch essentielle Pflanzenn{\"a}hrstoffe (276) und dienen seit Jahrtausenden (63) als D{\"u}nger f{\"u}r Feldfr{\"u}chte. Mit der unbedarften Verwendung von pathogenbelastetem F{\"a}kald{\"u}nger steigt jedoch auch das Risiko einer Infektion von Mensch und Tier. Diese Gefahr erh{\"o}ht sich mit der globalen Vernetzung der Landwirtschaft, z. B. durch den Import von kontaminierten Futter- bzw. Lebensmitteln (29). Die vorliegende Arbeit stellt die milchsaure Fermentation von Rinderg{\"u}lle und Kl{\"a}rschlamm als alternative Hygienisierungsmethode gegen{\"u}ber der Pasteurisation in Biogasanlagen bzw. gebr{\"a}uchlichen Kompostierung vor. Dabei wird ein Abfall der Gram-negativen Bakterienflora sowie der Enterokokken, Schimmel- und Hefepilze unter die Nachweisgrenze von 3 log10KbE/g beobachtet, gleichzeitig steigt die Konzentration der Lactobacillaceae um das Tausendfache. Dar{\"u}ber hinaus wird gezeigt, dass pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, EHEC O:157 und vegetative Clostridum perfringens-Zellen innerhalb von 3 Tagen inaktiviert werden. Die Inaktivierung von ECBO-Viren und Spulwurmeiern erfolgt innerhalb von 7 bzw. 56 Tagen. Zur Aufkl{\"a}rung der Ursache der beobachteten Hygienisierung wurde das fermentierte Material auf fl{\"u}chtige Fetts{\"a}uren sowie pH-Wert{\"a}nderungen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die gemessenen Werte nicht die alleinige Ursache f{\"u}r das Absterben der Erreger sind, vielmehr wird eine zus{\"a}tzliche bakterizide Wirkung durch eine mutmaßliche Bildung von Bakteriozinen in Betracht gezogen. Die parasitizide Wirkung wird auf die physikalischen Bedingungen der Fermentation zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. Die methodischen Grundlagen basieren auf Analysen mittels zahlreicher klassisch-kultureller Verfahren, wie z. B. der Lebendkeimzahlbestimmung. Dar{\"u}ber hinaus findet die MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die klassische PCR in Kombination mit der Gradienten-Gelelektrophorese Anwendung, um kultivierbare Bakterienfloren zu beschreiben bzw. nicht kultivierbare Bakterienfloren stichprobenartig zu erfassen. Neben den Aspekten der Hygienisierung wird zudem die Eignung der Methode f{\"u}r die landwirtschaftliche Nutzung ber{\"u}cksichtigt. Dies findet sich insbesondere in der Komposition des zu fermentierenden Materials wieder, welches f{\"u}r die verst{\"a}rkte Humusakkumulation im Ackerboden optimiert wurde. Dar{\"u}ber hinaus wird die Masseverlustbilanz w{\"a}hrend der milchsauren Fermentation mit denen der Kompostierung sowie der Verarbeitung in der Biogasanlage verglichen und als positiv bewertet, da sie mit insgesamt 2,45 \% sehr deutlich unter den bisherigen Alternativen liegt (73, 138, 458). Weniger Verluste an organischem Material w{\"a}hrend der Hygienisierung f{\"u}hren zu einer gr{\"o}ßeren verwendbaren D{\"u}ngermenge, die auf Grund ihres organischen Ursprungs zu einer Verst{\"a}rkung des Humusanteiles im Ackerboden beitragen kann (56, 132).}, language = {de} } @phdthesis{Ringleb2004, author = {Ringleb, Jennifer}, title = {Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001901}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz f{\"u}r die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbest{\"a}nde. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entz{\"u}ndungsreaktionen ausl{\"o}senden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und k{\"o}nnen somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden f{\"u}r die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein \„Vakzin-Design\“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide f{\"u}r die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zun{\"a}chst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antik{\"o}rpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze gepr{\"u}ft. Zur Untersuchung der Immunogenit{\"a}t der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen f{\"u}r die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der St{\"a}rke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgesch{\"a}tzt.}, language = {de} } @phdthesis{Connor2016, author = {Connor, Daniel Oliver}, title = {Identifikation und Charakterisierung neuer immunogener Proteine und anschließende Generierung rekombinanter Antik{\"o}rper mittels Phage Display}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-104120}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {VII, 112, lv Seiten}, year = {2016}, abstract = {Seit der Einf{\"u}hrung von Antibiotika in die medizinische Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten existiert ein Wettlauf zwischen der Evolution von Bakterienresistenzen und der Entwicklung wirksamer Antibiotika. W{\"a}hrend bis in die 80er Jahre verst{\"a}rkt an neuen Antibiotika geforscht wurde, gewinnen multiresistente Keime heute zunehmend die Oberhand. Um einzelne Pathogene erfolgreich nachzuweisen und zu bek{\"a}mpfen, ist ein grundlegendes Wissen {\"u}ber den Erreger unumg{\"a}nglich. Bakterielle Proteine, die bei einer Infektion vorrangig vom Immunsystem prozessiert und pr{\"a}sentiert werden, k{\"o}nnten f{\"u}r die Entwicklung von Impfstoffen oder gezielten Therapeutika n{\"u}tzlich sein. Auch f{\"u}r die Diagnostik w{\"a}ren diese immundominanten Proteine interessant. Allerdings herrscht ein Mangel an Wissen {\"u}ber spezifische Antigene vieler pathogener Bakterien, die eine eindeutige Diagnostik eines einzelnen Erregers erlauben w{\"u}rden. Daher wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Humanpathogene mittels Phage Display untersucht: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Hierf{\"u}r wurden aus der genomischen DNA der vier Erreger Bibliotheken konstruiert und durch wiederholte Selektion und Amplifikation, dem sogenannten Panning, immunogene Proteine isoliert. F{\"u}r alle Erreger bis auf C. difficile wurden immunogene Proteine aus den jeweiligen Bibliotheken isoliert. Die identifizierten Proteine von N. meningitidis und B. burgdorferi waren gr{\"o}ßtenteils bekannt, konnten aber in dieser Arbeit durch Phage Display verifiziert werden. F{\"u}r N. gonorrhoeae wurden 21 potentiell immunogene Oligopeptide isoliert, von denen sechs Proteine als neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Charakter identifiziert wurden. Von den Phagen-pr{\"a}sentierten Oligopeptide der 21 immunogenen Proteine wurden Epitopmappings mit verschiedenen polyklonalen Antik{\"o}rpern durchgef{\"u}hrt, um immunogene Bereiche n{\"a}her zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei zehn Proteinen wurden lineare Epitope eindeutig mit drei polyklonalen Antik{\"o}rpern identifiziert, von f{\"u}nf weiteren Proteinen waren Epitope mit mindestens einem Antik{\"o}rper detektierbar. F{\"u}r eine weitere Charakterisierung der ermittelten Epitope wurden Alaninscans durchgef{\"u}hrt, die eine detaillierte Auskunft {\"u}ber kritische Aminos{\"a}uren f{\"u}r die Bindung des Antik{\"o}rpers an das Epitop geben. Ausgehend von dem neu identifizierten Protein mit immunogenem Charakter NGO1634 wurden 26 weitere Proteine aufgrund ihrer funktionellen {\"A}hnlichkeit ausgew{\"a}hlt und mithilfe bioinformatischer Analysen auf ihre Eignung zur Entwicklung einer diagnostischen Anwendung analysiert. Durch Ausschluss der meisten Proteine aufgrund ihrer Lokalisation, Membrantopologie oder unspezifischen Proteinsequenz wurden scFv-Antik{\"o}rper gegen acht Proteine mittels Phage Display generiert und anschließend als scFv-Fc-Fusionsantik{\"o}rper produziert und charakterisiert. Die hier identifizierten Proteine und linearen Epitope k{\"o}nnten einen Ansatzpunkt f{\"u}r die Entwicklung einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bieten. Lineare Epitopsequenzen werden h{\"a}ufig f{\"u}r die Impfstoffentwicklung eingesetzt, sodass vor allem die in dieser Arbeit bestimmten Epitope von Membranproteinen interessante Kandidaten f{\"u}r weitere Untersuchungen in diese Richtung sind. Durch weitere Untersuchungen k{\"o}nnten m{\"o}glicherweise unbekannte Virulenzfaktoren entdeckt werden, deren Inhibierung einen entscheidenden Einfluss auf Infektionen haben k{\"o}nnten.}, language = {de} } @phdthesis{Kammel2018, author = {Kammel, Anne}, title = {Identifizierung fr{\"u}her epigenetischer Ver{\"a}nderungen, die zur Ausbildung einer Fettleber beitragen}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {130}, year = {2018}, language = {de} } @phdthesis{Schroeder2015, author = {Schr{\"o}der, Christine}, title = {Identifizierung und Charakterisierung der Isoflavon-umsetzenden Enzyme aus dem humanen Darmbakterium Slackia isoflavoniconvertens}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-80065}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {X, 129}, year = {2015}, abstract = {Aufgrund ihrer potenziell gesundheitsf{\"o}rdernden Wirkung sind die polyphenolischen Isoflavone f{\"u}r die menschliche Ern{\"a}hrung von großem Interesse. Eine Vielzahl an experimentellen und epidemiologischen Studien zeigen f{\"u}r die in Soja enthaltenen Isoflavone Daidzein und Genistein eine pr{\"a}ventive Wirkung bez{\"u}glich hormon-abh{\"a}ngiger und altersbedingter Erkrankungen, wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie des menopausalen Syndroms. Die Metabolisierung und Bioaktivierung dieser sekund{\"a}ren Pflanzenstoffe durch die humane intestinale Darmmikrobiota ist individuell unterschiedlich. Nur in einem geringen Teil der westlichen Bev{\"o}lkerung wird der Daidzein-Metabolit Equol durch spezifische Darmbakterien gebildet. Ein isoliertes Equol-produzierendes Bakterium des menschlichen Darmtrakts ist Slackia isoflavoniconvertens. Anhand dieser Spezies sollten die bislang unbekannten, an der Umsetzung von Daidzein und Genistein beteiligten Enzyme identifiziert und charakterisiert werden. Fermentationsexperimente mit S. isoflavoniconvertens zeigten, dass die Gene der Daidzein und Genistein-umsetzenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern induziert werden m{\"u}ssen. Mit Hilfe der zweidimensionalen differentiellen Gelelektrophorese wurden sechs Proteine detektiert, welche in einer S. isoflavoniconvertens-Kultur in Anwesenheit von Daidzein induziert wurden. Auf Grundlage einzelner Peptidsequenzen erfolgte die Sequenzierung eines Genkomplexes mit den in gleicher Orientierung angeordneten Genen der durch Daidzein induzierten Proteine. Sequenzvergleiche identifizierten zudem {\"a}quivalente Genprodukte zu den Proteinen von S. isoflavoniconvertens in anderen Equolproduzierenden Bakterien. Nach der heterologen Expression in Escherichia coli wurden drei dieser Gene durch enzymatische Aktivit{\"a}tstests als Daidzein-Reduktase (DZNR), Dihydrodaidzein-Reduktase (DHDR) und Tetrahydrodaidzein-Reduktase (THDR) identifiziert. Die Kombination der E. coli-Zellextrakte f{\"u}hrte zur vollst{\"a}ndigen Umsetzung von Daidzein {\"u}ber Dihydrodaidzein zu Equol. Neben Daidzein setzte die DZNR auch Genistein zu Dihydrogenistein um. Dies erfolgte mit einer gr{\"o}ßeren Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zur Reduktion von Daidzein zu Dihydrodaidzein. Enzymatische Aktivit{\"a}tstests mit dem Zellextrakt von S. isoflavoniconvertens zeigten ebenfalls eine schnellere Umsetzung von Genistein. Die Kombination der rekombinanten DHDR und THDR f{\"u}hrte zur Umsetzung von Dihydrodaidzein zu Equol. Der korrespondierende Metabolit 5-Hydroxyequol konnte als Endprodukt des Genistein-Metabolismus nicht detektiert werden. Zur Reinigung der drei identifizierten Reduktasen wurden diese genetisch an ein Strep-tag fusioniert und mittels Affinit{\"a}tschromatographie gereinigt. Die {\"u}brigen durch Daidzein induzierten Proteine IfcA, IfcBC und IfcE wurden ebenfalls in E. coli exprimiert und als Strep-Fusionsproteine gereinigt. Vergleichende Aktivit{\"a}tstests identifizierten das induzierte Protein IfcA als Dihydrodaidzein-Racemase. Diese katalysierte die Umsetzung des (R)- und (S)-Enantiomers von Dihydrodaidzein und Dihydrogenistein zum korrespondierenden Racemat. Neben dem Elektronentransfer-Flavoprotein IfcBC wurden auch die THDR, DZNR und IfcE als FAD-haltige Flavoproteine identifiziert. Zudem handelte es sich bei IfcE um ein Eisen-Schwefel-Protein. Nach Induktion der f{\"u}r die Daidzein-Umsetzung kodierenden Gene wurden mehrere verschieden lange mRNA-Transkripte gebildet. Dies zeigte, dass die Transkription des durch Daidzein induzierten Genkomplexes in S. isoflavoniconvertens nicht in Form eines einzelnen Operonsystems erfolgte. Auf Grundlage der identifizierten Daidzein-umsetzenden Enzyme kann der Mechanismus der bakteriellen Umsetzung von Isoflavonen durch S. isoflavoniconvertens eingehend erforscht werden. Die ermittelten Gensequenzen der durch Daidzein induzierten Proteine sowie die korrespondierenden Gene weiterer Equol-produzierender Bakterien bieten zudem die M{\"o}glichkeit der mikrobiellen Metagenomanalyse im humanen Darmtrakt.}, language = {de} } @phdthesis{Baessler2008, author = {B{\"a}ßler, Olivia}, title = {Identifizierung und Charakterisierung IgE- reaktiver Proteine in der Tomate (Lycopersicon esculentum)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-26953}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Zur Detektion neuer IgE- reaktiver Proteine wurde in dieser Arbeit ein zweidimensionales Proteintrennverfahren verwendet. Resultierende Proteinfraktionen wurden mithilfe von 18 tomatensensibiliesierten Patientenseren im Immunoblot getestet. Detektierte Proteine in der SDS-PAGE wurden mittels LC-MS/MS identifiziert. Dadurch konnten 2 Tomatensamenproteine, die im Immunoblot ein IgE- reaktives Signal zeigten eindeutig mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Diese Proteine sind Legumin und Vicilin. Durch Sequenzabgleich und Proteinstrukturmodellierung im Vergleich zu bereits bekannten Allergenen (Erdnuss und Cashewnuss), konnte eine hohe Homologie gezeigt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Nietzsche2016, author = {Nietzsche, Madlen}, title = {Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {xi, 182}, year = {2016}, abstract = {F{\"u}r alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolution{\"a}r konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von N{\"a}hrstoffen und zellul{\"a}rer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege f{\"u}hrt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort f{\"u}hren ist bisher noch nicht ausreichend gekl{\"a}rt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zun{\"a}chst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind {\"u}ber ihre konservierte DUF581Dom{\"a}ne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, f{\"a}hig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung beg{\"u}nstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta best{\"a}tigt werden. Außerhalb der DUF581-Dom{\"a}ne weisen die Proteine einander keine große Sequenz{\"a}hnlichkeit auf. Aufgrund ihrer F{\"a}higkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde f{\"u}r DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise k{\"o}nnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung erm{\"o}glichen. Durch weiterf{\"u}hrende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine f{\"u}r das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde n{\"a}her charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, geh{\"o}rt zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterst{\"u}tzt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich {\"u}ber das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsf{\"a}higkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erh{\"o}hte Spezifit{\"a}t der Zielgenregulation erm{\"o}glicht werden k{\"o}nnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer ver{\"a}nderten STKR1-Expression ph{\"a}notypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. W{\"a}hrend der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen f{\"u}hrte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive {\"U}berexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverz{\"o}gerungen hinsichtlich der Bl{\"u}hinduktion und Seneszenz {\"a}hnlich wie sie auch bei SnRK1α-{\"U}berexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erh{\"o}hten n{\"a}chtlichen St{\"a}rkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-{\"u}berexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verl{\"a}ngerte Dunkelphase, eine gr{\"o}ßere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als w{\"a}hrend der Lichtphase. Dies spricht f{\"u}r eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die w{\"a}hrend der verl{\"a}ngerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1{\"U}berexpression f{\"u}hrte zudem zu einer verst{\"a}rkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verl{\"a}ngerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabh{\"a}ngige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r die ph{\"a}notypischen und physiologischen Auff{\"a}lligkeiten der STKR1-{\"U}berexprimierer liefern.}, language = {de} } @phdthesis{Bufe2003, author = {Bufe, Bernd}, title = {Identifizierung und Charakterisierung von Bitterrezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001130}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2003}, abstract = {Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielf{\"a}ltig: Sie reicht von kleinen Molek{\"u}len wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Gr{\"o}ße der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder gesch{\"a}tzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexit{\"a}t der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies f{\"u}hrt nat{\"u}rlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen k{\"o}nnen denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu k{\"o}nnen oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgef{\"u}hrte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminos{\"a}urestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfl{\"a}che erm{\"o}glicht. Um Liganden f{\"u}r die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe {\"U}bereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache f{\"u}r die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabh{\"a}ngige Beweise f{\"u}r diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, w{\"a}re es m{\"o}glich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tats{\"a}chlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.}, language = {de} } @phdthesis{Reinert2012, author = {Reinert, Armin}, title = {Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von f{\"u}r die arbuskul{\"a}re Mykorrhizasymbiose spezifischen Genen in Medicago truncatula}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-63805}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Die Mykorrhiza (griechisch: m{\´y}kēs f{\"u}r „Pilz"; rhiza f{\"u}r „Wurzel") stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit N{\"a}hrstoffen, w{\"a}hrend die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskul{\"a}re Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei w{\"a}hrend der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des prim{\"a}ren N{\"a}hrstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgef{\"u}hrt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivit{\"a}t der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der gr{\"o}ßten Promotoraktivit{\"a}t waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am st{\"a}rksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zus{\"a}tzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde f{\"u}r drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivit{\"a}ts- studie durchgef{\"u}hrt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, w{\"a}hrend die Aktivit{\"a}t des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. F{\"u}r zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgef{\"u}hrt. Dabei stellte sich in beiden F{\"a}llen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT k{\"o}nnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt m{\"u}sste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch f{\"u}r arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN k{\"o}nnten ebenfalls aufschlussreich f{\"u}r das weitere Verst{\"a}ndnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen.}, language = {de} } @phdthesis{Danckert2018, author = {Danckert, Lena}, title = {Immunscreening Virulenz-adaptierter Expressionsbibliotheken aus einem in vitro Infektionsmodell mit Salmonella Enteritidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421108}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {144}, year = {2018}, abstract = {Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere f{\"u}r Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei geh{\"o}ren Salmonella und Campylobacter zu den h{\"a}ufigsten Erregern, die verantwortlich f{\"u}r gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Pr{\"a}vention und Bek{\"a}mpfung von Salmonellen in Gefl{\"u}gelbest{\"a}nden und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen k{\"o}nnen {\"u}ber Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten k{\"o}nnen. Dabei sind bestehende Pr{\"a}ventionsstrategien f{\"u}r Gefl{\"u}gel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen {\"u}bertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Pr{\"a}vention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf f{\"u}r spezifische, sensitive und zuverl{\"a}ssige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gew{\"a}hrleisten. Durch ein wachsendes Verst{\"a}ndnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektions{\"a}hnliches in vitro Modell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r den Erreger durchgef{\"u}hrt. W{\"a}hrend einer Salmonellen-Infektion ist die erste zellul{\"a}re Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) f{\"u}r die Pathogen-Wirt-Studie ausgew{\"a}hlt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Ph{\"a}notyp f{\"u}r die intrazellul{\"a}ren Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Fl{\"u}ssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zus{\"a}tzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adh{\"a}sion und Transmembran-Transport zu gew{\"a}hrleisten. Letzterer ist charakteristisch f{\"u}r die intrazellul{\"a}re Limitierung von N{\"a}hrstoffen und pr{\"a}gt den infektionsrelevanten Status. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Ph{\"a}notyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und m{\"o}glicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellul{\"a}ren Bakterien m{\"u}ssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt f{\"u}r Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r S. Enteritidis durchgef{\"u}hrt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder erm{\"o}glichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifit{\"a}t oder Membranst{\"a}ndigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektions{\"a}hnlichen Modell durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde deutlich, dass die H{\"a}ufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verf{\"u}gbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu m{\"o}glichen Klonen, die w{\"a}hrend des Microarray-Screenings untersucht werden k{\"o}nnen, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektions{\"a}hnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben. Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant f{\"u}r das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene n{\"a}her untersucht, indem ihr Einfluss im infektions{\"a}hnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-St{\"a}mme analysiert wurde. Dabei wurde f{\"u}r eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der sp{\"a}ten intrazellul{\"a}ren Phase nachgewiesen. Weiterf{\"u}hrende in vitro Analysen sind f{\"u}r die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren. Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind f{\"u}r diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell l{\"a}sst sich ebenso f{\"u}r andere intrazellul{\"a}re Pathogene {\"u}bertragen und gew{\"a}hrleistet eine zuverl{\"a}ssige Identifizierung von potentiellen Antigenen.}, language = {de} } @phdthesis{Sellrie2007, author = {Sellrie, Frank}, title = {Immuntechnologische Verfahren zum Aufbau homogener Immunoassays sowie zur Selektion Antik{\"o}rper produzierender Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-15982}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2007}, abstract = {Homogene Immunoassays sind immunologische Testverfahren, bei deren Durchf{\"u}hrung vollst{\"a}ndig auf Separations- und Waschschritte verzichtet werden kann. Der Substrate Channeling Immunoassay beruht auf der Weitergabe eines Substrates in einem immunologischen Komplex aus zwei Enzymen. Das Produkt des ersten Enzyms dient dem zweiten Enzym als Substrat zur Generierung eines photometrisch nachweisbaren Produktes. Voraussetzung f{\"u}r diese Weitergabe ist die enge r{\"a}umliche N{\"a}he beider Enzyme. Diese N{\"a}he wird durch eine Bindung zwischen Analyt und anti-Analyt Antik{\"o}rper vermittelt. Ein solcher Substrate Channeling Immunoassay wurde unter Verwendung der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase aufgebaut. Das so etablierte System war funktionst{\"u}chtig, jedoch blieb seine Sensitivit{\"a}t hinter der normaler, heterogener Immunoassays zur{\"u}ck. Die Grundlage eines Fluorescence Quenching Immunoassays ist der gegenseitige Ausschluß zweier Antik{\"o}rper bei der Bindung eines Dihapten-Konjugates. Das Konjugat besteht dabei aus dem Analyten und einem Fluorophor. Die beiden um die Konjugatbindung konkurrierenden Antik{\"o}rper sind ein anti-Analyt Antik{\"o}rper und ein anti-Fluorophor Antik{\"o}rper, der zudem {\"u}ber die Eigenschaft verf{\"u}gt, bei Bindung des Fluorophors dessen Fluoreszenz zu l{\"o}schen. Externe Gaben des freien Analyten verschieben das eingestellte Gleichgewicht in Richtung Fluorophor-Bindung und damit Fluoreszenz-L{\"o}schung. Die {\"A}nderung der Fluoreszenz ist direkt an die Konzentration des freien Analyten gekoppelt und dient zu deren Bestimmung. Ein solcher Fluorescence Quenching Immunoassays wurde f{\"u}r die Konzentrationsbestimmung des Herbizides Diuron etabliert. Die erreichten Sensitivit{\"a}ten erlauben die praktische, immundiagnostische Anwendung des Systems. Ein Dihapten-Konjugat wurde ebenfalls zum Aufbau eines Verfahrens zur Selektion Antik{\"o}rper produzierender Zellen eingesetzt. Die Selektion der Antik{\"o}rper produzierenden Zellen erfolgt unter Verwendung eines Toxinkonjugates. Dieses Konjugat besteht aus einem Liganden und einem Toxin. Die Antik{\"o}rperbindung des Liganden behindert sterisch die Wechselwirkung der Toxinkomponente im Konjugat mit deren Zielstruktur in oder auf der Zelle. Nur Zellen die einen geeigneten Antik{\"o}rper sezernieren, {\"u}berleben die Selektion und reichern sich in der Kultur an. Das Selektionsverfahren wurde erfolgreich f{\"u}r die Selektion von E.coli Zellen eingesetzt, die einen rekombinanten, Fluorescein bindenden Antik{\"o}rper produzierten. Das hierf{\"u}r synthetisierte Toxinkonjugat bestand aus Fluorescein (Ligand) und Ampicillin (Toxinkomponente). Eine Abl{\"o}sung der bisher f{\"u}r diese Aufgabe gebr{\"a}uchlichen, außerordentlich kostenintensiven, Screening Methoden wird damit m{\"o}glich.}, language = {de} } @phdthesis{Gottmann2019, author = {Gottmann, Pascal}, title = {In silico Analyse zur Kl{\"a}rung der Beteiligung von micro-RNAs, die in QTL lokalisiert sind, an den metabolischen Erkrankungen Adipositas und Typ-2-Diabetes mit Hilfe von Mausmodellen}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XIII, 106}, year = {2019}, language = {de} } @phdthesis{Fischbach2017, author = {Fischbach, Jens}, title = {Isothermale Amplifikationsmethoden f{\"u}r den DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Pathogennachweis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {viii, 125}, year = {2017}, abstract = {Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleins{\"a}ure-basierte Methoden f{\"u}r den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchf{\"u}hrbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleins{\"a}ure-basierten Diagnostik kann durch die Einf{\"u}hrung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kosteng{\"u}nstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielf{\"a}ltige Detektionsm{\"o}glichkeiten, die sowohl f{\"u}r Schnelltest- als auch f{\"u}r Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode f{\"u}r den einfachen, schnellen und g{\"u}nstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abh{\"a}ngiger Detektionsverfahren. Hier wurden zun{\"a}chst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abh{\"a}ngige Fluoreszenzfarbstoffe f{\"u}r die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden k{\"o}nnen. Als Alternative f{\"u}r die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe f{\"u}r den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus f{\"u}r die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: F{\"u}r den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivit{\"a}t zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegen{\"u}ber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zus{\"a}tzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen f{\"u}r die Endpunktdetektion verwendet werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das f{\"u}r den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch f{\"u}r die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zus{\"a}tzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abh{\"a}ngige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP {\"u}ber das Pyrophosphat identifiziert werden. Daf{\"u}r wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilit{\"a}t und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden k{\"o}nnen. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit zwischen den einzelnen Komponenten f{\"u}r einen fluorimetrischen Verdr{\"a}ngungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verh{\"a}ltnis' als Intensit{\"a}tsmatrix (heatmap) konnten zun{\"a}chst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als g{\"u}nstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abh{\"a}ngige Zunahme der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich f{\"u}r die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilit{\"a}t und Homogenit{\"a}t der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tr{\"o}pfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S m{\"o}glich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gew{\"a}hrleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die R{\"u}ckfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivit{\"a}t am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur m{\"o}glich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification" (HIP) konnte abschließend durch die Verk{\"u}rzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-{\"a}hnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsf{\"a}higen Alternative f{\"u}r die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsf{\"a}higkeit der qualitativen und quantitativen LAMP f{\"u}r die Feldanwendungen und f{\"u}r die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden k{\"o}nnen und so eine einfache Pathogendiagnostik erm{\"o}glichen. Die gezeigten Methoden k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegen{\"u}ber den herk{\"o}mmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP f{\"u}r den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei k{\"o}nnen die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngigen Reaktionen erm{\"o}glicht dar{\"u}ber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zuk{\"u}nftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik m{\"o}glich.}, language = {de} } @phdthesis{Born2012, author = {Born, Stephan}, title = {Kartierung der Bindungstasche des humanen Bittergeschmacksrezeptors hTAS2R10}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-61392}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen k{\"o}nnen die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen k{\"o}nnen sowohl sch{\"a}dlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit f{\"o}rderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren k{\"o}nnen. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergest{\"u}tzte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausf{\"u}hrlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 {\"u}berein. Die f{\"u}r die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandom{\"a}nen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandom{\"a}nen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen H{\"a}lfte des zum extrazellul{\"a}ren Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte f{\"u}r die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminos{\"a}uren in Position 3.29 und 5.40 ausgepr{\"a}gte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgef{\"a}cherte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivit{\"a}t f{\"u}r einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolution{\"a}re Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren pr{\"a}gen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse k{\"o}nnen genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik w{\"a}ren, als auch dazu genutzt werden k{\"o}nnten, den unerw{\"u}nschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsf{\"o}rdernden sekund{\"a}ren Pflanzenstoffen zu mindern. Damit k{\"o}nnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden.}, language = {de} } @phdthesis{Lettau2007, author = {Lettau, Kristian}, title = {Katalytische molekular gepr{\"a}gte Polymere : Herstellung und Anwendung in einem Thermistor}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-14804}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2007}, abstract = {Biomakromolek{\"u}le sind in der Natur f{\"u}r viele Abl{\"a}ufe in lebenden Organismen verantwortlich. Dies reicht vom Aufbau der extrazellul{\"a}ren Matrix und dem Cytoskelett {\"u}ber die Erkennung von Botenstoffen durch Rezeptoren bis hin zur Katalyse der verschiedensten Reaktionen in den Zellen selbst. Diese Aufgaben werden zum gr{\"o}ßten Teil von Proteinen {\"u}bernommen, und besonders das spezifische Erkennen der Interaktionspartner ist f{\"u}r alle diese Molek{\"u}le {\"a}ußerst wichtig, um eine fehlerfreie Funktion zu gew{\"a}hrleisten. Als Alternative zur evolutiven Erzeugung von optimalen Bindern und Katalysatoren auf der Basis von Aminos{\"a}uren und Nukleotiden wurden von Wulff, Shea und Mosbach synthetische molekular gepr{\"a}gte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) konzipiert. Das Prinzip dieser k{\"u}nstlichen Erkennungselemente beruht auf der Tatsache, dass sich funktionelle Monomere spezifisch um eine Schablone (Templat) anordnen. Werden diese Monomere dann vernetzend polymerisiert, entsteht ein Polymer mit molekularen Kavit{\"a}ten, in denen die Funktionalit{\"a}ten komplement{\"a}r zum Templat fixiert sind. Dadurch ist die selektive Bindung des Templats in diese Kavit{\"a}ten m{\"o}glich. Aufgrund ihrer hohen chemischen und thermischen Stabilit{\"a}t und ihrer geringen Kosten haben "bio-inspirierte" molekular gepr{\"a}gte Polymere das Potential, biologische Erkennungselemente in der Affinit{\"a}tschromatographie sowie in Biosensoren und Biochips zu ersetzen. Trotz einiger publizierter Sensorkonfigurationen steht der große Durchbruch noch aus. Ein Hindernis f{\"u}r Routineanwendungen ist die Signalgenerierung bei Bindung des Analyten an das Polymer. Eine M{\"o}glichkeit f{\"u}r die markerfreie Detektion ist die Benutzung von Kalorimetern, die Bindungs- oder Reaktionsw{\"a}rmen direkt messen k{\"o}nnen. In der Enzymtechnologie wird der Enzym-Thermistor f{\"u}r diesen Zweck eingesetzt, da enzymatische Reaktionen eine Enthalpie in einer Gr{\"o}ßenordnung von 5 - 100 kJ/mol besitzen. In dieser Arbeit wird die Herstellung von katalytisch gepr{\"a}gten Polymeren nach dem Verfahren des Oberfl{\"a}chenpr{\"a}gens erstmalig beschrieben. Die Methode zur Immobilisierung des Templats auf der Oberfl{\"a}che von por{\"o}sem Kieselgel sowie die Polymerzusammensetzung wurden optimiert. Weiter wird die Evaluation der katalytischen Eigenschaften {\"u}ber einen optischen Test, sowie das erste Mal die Kombination eines kalorimetrischen Transduktors - des Thermistors - mit der Analyterkennung durch ein katalytisch aktives MIP gezeigt. Bei diesen Messungen konnte zum ersten Mal gleichzeitig die Bindung/Desorption, sowie die katalytische Umwandlung des Substrats durch konzentrationsabh{\"a}ngige W{\"a}rmesignale nachgewiesen werden.}, language = {de} } @phdthesis{Troppmann2009, author = {Troppmann, Britta}, title = {Klonierung und Charakterisierung aminerger Rezeptoren der Amerikanischen Schabe Periplaneta americana}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-36619}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen vornehmlich {\"u}ber die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bei Insekten wurde eine Vielzahl von Wirkungen biogener Amine beschrieben. Das f{\"u}hrte schon fr{\"u}hzeitig zur Vermutung, dass Insekten (u. a. Invertebraten) wie die Wirbeltiere ein diverses Repertoire an aminergen Rezeptoren besitzen. F{\"u}r ein umfassendes Verst{\"a}ndnis der komplexen physiologischen Wirkungen biogener Amine fehlten jedoch wichtige Informationen {\"u}ber die molekulare Identit{\"a}t der entsprechenden Rezeptorproteine und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihre Lokalisation und ihre intrazellul{\"a}ren Reaktionspartner. Viele bei Schaben gut untersuchte (neuro)physiologische Prozesse sowie Verhaltensweisen werden durch Serotonin und Dopamin gesteuert bzw. moduliert. {\"U}ber die beteiligten Rezeptoren ist jedoch bisher vergleichsweise wenig bekannt. Die Klonierung und Charakterisierung von Serotonin- und Dopaminrezeptoren der Amerikanischen Schabe P. americana ist damit ein l{\"a}ngst {\"u}berf{\"a}lliger Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verst{\"a}ndnis der vielf{\"a}ltigen Wirkungen biogener Amine bei Insekten. Durch die Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien konnten cDNAs isoliert werden, die f{\"u}r potentielle Serotoninrezeptoren und einen Dopaminrezeptor kodieren. Die Sequenzen weisen die gr{\"o}ßte {\"A}hnlichkeit zu Mitgliedern der 5-HT1- und 5-HT7-Rezeptorklassen bzw. den Invertebratentyp-Dopaminrezeptoren auf. Die isolierten Rezeptoren der Amerikanischen Schabe wurden dementsprechend Pea(Periplaneta americana)5-HT1, Pea5-HT7 und PeaDop2 benannt. Das Hydropathieprofil dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenzen zeigen typische Merkmale aminerger Rezeptoren. So sind Aminos{\"a}uren, die bedeutend f{\"u}r die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G﷓Proteine sind, in den Rezeptoren konserviert. Expressionsstudien zeigten eine auffallend hohe Expression aller drei Rezeptor-mRNAs im Gehirn sowie in den Speicheldr{\"u}sen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden polyklonale Antik{\"o}rper gegen den Pea5-HT1-Rezeptor sowie den PeaDop2-Rezeptor hergestellt. Der anti-Pea5-HT1-Antik{\"o}rper detektiert im Homogenat von Schabengehirnen, Speicheldr{\"u}sen und Pea5-HT1-exprimierenden HEK 293-Zellen die glykosylierte Form des Rezeptors. In Gehirnschnitten markiert der anti-Pea5-HT1-Antik{\"o}rper spezifisch einige Zellk{\"o}rper in der Pars intercerebralis und deren Axone, welche in den Corpora cardiaca Nerv I projizieren. Der PeaDop2-Rezeptor wurde durch den spezifischen anti-PeaDop2-Antik{\"o}rper in Neuronen mit Somata im anterioren Randbereich der Medulla nachgewiesen. Diese Neurone innervieren die optischen Loben und projizieren in das ventrolaterale Protocerebrum. Die intrazellul{\"a}ren Signalwege der heterolog exprimierten Pea5-HT1- und PeaDop2-Rezeptoren wurden in HEK 293-Zellen untersucht. Die Aktivierung des Pea5-HT1-Rezeptors durch Serotonin f{\"u}hrt zur Hemmung der cAMP-Synthese. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Rezeptor konstitutive Aktivit{\"a}t besitzt. WAY 100635, ein hoch selektiver 5-HT1A-Rezeptorantagonist, wurde als wirksamer inverser Agonist am Pea5-HT1-Rezeptor identifiziert. Der stabil exprimierte PeaDop2-Rezeptor antwortet auf eine Aktivierung durch Dopamin mit einer Erh{\"o}hung der cAMP-Konzentration. Eine C-terminal trunkierte Variante dieses Rezeptors ist eigenst{\"a}ndig nicht funktional. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit indizieren, dass die untersuchten aminergen Rezeptoren im zentralen Nervensystems der Schabe an der Informationsverarbeitung beteiligt sind und verschiedene physiologische Prozesse in peripheren Organen regulieren. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung der ersten Serotoninrezeptoren und eines Dopaminrezeptors ist damit eine wichtige Grundlage f{\"u}r die Untersuchung ihrer Funktionen geschaffen worden.}, language = {de} } @phdthesis{Barbirz2005, author = {Barbirz, Stefanie}, title = {Konservierte Struktur bei genetischer Mosaizit{\"a}t : die Tailspike Proteine dreier Phagen der Familie Podviridae}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-6885}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminos{\"a}uren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenz{\"u}bereinstimmung. Mit R{\"o}ntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsg{\"a}ngigen beta-Helix falten, wie dies schon f{\"u}r P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.}, subject = {Bakteriophagen}, language = {de} } @phdthesis{Dobbernack2008, author = {Dobbernack, Gisela}, title = {Konstruktion und Charakterisierung transgener Mauslinien f{\"u}r humane Sulfotransferasen als Modellsysteme f{\"u}r eine SULT-vermittelte metabolische Aktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-30447}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die Enzyme der Sulfotransferase-Gensuperfamilie (SULT) konjugieren nukleophile Gruppen von kleinen endogenen Verbindungen und Fremdstoffen mit der negativ geladenen Sulfo-Gruppe. Dadurch wird die Polarit{\"a}t dieser Verbindungen erh{\"o}ht, ihre passive Permeation von Zellmembranen verhindert und somit ihre Ausscheidung erleichtert. Jedoch stellt die Sulfo-Gruppe in bestimmten chemischen Verbindungen eine gute Abgangsgruppen dar. Aus der Spaltung resultierende Carbenium- oder Nitreniumionen k{\"o}nnen mit DNA oder anderen zellul{\"a}ren Nukleophilen reagieren. In Testsystemen f{\"u}r Mutagenit{\"a}t wurden zahlreiche Verbindungen, darunter Nahrungsinhaltsstoffe und Umweltkontaminanten, durch SULT zu Mutagenen aktiviert. Dabei zeigten sich zum einen eine ausgepr{\"a}gte Substratspezifit{\"a}t selbst orthologer SULT-Formen unterschiedlicher Spezies und zum anderen Interspezies-Unterschiede in der SULT-Gewebeverteilung. Daher k{\"o}nnten sich die Zielgewebe einer SULT-induzierten Krebsentstehung bei Mensch und Nager unterscheiden. Um die Beteiligung von humanen SULT an der Bioaktivierung von Fremdstoffen im Tiermodell untersuchen zu k{\"o}nnen, wurden transgene Mauslinien f{\"u}r den Cluster der humanen SULT1A1- und -1A2-Gene sowie f{\"u}r die humane SULT1B1 generiert. Zur Herstellung der transgenen Linien wurden große genomische Konstrukte verwendet, die die SULT-Gene sowie - zum Erreichen einer der Humansituation entsprechenden Gewebeverteilung der Proteinexpression - deren potentielle regulatorische Sequenzen enthielten. Es wurden je drei transgene Linien f{\"u}r hSULT1A1/hSULT1A2 und drei transgene Linien f{\"u}r hSULT1B1 etabliert. Die Expression der humanen Proteine konnte in allen Linien gezeigt werden und f{\"u}nf der sechs Linien konnten zur Homozygotie bez{\"u}glich der Transgene gez{\"u}chtet werden. In der molekularbiologischen Charakterisierung der transgenen Linien wurde der chromosomale Integrationsort der Konstrukte bestimmt und die Kopienzahl pro Genom untersucht. Mit Ausnahme einer hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linie, bei der Kopien des Konstrukts in zwei unterschiedliche Chromosomen integriert vorliegen, wiesen alle Linien nur einen Transgen-Integrationsort auf. Die Untersuchung der Transgen-Kopienzahl ergab, dass die Mauslinien zwischen einer und etwa 20 Kopien des Transgen-Konstrukts pro Genom trugen. In der proteinbiochemischen Charakterisierung wurde gezeigt, dass die transgenen Linien die humanen Proteine mit einer weitgehend der des Menschen entsprechenden Gewebeverteilung exprimieren. Die Intensit{\"a}t der im Immunblot nachgewiesenen Expression korrelierte mit der Kopienzahl der Transgene. Die zellul{\"a}re und subzellul{\"a}re Verteilung der Transgen-Expression wurden bei einer der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien in Leber, Niere, Lunge, Pankreas, D{\"u}nndarm und Kolon und bei einer der hSULT1B1-transgenen Linien im Kolon untersucht. Sie stimmte ebenfalls mit der Verteilung der entsprechenden SULT-Formen im Menschen {\"u}berein. Da sich die erzeugten transgenen Linien aufgrund ihrer mit dem Menschen vergleichbaren Gewebeverteilung der SULT-Expression als Modellsystem zur Untersuchung der menschlichen SULT-vermittelten metabolischen Aktivierung eigneten, wurde eine der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien f{\"u}r zwei erste toxikologische Untersuchungen eingesetzt. Den M{\"a}usen wurden chemische Verbindungen verabreicht, f{\"u}r die in in-vitro-Versuchen eine hSULT1A1/hSULT1A2-vermittelte Bioaktivierung zu Mutagenen gezeigt worden war. In beiden Untersuchungen wurde die Gewebeverteilung der entstandenen DNA-Addukte als Endpunkt einer gewebespezifischen genotoxischen Wirkung ermittelt. In der ersten Untersuchung wurden 90 mg/kg K{\"o}rpergewicht 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin - ein in gebratenem Fleisch gebildetes heterozyklisches aromatisches Amin - transgenen sowie Wildtyp-M{\"a}usen oral verabreicht. Acht Stunden nach Applikation wiesen die transgenen M{\"a}use signifikant h{\"o}here Adduktniveaus als die Wildtyp-M{\"a}use in Leber, Lunge, Niere, Milz und Kolon auf. In der Leber der transgen M{\"a}use war das Adduktniveau 17fach h{\"o}her als in der Leber der Wildtyp-M{\"a}use. Die Leber war bei den transgenen Tieren das Organ mit dem h{\"o}chsten, bei den Wildtyp-Tieren hingegen mit dem niedrigsten DNA-Adduktniveau. In der zweiten Untersuchung (Pilotstudie mit geringer Tierzahl) wurde transgenen und Wildtyp-M{\"a}usen 19 mg/kg K{\"o}rpergewicht des polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs 1-Hydroxymethylpyren - ein Metabolit der Nahrungs- und Umweltkontaminante 1-Methylpyren - intraperitoneal verabreicht. Nach 30 Minuten wurden, verglichen mit den Wildtyp-M{\"a}usen, bis zu 25fach erh{\"o}hte Adduktniveaus bei den transgenen M{\"a}usen in Leber, Niere, Lunge und Jejunum nachgewiesen. Somit konnte anhand einer in dieser Arbeit generierten transgenen Mauslinie erstmals gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1/hSULT1A2 tats{\"a}chlich sowohl auf die St{\"a}rke als auch die Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo eine Auswirkung hat.}, language = {de} } @phdthesis{Wend2009, author = {Wend, Korinna}, title = {Konstruktion und toxikologische Nutzung von transgenen M{\"a}usen mit den allelischen Varianten von humanen SULT1A-Genen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-42052}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. W{\"a}hrend die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der h{\"a}ufigste Polymorphismus in diesem Gen f{\"u}hrt zu einer Aminos{\"a}uresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert f{\"u}r ein Protein mit einer geringen Enzymaktivit{\"a}t und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. {\"U}ber den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden m{\"o}gliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widerspr{\"u}chliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die h{\"a}ufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegen{\"u}ber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufw{\"a}rts und stromabw{\"a}rts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zellul{\"a}re und subzellul{\"a}re Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellul{\"a}ren Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell st{\"a}rker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war {\"u}berraschend, denn in humanen Thrombocyten f{\"u}hrt das SULT1A1*1-Allel zu einem h{\"o}heren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer h{\"o}heren SULT1A1-Enzymaktivit{\"a}t beschrieben wird. Der m{\"o}gliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine h{\"o}here RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde f{\"u}r Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch gr{\"o}ßere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und m{\"o}gliche Spleißvarianten k{\"o}nnten damit f{\"u}r die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und k{\"o}nnte mit der erh{\"o}hten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zus{\"a}tzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-M{\"a}usen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsst{\"a}rke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg M{\"a}usen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den h{\"a}ufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die St{\"a}rke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat.}, language = {de} } @phdthesis{Thalmann2013, author = {Thalmann, Sophie}, title = {Korrelation zwischen der genetischen und der funktionellen Diversit{\"a}t humaner Bitterrezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-66845}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2013}, abstract = {Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die f{\"u}r die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilit{\"a}t der TAS2R-Gene k{\"o}nnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung f{\"u}hren. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien f{\"u}r einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die h{\"a}ufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage {\"u}ber die funktionelle Diversit{\"a}t der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage f{\"u}r individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu k{\"o}nnen. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der f{\"u}nf orphanen TAS2Rs wurden mit {\"u}ber hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden f{\"u}r die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tats{\"a}chliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilit{\"a}t der TAS2Rs zur{\"u}ck. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden f{\"u}r zw{\"o}lf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten f{\"u}r Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu ph{\"a}notypischen Unterschieden f{\"u}hren. Wie f{\"u}r den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Ph{\"a}notypen hinweisen k{\"o}nnte. Weiterf{\"u}hrend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre ph{\"a}notypische Relevanz zu pr{\"u}fen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminos{\"a}urepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, k{\"o}nnte weiterf{\"u}hrend zum besseren Verst{\"a}ndnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen.}, language = {de} } @phdthesis{Voigt2008, author = {Voigt, Andrea}, title = {K{\"o}rperbau, Gelenkbeweglichkeit und Handkr{\"a}fte Erwachsener im Generationenvergleich}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-31217}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die ergonomische Anpassung von Produkten der k{\"o}rpernahen Umwelt an den menschlichen K{\"o}rper in seiner gesamten Variabilit{\"a}t erfordert anthropometrische Grundlagen. Die vorliegende Arbeit beschreibt und analysiert die K{\"o}rpermasse, 17 L{\"a}ngenmaße, 5 Skelettrobustizit{\"a}tsmaße, 6 Korpulenzmaße, 3 Kopfmaße, 5 Handmaße, 3 Fußmaße, sowie 10 Beweglichkeitsmaße der Wirbels{\"a}ule, 8 Beweglichkeitsmaße der Hand, 2 Beweglichkeitsmaße des Beines und 7 Handkr{\"a}fte von 295 Probanden der drei Altersgruppen 20 bis 29 Jahre, 50 bis 59 Jahre und 60 bis 69 Jahre. Die Untersuchungen wurden im Zeitraum von September 2006 bis April 2007 durchgef{\"u}hrt. Ziel der Arbeit ist es, f{\"u}r den {\"u}berwiegenden Teil der untersuchten k{\"o}rperlichen Merkmale erstmals f{\"u}r die deutsche Bev{\"o}lkerung geschlechts- und altersspezifische Mittelwerte und Variabilit{\"a}tsbereiche bis zum vollendeten 70. Lebensjahr zur Verf{\"u}gung zu stellen. Das gilt insbesondere f{\"u}r die untersuchten Beweglichkeitsmaße und Handkr{\"a}fte. Erstmals werden Korrelationen zwischen der K{\"o}rperform, wie sie sich im Maßzusammenhang der unterschiedlichen K{\"o}rperbautypen darstellt, der Gelenkbeweglichkeit und den Handkr{\"a}ften vorgestellt. Dar{\"u}ber hinaus wird durch den Vergleich der Ergebnisse der jungen und der beiden {\"a}lteren Erwachsenengruppen untersucht, welche Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen bestehen. Im Hinblick auf die zeitliche G{\"u}ltigkeit der aktuellen Untersuchungsergebnisse werden der Einfluss des s{\"a}kularen Trends und der Einfluss der ontogenetischen Alternsprozesse auf L{\"a}ngenmaße und Korpulenzmaße diskutiert. Die Arbeit zeigt auf, dass innerhalb der untersuchten Probanden eine große Variationsbreite in den K{\"o}rpermaßen auftritt. Es lassen sich typische Altersunterschiede erkennen. Die {\"A}lteren sind im Mittel kleiner, weisen jedoch gr{\"o}ßere Skelettrobustizit{\"a}ts- und Korpulenzmaße auf. Die dynamischen Maße weisen auf eine geringere Beweglichkeit der Wirbels{\"a}ule, teilweise auch der Hand hin. Die Handkr{\"a}fte der Frauen werden mit zunehmendem Alter geringer, bei den M{\"a}nnern sind die {\"A}lteren kr{\"a}ftiger als die jungen Erwachsenen. Die Ergebnisse deuten auf einen gegen{\"u}ber fr{\"u}heren Generationen verz{\"o}gerten Beginn von k{\"o}rperlichen Alterserscheinungen hin, der im Hinblick auf die steigende Lebenserwartung der Bev{\"o}lkerung eingehender untersucht werden sollte.}, language = {de} } @phdthesis{Trippo2000, author = {Trippo, Ulrike}, title = {K{\"o}rperbau, K{\"o}rperzusammensetzung und Ern{\"a}hrungsgewohnheiten bei Erwachsenen in Abh{\"a}ngigkeit von Alter und Geschlecht}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000306}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2000}, abstract = {Die vorliegende Arbeit ist eine aktuelle Dokumentation von K{\"o}rperbau, K{\"o}rperzusammensetzung und Ern{\"a}hrungsgewohnheiten an 708 j{\"u}ngeren und {\"a}lteren M{\"a}nnern und Frauen aus dem Bundesland Brandenburg. Der K{\"o}rperbau wurde {\"u}ber ein 42 L{\"a}ngen-, Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße umfassendes anthropometrisches Untersuchungsprogramm bestimmt. Die Einsch{\"a}tzung von Gesamtk{\"o}rperfettanteil und Magermasse erfolgte mit zwei Feldmethoden, der Hautfaltendickenmessung und der bioelektrischen Impedanzanalyse. Mit Hilfe eines semiquantitativen Fragebogens zu den Ern{\"a}hrungsgewohnheiten wurde der Lebensmittelverzehr erfasst und daraus die Energie- und N{\"a}hrstoffaufnahme berechnet. Die Ergebnisse zum K{\"o}rperbau zeigen im Mittel eine Abnahme der L{\"a}ngenmaße, jedoch eine Zunahme der Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße mit steigendem Erwachsenenalter. Einfache Parameter zur Beurteilung des Ern{\"a}hrungszustandes, wie K{\"o}rpermasse und Body-Mass-Index (BMI) nehmen im Alter geschlechtsspezifisch zu. Nach den Richtlinien der WHO f{\"u}r den BMI gelten 55,3\% der untersuchten M{\"a}nnern als {\"u}bergewichtig, davon 10\% als adip{\"o}s. Von allen untersuchten Frauen sind 41,6\% {\"u}bergewichtig, davon sind 14,3\% adip{\"o}s. Der Anteil der {\"U}bergewichtigen ist zwar beim weiblichen Geschlecht geringer, aber daf{\"u}r haben mehr Frauen die Grenze zur Adipositas {\"u}berschritten. F{\"u}r eine wissenschaftlich exakte Beurteilung des Ern{\"a}hrungszustandes reichen K{\"o}rpermasse und BMI nicht aus, da sie die K{\"o}rperzusammensetzung nicht bzw. nicht gen{\"u}gend ber{\"u}cksichtigen. Die subkutane Fettschichtdicke nimmt insbesondere am Rumpf zu, was als zus{\"a}tzliches Gesundheitsrisiko gilt. Der Gesamtk{\"o}rperfettanteil steigt im Erwachsenenalter abh{\"a}ngig von der Berechnungsmethode an. Die untersuchten Frauen sind gegen{\"u}ber den M{\"a}nnern in allen Altersgruppen durch einen etwa ein Drittel h{\"o}heren K{\"o}rperfettanteil gekennzeichnet. Die t{\"a}gliche Nahrungsenergieaufnahme der untersuchten Personen l{\"a}sst eine abnehmende Tendenz bis zum 65. Lebensjahr erkennen. Trotz einer sinkenden Nahrungsenergieaufnahme im Alter, nimmt der BMI zu. M{\"o}gliche Ursachen hierf{\"u}r werden in der Arbeit diskutiert. Der Anteil der Grundn{\"a}hrstoffe an der Energiebereitstellung entspricht in keiner der untersuchten Gruppen den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft f{\"u}r Ern{\"a}hrung. Allgemein ist der Fettkonsum zu hoch und der Kohlenhydratanteil zu gering. Das zeigt sich besonders in den beiden mittleren untersuchten Altersgruppen und bei den M{\"a}nnern st{\"a}rker als bei den Frauen.}, language = {de} } @phdthesis{Geissler2008, author = {Geißler, Katja}, title = {Lebensstrategien seltener Stromtalpflanzen : aut{\"o}kologische Untersuchung von Cnidium dubium, Gratiola officinalis und Juncus atratus unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung ihrer Stressresistenz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-17468}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die vorliegende Dissertation behandelt die {\"O}kologie von Cnidium dubium (Schkuhr) Thell. (Sumpf-Brenndolde), Gratiola officinalis L. (Gottes-Gnadenkraut) und Juncus atratus Krocker (Schwarze Binse), drei gef{\"a}hrdeten Arten, die als sogenannte Stromtalpflanzen in Mitteleuropa in ihrem Vorkommen eng an die Flussauen gebunden sind. Die Arbeit basiert auf verschiedenen Simulationsexperimenten und Feldstudien in der Unteren Havelniederung, einem „Feuchtgebiet von internationaler Bedeutung". Sie behandelt Themenkomplexe wie das Samenbankverhalten, die Samenkeimung, die Stickstofflimitierung, die Konkurrenzkraft, das Verhalten der Pflanzen nach einer Sommertrockenheit und nach einer Winter/Fr{\"u}hjahrs{\"u}berflutung. Ferner widmet sie sich der Populationsbiologie der Arten und dem Verhalten der Pflanzen nach besonderen St{\"o}rungsereignissen wie Mahd, Herbivorie und der Sommerflut 2002. Der Leser erf{\"a}hrt, wie die Pflanzen in verschiedenen Lebensphasen auf die auentypische Umwelt reagieren und erh{\"a}lt umfassende Einblicke in physiologische Mechanismen, die der Anpassung an die typischen Bedingungen einer mitteleurop{\"a}ischen Flussaue dienen. Eine Interpretation der Ergebnisse zeigt auf, welche der spezifischen Eigenschaften zur Gef{\"a}hrdung der drei Stromtalarten beitragen. Die Arbeit ist f{\"u}r den Arten-, Biotop- und Landschaftsschutz interessant. Dar{\"u}ber hinaus bietet sie zahlreiche Ankn{\"u}pfungspunkte zur {\"o}kophysiologischen Grundlagenforschung. Die verst{\"a}rkte Nutzung physiologischer Methoden bei der Kl{\"a}rung {\"o}kologischer Fragestellungen wird angeregt.}, language = {de} } @phdthesis{Schatz2011, author = {Schatz, Daniela}, title = {LNA-clamp-PCR zum sensitiven Nachweis von Punktmutationen im Rahmen der Entwicklung eines Darmkrebsfr{\"u}herkennungstests}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-52308}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2011}, abstract = {Darmkrebs ist die zweith{\"a}ufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industriel{\"a}ndern. Durch eine fr{\"u}hzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfr{\"u}herkennung ist gegenw{\"a}rtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten f{\"u}r den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bev{\"o}lkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Fr{\"u}herkennung von humanem Darmkrebs", in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfr{\"u}herkennung. Der Nachweis soll {\"u}ber die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Ver{\"a}nderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivit{\"a}t f{\"u}r Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode f{\"u}r die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme f{\"u}r die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt f{\"u}r die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtyp{\"u}berschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte {\"u}ber das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit f{\"u}r die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgef{\"u}hrt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erh{\"o}hte Affinit{\"a}t zu komplement{\"a}ren DNA-Str{\"a}ngen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer gr{\"o}ßeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich {\"u}berspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation w{\"a}hrend der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verl{\"a}ngert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegen{\"u}ber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde f{\"u}r BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich f{\"u}r BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1\% bis 0,1\% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit f{\"u}r die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. F{\"u}r die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die {\"u}brigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingef{\"u}hrt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kosteng{\"u}nstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranf{\"a}llig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren f{\"u}r Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfr{\"u}herkennung. Dar{\"u}ber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Lietz2006, author = {Lietz, Andreas}, title = {Mechanismen der Apoptoseresistenz der Tumorzellen des klassischen Hodgkin Lymphoms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-11219}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2006}, abstract = {Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle f{\"u}r das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und gesch{\"a}digten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgel{\"o}st werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die r{\"a}umliche N{\"a}he der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex f{\"u}hrt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle f{\"u}hrt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. St{\"o}rungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise w{\"a}hrend der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beitr{\"a}gt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl prim{\"a}re HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpr{\"a}zipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivit{\"a}t die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter prim{\"a}rer Hodgkinf{\"a}lle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es m{\"o}glich, HRS-Zelllinien gegen{\"u}ber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beitr{\"a}gt. Dar{\"u}ber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivit{\"a}t des Transkriptionsfaktors NF-κB abh{\"a}ngt, die charakteristisch f{\"u}r diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zur{\"u}ckgehalten. Diverse Stimuli k{\"o}nnen den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivit{\"a}t beitragen. Zu den NF-κB-abh{\"a}ngigen Genen in den HRS-Zellen geh{\"o}ren solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivit{\"a}t in den HRS-Zellen f{\"u}hrt zu Apoptose und eingeschr{\"a}nkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen f{\"u}hrte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivit{\"a}t ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-f{\"o}rdernden Zielgenen einher. Die ektope {\"U}berexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von M{\"a}usen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen tr{\"a}gt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ans{\"a}tze f{\"u}r die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten k{\"o}nnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon f{\"u}r die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird.}, language = {de} } @phdthesis{Loew2008, author = {Loew, Noya}, title = {Meerrettich Peroxidase : Modifikationen und Anwendungen in Biosensoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-18430}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Biosensoren werden oft f{\"u}r die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase" (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden f{\"u}r die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im K{\"o}rper von weißen Blutk{\"o}rperchen produziert, um Bakterien abzut{\"o}ten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutk{\"o}rperchen bei einer Chemotherapie abget{\"o}tet und dadurch die Patienten anf{\"a}lliger f{\"u}r Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelm{\"a}ßig {\"u}berwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine {\"U}berwachung der Anzahl an weißen Blutk{\"o}rperchen ohne Blutabnahme durch eine H2O2-Messung erfolgen kann. Ein direkter Zusammenhang zwischen der ausgeatmeten H2O2-Menge und der Zahl der weißen Blutk{\"o}rperchen konnte dabei nicht festgestellt werden. F{\"u}r empfindliche H2O2-Messungen mit einer HRP-Elektrode ist ein schneller Austausch von Elektronen zwischen der Elektrode und dem Enzym notwendig. Eine Vorraussetzung daf{\"u}r ist eine kurze Distanz zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrodenoberfl{\"a}che. Um einen kurzen Abstand zu erreichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene por{\"o}se graphit{\"a}hnliche Materialien aus pyrolysierten Kobalt-Porphyrinen f{\"u}r die Elektrodenherstellung verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass eines der untersuchten Materialien, welches Poren von etwa der Gr{\"o}ße eines Enzyms hat, Elektronen etwa 200mal schneller mit dem Enzym austauscht als festes Graphit. Die HRP selbst enth{\"a}lt in seinem aktiven Zentrum ein Eisen-Protoporphyrin, also ein aus vier Ringen bestehendes flaches Molek{\"u}l mit einem Eisenatom im Zentrum. Reagiert die HRP mit H2O2, so entzieht es dem Peroxid zwei Elektronen. Eines dieser Elektronen wird am Eisen, das andere im Ringsystem zwischengespeichert, bevor sie an ein anderes Molek{\"u}l oder an die Elektrode weitergegeben werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Eisen durch Osmium ausgetauscht. Das so ver{\"a}nderte Enzym entzieht Peroxiden nur noch ein Elektron. Dadurch reagiert es zwar langsamer mit Wasserstoffperoxid, daf{\"u}r aber schneller mit tert-Butylhydroperoxid, einem organischen Vertreter der Peroxid-Familie.}, language = {de} } @phdthesis{Batke2008, author = {Batke, Monika}, title = {Metabolismus von alkylierten polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen : Einfluss der Struktur auf benzylische Hydroxylierung und Sulfonierung in vitro und Modulation des Metabolismus in vivo}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-26939}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die Toxizit{\"a}t und Kanzerogenit{\"a}t von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere M{\"o}glichkeit zur Bioaktivierung und m{\"u}ssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zun{\"a}chst hydroxyliert, anschließend zur S{\"a}ure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so k{\"o}nnen diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen f{\"u}hren. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu kl{\"a}ren welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der l{\"o}slichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefels{\"a}ureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich m{\"o}glicher Transportvorg{\"a}nge geben. F{\"u}r die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgew{\"a}hlter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbons{\"a}uren im Urin und die entsprechenden Mercapturs{\"a}uren in Urin und F{\"a}zes betrachtet. Zun{\"a}chst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere gr{\"o}ßere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen best{\"a}tigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. F{\"u}r die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivit{\"a}ten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung erm{\"o}glicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die h{\"o}chste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefels{\"a}ureester die einzig plausible Erkl{\"a}rung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle f{\"u}r 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. F{\"u}r die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbons{\"a}ure kann als Biomarker die entsprechende Mercapturs{\"a}ure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis f{\"u}r die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. F{\"u}r die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und F{\"a}zes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und F{\"a}zes f{\"u}r die beiden Mercapturs{\"a}uren festgestellt. Hierf{\"u}r sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefels{\"a}ureester sowie der Spezifit{\"a}t der an der Mercapturs{\"a}urebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercapturs{\"a}ure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen f{\"u}r die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbons{\"a}ure war reduziert und die Bildung der Mercapturs{\"a}ure erh{\"o}ht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur f{\"u}r Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbons{\"a}ureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole best{\"a}tigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinit{\"a}ten und -aktivit{\"a}ten vorliegen.}, language = {de} } @phdthesis{Tanner2022, author = {Tanner, Norman}, title = {Methoden zur routinem{\"a}ßigen Untersuchung von Bienenprodukten mittels Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {VI, 194}, year = {2022}, language = {de} } @phdthesis{Dreja2009, author = {Dreja, Tanja S.}, title = {Microarray-basierte Expressionsanalysen des weißen Fettgewebes der NZO-Maus sowie der Langerhansschen Inseln der NZL-Maus : zwei Modelle f{\"u}r das metabolische Syndrom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-32379}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {{\"U}bergewicht und Adipositas f{\"u}hren zu Insulinresistenz und erh{\"o}hen deutlich das Risiko f{\"u}r die Entwicklung von Typ-2-Diabetes und kardiovaskul{\"a}ren Erkrankungen. Sowohl Adipositas als auch die Suszeptibilit{\"a}t gegen{\"u}ber Diabetes sind zu einem erheblichen Teil genetisch determiniert. Die relevanten Risikogene, deren Interaktion mit der Umwelt, insbesondere mit Bestandteilen der Nahrung, und die Pathomechanismen, die zur Insulinresistenz und Diabetes f{\"u}hren, sind nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. In der vorliegenden Arbeit sollte durch Genexpressionsanalysen des weißen Fettgewebes (WAT) und der Langerhansschen Inseln die Entstehung und Progression von Adipositas und Typ-2-Diabetes untersucht werden, um relevante Pathomechanismen und neue Kandidatengene zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Di{\"a}t-Interventionsstudien mit NZO- und verwandten NZL-M{\"a}usen, zwei polygenen Mausmodellen f{\"u}r das humane metabolische Syndrom, durchgef{\"u}hrt. Eine kohlenhydrathaltige Hochfett-Di{\"a}t (HF: 14,6 \% Fettanteil) f{\"u}hrte in beiden Mausmodellen zu fr{\"u}her Adipositas, Insulinresistenz und Typ 2 Diabetes. Eine fettreduzierte Standarddi{\"a}t (SD: 3,3 \% Fettanteil), welche die Entstehung von Adipositas und Diabetes stark verz{\"o}gert, sowie eine diabetesprotektive kohlenhydratfreie Hochfett-Di{\"a}t (CHF: 30,2 \% Fettanteil) dienten als Kontrolldi{\"a}ten. Mit Hilfe der Microarray-Technologie wurden genomweite Expressionsprofile des WAT erstellt. Pankreatische Inseln wurden durch laserbasierte Mikropr{\"a}paration (Laser Capture Microdissection; LCM) isoliert und ebenfalls hinsichtlich ihres Expressionsprofils analysiert. Differenziell exprimierte Gene wurden durch Real-Time-PCR validiert. Im WAT der NZO-Maus bewirkte die HF-Di{\"a}t eine reduzierte Expression nukle{\"a}rer Gene der oxidativen Phosphorylierung und von lipogenen Enzymen. Dies deutet auf eine inad{\"a}quate Fettspeicherung und -verwertung in diesen Tieren hin. Die Reduktion in der Fettspeicherung und -oxidation ist spezifisch f{\"u}r das adip{\"o}se NZO-Modell und konnte bei der schlanken SJL Maus nicht beobachtet werden, was auf eine m{\"o}gliche Beteiligung an der Entstehung der Insulinresistenz hinweist. Zus{\"a}tzlich wurde best{\"a}tigt, dass die Expansion des Fettgewebes bei der adip{\"o}sen NZO-Maus eine zeitlich verz{\"o}gerte Infiltration von Makrophagen in das WAT und dort eine lokale Immunantwort ausl{\"o}st. Dar{\"u}ber hinaus wurde die Methode der LCM etabliert und zur Gewinnung hochangereicherter RNA aus den Langerhansschen Inseln eingesetzt. In erstmalig durchgef{\"u}hrten genomweiten Expressionsanalysen wurde zu einem fr{\"u}hen Zeitpunkt in der Diabetesentwicklung der Einfluss einer diabetogenen HF-Di{\"a}t und einer diabetesprotektiven CHF-Di{\"a}t auf das Expressionsprofil von pankreatischen Inselzellen verglichen. Im Gegensatz zum WAT bewirkt die diabetogene HF-Di{\"a}t in Inselzellen einerseits, eine erh{\"o}hte Expression von nukle{\"a}ren Genen f{\"u}r die oxidative Phosphorylierung und andererseits von Genen, die mit Zellproliferation assoziiert sind. Zudem wurden 37 bereits annotierte Gene identifiziert, deren differenzielle Expression mit der Diabetesentwicklung korreliert. Das Peptidhormon Cholecystokinin (Cck, 11,8-fach erh{\"o}ht durch die HF) stellt eines der am st{\"a}rksten herauf regulierten Gene dar. Die hohe Anreicherung der Cck-mRNA in Inselzellen deutet auf eine bisher unbekannte Funktion des Hormons in der Regulation der Inselzellproliferation hin. Der Transkriptionsfaktor Mlxipl (ChREBP; 3,8-fach erniedrigt durch die HF) stellt in Langerhansschen Inseln eines der am st{\"a}rksten herunter regulierten Gene dar. Ferner wurde ChREBP, dessen Funktion als glucoseregulierter Transkriptionsfaktor f{\"u}r lipogene Enzyme bislang in der Leber, aber nicht in Inselzellen nachgewiesen werden konnte, erstmals immunhistochemisch in Inselzellen detektiert. Dies deutet auf eine neue, bisher unbekannte regulatorische Funktion von ChREBP im Glucosesensor-Mechanismus der Inselzellen hin. Eine durchgef{\"u}hrte Korrelation der mit der Diabetesentwicklung assoziierten, differenziell exprimierten Inselzellgene mit Genvarianten aus humanen genomweiten Assoziationsstudien f{\"u}r Typ-2-Diabetes (WTCCC, Broad-DGI-T2D-Studie) erm{\"o}glichte die Identifizierung von 24 neuartigen Diabetes-Kandidatengenen. Die Ergebnisse der erstmals am polygenen NZO-Mausmodell durchgef{\"u}hrten genomweiten Expressionsuntersuchungen best{\"a}tigen bisherige Befunde aus Mausmodellen f{\"u}r Adipositas und Diabetes (z.B. ob/ob- und db/db-M{\"a}use), zeigen in einigen F{\"a}llen aber auch Unterschiede auf. Insbesondere in der oxidativen Phosphorylierung k{\"o}nnten die Ergebnisse relevant sein f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Pathogenese des polygen-bedingten humanen metabolischen Syndroms.}, language = {de} } @phdthesis{Marschan2005, author = {Marschan, Xenia}, title = {Mikroarray-basierte Detektion von mRNA aus Zellen mittels On-Chip-PCR}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-5457}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. F{\"u}r ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 \&\#181;g Hybridisierungstarget ben{\"o}tigt. Dazu m{\"u}ssen entweder 15 - 20 \&\#181;g RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpr{\"a}parationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu l{\"o}sen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer L{\"o}sungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden k{\"o}nnen: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfl{\"a}che. Diese M{\"o}glichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden f{\"u}r die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung {\"u}ber Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde f{\"u}r amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberfl{\"a}chen sowie f{\"u}r EDC-Kopplung auf silanisierten Oberfl{\"a}chen gezeigt. F{\"u}r die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10\&\#181;M schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern w{\"a}hrend der PCR erm{\"o}glicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zus{\"a}tzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu k{\"o}nnen. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode f{\"u}r den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet.}, subject = {Polymerase-Kettenreaktion}, language = {de} } @phdthesis{Lerm2012, author = {Lerm, Stephanie}, title = {Mikroorganismen in geothermischen Aquiferen : Einfluss mikrobieller Prozesse auf den Anlagenbetrieb}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-63705}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {In Fluid-, Filter- und Sedimentproben von vier geothermischen Anlagen des Norddeutschen Beckens wurden mit molekulargenetischen Verfahren unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften nachgewiesen. Die mikrobielle Zusammensetzung in den Prozessw{\"a}ssern wurde dabei durch die Aquiferteufe, die Salinit{\"a}t, die Temperatur und den verf{\"u}gbaren Elektronendonatoren und -akzeptoren beeinflusst. Die in den anoxischen Prozessw{\"a}ssern identifizierten Organismen zeichneten sich durch einen chemoheterotrophen oder chemoautotrophen Stoffwechsel aus, wobei Nitrat, Sulfat, Eisen (III) oder Bikarbonat als terminale Elektronenakzeptoren fungierten. Mikroorganismen beeinflussten den Betrieb von zwei Anlagen negativ. So reduzierten im Prozesswasser des K{\"a}ltespeichers am Berliner Reichstag vorhandene Eisenoxidierer, nahe verwandt zu der Gattung Gallionella, die Injektivit{\"a}t der Bohrungen durch Eisenhydroxidausf{\"a}llungen in den Filterschlitzen. Biofilme, die von schwefeloxidierenden Bakterien der Gattung Thiothrix in den Filtern der obert{\"a}gigen Anlage gebildet wurden, f{\"u}hrten ebenfalls zu Betriebsst{\"o}rungen, indem sie die Injektion des Fluids in den Aquifer behinderten. Beim W{\"a}rmespeicher in Neubrandenburg waren Sulfatreduzierer vermutlich an der Bildung von Eisensulfidausf{\"a}llungen in den obert{\"a}gigen Filtern und im bohrlochnahen Bereich beteiligt und verst{\"a}rkten Korrosionsprozesse an der Pumpe im Bohrloch der kalten Aquiferseite. Organische S{\"a}uren in den Fluiden sowie mineralische Ausf{\"a}llungen in den Filtern der obert{\"a}gigen Anlagen waren Belege f{\"u}r die Aktivit{\"a}t der in den verschiedenen Anlagen vorhandenen Mikroorganismen. Es wurde zudem deutlich, dass Mikroorganismen auf Grund der hohen Durchflussraten in den Anlagen chemische Ver{\"a}nderungen in den Prozessw{\"a}ssern deutlich sensitiver anzeigen als chemische Analyseverfahren. So deuteten {\"A}nderungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Bioz{\"o}nosen und speziell die Identifikation von Indikatororganismen wie Eisen- und Schwefeloxidierern, fermentativen Bakterien und Sulfatreduzierern auf eine erh{\"o}hte Verf{\"u}gbarkeit von Elektronendonatoren oder akzeptoren in den Prozessw{\"a}ssern hin. Die Ursachen f{\"u}r die an den Geothermieanlagen auftretenden Betriebsst{\"o}rungen konnten dadurch erkannt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Buechner2014, author = {B{\"u}chner, Kerstin}, title = {Modifizierung und Charakterisierung von Wellenleitermaterialien f{\"u}r Biosensoranwendungen}, pages = {129}, year = {2014}, language = {de} } @phdthesis{Strohm2010, author = {Strohm, Daniela}, title = {Modulation der Insulinsignalgebung durch Prostaglandin E2 und Endocannabinoide}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-49678}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Die adipositasbedingte Insulinresistenz geht mit einer unterschwelligen Entz{\"u}ndungsreaktion einher. Als Antwort auf dieses Entz{\"u}ndungsgeschehen wird PGE2 unter anderem von Kupffer Zellen der Leber freigesetzt und kann seine Wirkung {\"u}ber vier PGE2-Rezeptorsubtypen (EP1-EP4) vermitteln. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PGE2 in Rattenhepatozyten {\"u}ber den EP3 R ERK1/2-abh{\"a}ngig die intrazellul{\"a}re Weiterleitung des Insulinsignals hemmt. {\"U}ber die Modulation der Insulinrezeptorsignalkette durch andere EP-Rezeptoren war bisher nichts bekannt. Daher sollte in stabil transfizierten Zelllinien, die jeweils nur einen der vier EP-Rezeptorsubtypen exprimierten, der Einfluss von PGE2 auf die Insulinrezeptorsignalkette untersucht werden. Es wurden HepG2-Zellen, die keinen funktionalen EP-Rezeptor aufwiesen, sowie HepG2-Zellen, die stabil den EP1-R (HepG2-EP1), den EP3β-R (HepG2 EP3β) oder den EP4-R (HepG2 EP4) exprimierten, sowie die humane f{\"o}tale Hepatozytenzelllinie, Fh hTert, die den EP2- und den EP4-R exprimierte, f{\"u}r die Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden f{\"u}r 330 min mit PGE2 (10 µM) vorinkubiert, um die pathophysiologische Situation nachzustellen und anschließend mit Insulin (10 nM) f{\"u}r 15 min stimuliert. Die insulinabh{\"a}ngige Akt- und ERK1/2-Phosphorylierung wurde im Western-Blot bestimmt. In allen Hepatomzelllinien die EP-R exprimierten, nicht aber in der Zelllinie, die keinen EP R exprimierte, hemmte PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung. In allen drei stabil transfizierten Zelllinien, nicht jedoch in den Fh-hTert-Zellen, steigerte PGE2 die basale und insulinstimulierte Phosphorylierung der Serin/Threoninkinase ERK1/2. In den HepG2 EP1- und den HepG2-EP3β-Zellen steigerte PGE2 mutmaßlich {\"u}ber die ERK1/2-Aktivierung die Serinphosphorylierung des IRS, welche die Weiterleitung des Insulinsignals blockiert. Die Hemmung der Aktivierung von ERK1/2 hob in EP3 R-exprimierenden Zellen die Abschw{\"a}chung der Insulinsignal{\"u}bertragung teilweise auf. In diesen Zellen scheint die ERK1/2-Aktivierung die gr{\"o}ßte Bedeutung f{\"u}r die Hemmung der insulinstimulierten Akt-Phosphorylierung zu haben. Da durch die Hemmstoffe die PGE2-abh{\"a}ngige Modulation nicht vollst{\"a}ndig aufgehoben wurde, scheinen dar{\"u}ber hinaus aber noch andere Mechanismen zur Modulation beizutragen. In den Fh hTert-Zellen wurde die Insulinrezeptorsignalkette offensichtlich {\"u}ber einen ERK1/2-unabh{\"a}ngigen, bisher nicht identifizierten Weg unterbrochen. Eine gesteigerte PGE2-Bildung im Rahmen der Adipositas ist nicht auf die peripheren Gewebe beschr{\"a}nkt. Auch im Hypothalamus k{\"o}nnen bei Adipositas Zeichen einer Entz{\"u}ndung nachgewiesen werden, die mit einer gesteigerten PGE2-Bildung einhergehen. Daher wurde das EP R-Profil von prim{\"a}ren hypothalamischen Neuronen und neuronalen Modellzelllinien charakterisiert, um zu pr{\"u}fen, ob PGE2 in hypothalamischen Neuronen die Insulinsignalkette in {\"a}hnlicher Weise unterbricht wie in Hepatozyten. In allen neuronalen Zellen hemmte die Vorinkubation mit PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. In der neuronalen hypothalamischen Zelllinie N 41 wirkte PGE2 eher synergistisch mit Insulin. In durch Retins{\"a}ure ausdifferenzierten SH SY5Y-Zellen waren die Ergebnisse allerdings widerspr{\"u}chlich. Dies k{\"o}nnte darauf zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein, dass die Expression der EP Rezeptoren im Verlauf der Kultur stark schwankte und somit die EP R-Ausstattung der Zellen zwischen den Zellversuchen variierte. Auch in den prim{\"a}ren hypothalamischen Neuronen variierte die EP R-Expression abh{\"a}ngig vom Differenzierungszustand und PGE2 beeinflusste die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. Obwohl in allen neuronalen Zellen die Akt-Phosphorylierung durch Insulin gesteigert wurde, konnte in keiner der Zellen eine insulinabh{\"a}ngige Regulation der Expression von Insulinzielgenen (POMC und AgRP) nachgewiesen werden. Das liegt wahrscheinlich an dem niedrigen Differenzierungsgrad der untersuchten Zellen. Im Rahmen der Adipositas kommt es zu einer {\"U}beraktivierung des Endocannabinoidsystems. Endocannabinoidrezeptoren sind mit den EP Rezeptoren verwandt. Daher wurde gepr{\"u}ft, ob Endocannabinoide die Insulinsignalweiterleitung in {\"a}hnlicher Weise beeinflussen k{\"o}nnen wie PGE2. Die Vorinkubation der N 41-Zellen f{\"u}r 330 min mit einem Endocannabinoidrezeptoragonisten steigerte die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung, was auf einen insulinsensitiven Effekt von Endocannabinoiden hindeutet. Dies steht im Widerspruch zu der in der Literatur beschriebenen endocannabinoidabh{\"a}ngigen Insulinresistenz, die aber auf indirekte, durch Endocannabinoide ausgel{\"o}ste Ver{\"a}nderungen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein k{\"o}nnte.}, language = {de} } @phdthesis{Sieber2010, author = {Sieber, Matthias}, title = {Modulatoren des Calcineurin-NFATc-Signalweges in humanen TH-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-44676}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Die Ca2+/Calmodulin-aktivierte Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin ist ein Schl{\"u}sselmolek{\"u}l des T-Zell-Rezeptorabh{\"a}ngigen Signalnetzwerkes. Calcineurin aktiviert die Transkriptionsfaktoren der NFATc-Familie durch Dephosphorylierung und reguliert dar{\"u}ber die Expression wichtiger Zytokine und Oberfl{\"a}chenproteine. Die Aktivit{\"a}t von Calcineurin wird durch zahlreiche endogene Proteine moduliert und ist Angriffspunkt der immunsuppressiven Substanzen Cyclosporin A und FK506. In dieser Arbeit wurde der alternative niedermolekulare Calcineurin-NFATc-Inhibitor NCI3 hinsichtlich seiner Effekte auf T-Zell-Rezeptor-abh{\"a}ngige Signalwege charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Pyrazolopyrimidinderivat NCI3 nichttoxisch und zellmembranpermeabel ist. In T-Zell-Rezeptor-stimulierten prim{\"a}ren humanen TH-Zellen unterdr{\"u}ckt NCI3 die Proliferation und IL-2-Produktion (IC50-Wert ~4 µM), da die Dephosphorylierung von NFATc und die anschließende nukle{\"a}re Translokation gehemmt wird. NCI3 inhibiert die calcineurinabh{\"a}ngige NFAT- und NF-κB-, aber nicht die AP-1-kontrollierte Reprtergenexpression, in mikromolaren Konzentrationen (IC50-Werte 2 bzw. 7 µM). Im Gegensatz zu Cyclosporin A st{\"o}rt NCI3 nicht die Phosphataseaktivit{\"a}t von Calcineurin, sondern interferiert mit der Calcineurin-NFATc-Bindung. Ein wichtiges endogenes Modulatorprotein f{\"u}r die Calcineurinaktivit{\"a}t ist RCAN1, das vermutlich den Calcineurin-NFATc-Signalweg {\"u}ber einen negativen R{\"u}ckkopplungsmechanismus reguliert. Hier wurde gezeigt, daß RCAN1 in humanen TH-Zellen exprimiert wird. Die Spleißvariante RCAN1-1 ist in ruhenden T-Zellen basal exprimiert und wird nicht durch T-Zell-Rezeptor-Stimulierung in seiner Expression ver{\"a}ndert. RCAN1-4 dagegen ist in ruhenden Zellen kaum zu detektieren und wird stimulierungsabh{\"a}ngig induziert. Durch die Verwendung Calcineurin-NFATc-spezifischer Inhibitoren wie NCI3 wurde gezeigt, daß die RCAN1-4-Induktion durch diesen Signalweg limitiert ist. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten und Erkenntnisse tragen dazu bei, das Verst{\"a}ndnis der Funktion und Regulation von Calcineurin in T-Zellen zu vertiefen.}, language = {de} } @phdthesis{Putzler2016, author = {Putzler, Sascha}, title = {Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394689}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {111}, year = {2016}, abstract = {Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell f{\"u}r acentriol{\"a}re Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe f{\"u}r Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am {\"U}bergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilit{\"a}t in FRAP-Experimenten w{\"a}hrend der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der sp{\"a}ten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Dom{\"a}ne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volll{\"a}ngenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Dom{\"a}ne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der N{\"a}he des Centrosoms. Es zeigt eine partiell {\"a}hnliche mitotische Verteilung wie das Volll{\"a}ngenprotein. Dies l{\"a}sst eine regulatorische Dom{\"a}ne innerhalb der Coiled-Coil Dom{\"a}ne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdr{\"u}ckt die Expression des endogenen CP91 und bringt {\"u}berz{\"a}hlige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zus{\"a}tzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erh{\"o}hte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erh{\"o}hten Zellgr{\"o}ße und Defekten im Abschn{\"u}rungsprozess w{\"a}hrend der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und f{\"u}r den Zusammenhalt der beiden {\"a}ußeren Schichten der Kernstruktur ben{\"o}tigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle f{\"u}r eine ordnungsgem{\"a}ße Centrosomenbiogenese und, unabh{\"a}ngig davon, bei dem Abschn{\"u}rungsprozess der Tochterzellen w{\"a}hrend der Cytokinese.}, language = {de} } @phdthesis{Peter2016, author = {Peter, Tatjana}, title = {Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96472}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {III, 93}, year = {2016}, abstract = {Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur {\"u}bernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zur{\"u}ck. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder {\"u}berzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis daf{\"u}r, dass I in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms.}, language = {de} } @phdthesis{Krueger2011, author = {Kr{\"u}ger, Anne}, title = {Molekulare Charakterisierung von NE81 und CP75, zwei kernh{\"u}llen- und centrosomassoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-53915}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2011}, abstract = {Lamine bilden zusammen mit laminassoziierten Proteinen die nukle{\"a}re Lamina. Diese ist notwendig f{\"u}r die mechanische Stabilit{\"a}t von Zellen, die Organisation des Chromatins, der Genexpression, dem Fortgang des Zellzyklus und der Zellmigration. Die vielf{\"a}ltigen Funktionen der Lamine werden durch die Pathogenese von Laminopathien belegt. Zu diesen Erkrankungen, welche ihre Ursache in Mutationen innerhalb der laminkodierenden Gene, oder der Gene laminassoziierter bzw. laminprozessierender Proteine haben, z{\"a}hlen unter anderem das „Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom", die „Emery-Dreifuss" Muskeldystrophie und die dilatierte Kardiomyopathie. Trotz der fundamentalen Bedeutung der Lamine, wurden diese bisher nur in Metazoen und nicht in einzelligen Organismen detektiert. Der am{\"o}bide Organismus Dictyostelium discoideum ist ein haploider Eukaryot, der h{\"a}ufig als Modellorganismus in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie eingesetzt wird. Mit der Entdeckung von NE81, einem Protein das mit der inneren Kernh{\"u}lle von Dictyostelium discoideum assoziiert ist, wurde erstmals ein Protein identifiziert, dass man aufgrund seiner Eigenschaften als lamin{\"a}hnliches Protein in einem niederen Eukaryoten bezeichnen kann. Diese Merkmale umfassen die Existenz lamintypischer Sequenzen, wie die CDK1-Phosphorylierungsstelle, direkt gefolgt von einer zentralen „Rod"-Dom{\"a}ne, sowie eine typische NLS und die hoch konservierte CaaX-Box. F{\"u}r die Etablierung des NE81 als „primitives" Lamin, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Experimente durchgef{\"u}hrt, die strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten zu den Laminen in anderen Organismen aufzeigen konnten. Die Herstellung eines polyklonalen Antik{\"o}rpers erm{\"o}glichte die Verifizierung der subzellul{\"a}ren Lokalisation des NE81 durch Elektronenmikroskopie und gab Einblicke in das Verhalten des endogenen Proteins innerhalb des Zellzyklus. Mit der Generierung von NE81-Nullmutanten konnte demonstriert werden, dass NE81 eine wichtige Rolle bei der nukle{\"a}ren Integrit{\"a}t und der Chromatinorganisation von Zellen spielt. Des Weiteren f{\"u}hrte die Expression von zwei CaaX-Box deletierten NE81 - Varianten dazu, den Einfluss des Proteins auf die mechanische Stabilit{\"a}t der Zellen nachweisen zu k{\"o}nnen. Auch die Bedeutung der hochkonservierten CaaX-Box f{\"u}r die Lokalisation des Proteins wurde durch die erhaltenen Ergebnisse deutlich. Mit der Durchf{\"u}hrung von FRAP-Experimente konnte außerdem die strukturgebende Funktion von NE81 innerhalb des Zellkerns bekr{\"a}ftigt werden. Zus{\"a}tzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen, den Einfluss der Isoprenylcysteincarboxylmethyltransferase auf die Lokalisation des Proteins aufzukl{\"a}ren. Die Entdeckung eines lamin{\"a}hnlichen Proteins in einem einzelligen Organismus, der an der Schwelle zu den Metazoen steht, ist f{\"u}r die evolution{\"a}re Betrachtung der Entwicklung der sozialen Am{\"o}be und f{\"u}r die Erforschung der molekularen Basis von Laminopathien in einem einfachen Modellorganismus sehr interessant. Die Arbeit mit Dictyostelium discoideum k{\"o}nnte daher Wege aufzeigen, dass Studium der Laminopathien am Tiermodell drastisch zu reduzieren. In den letzten Jahren hat die Erforschung unbekannter Bestandteile des Centrosoms in Dictyostelium discoideum große Fortschritte gemacht. Eine zu diesem Zwecke von unserer Arbeitsgruppe durchgef{\"u}hrte Proteomstudie, f{\"u}hrte zur Identifizierung weiterer, potentiell centrosomaler Kandidatenproteine. Der zweite Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Kandidatenproteins, dem CP75. Es konnte gezeigt werden, dass CP75 einen echten, centrosomalen Bestandteil darstellt, der mikrotubuli-unabh{\"a}ngig mit der Core Struktur des Zellorganells assoziiert ist. Weiterhin wurde deutlich, dass die Lokalisation am Centrosom in Abh{\"a}ngigkeit vom Zellzyklus erfolgt und CP75 vermutlich mit CP39, einem weiteren centrosomalen Core Protein, interagiert.}, language = {de} }