@phdthesis{Sureshkumar2023,
  author    = {Sureshkumar, Priyavathi},
  title     = {Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System f{\"u}r die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkan{\"a}le},
  doi       = {10.25932/publishup-61987},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {x, 110},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als g{\"a}ngige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten f{\"u}r das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkan{\"a}le sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der {\"U}berexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten k{\"o}nnen, wie z. B. Zelltoxizit{\"a}t, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund ver{\"a}nderter Dom{\"a}nen sowie die zeitaufw{\"a}ndige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkan{\"a}len in zellfreien Proteinsyntheseplattformen f{\"u}r das k{\"u}nftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung f{\"u}r die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkan{\"a}len in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ {\"u}berexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkan{\"a}len (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie {\"u}berexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) {\"u}ber Mas und die Beteiligung von TRP-Kan{\"a}len nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode f{\"u}r chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran f{\"u}r die Integration synthetisierter Ionenkan{\"a}le in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkan{\"a}le zu untersuchen. Die Enzymaktivit{\"a}t der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkan{\"a}le wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkan{\"a}le zu analysieren. Nach entsprechender Forschung k{\"o}nnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkan{\"a}le wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkan{\"a}le.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaefer2024,
  author    = {Sch{\"a}fer, Marj{\"a}nn Helena},
  title     = {Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei S{\"a}ugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-M{\"a}usen mit humanisierter Reaktionsspezifit{\"a}t der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b)},
  doi       = {10.25932/publishup-62034},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XVII, 280},
  year      = {2024},
  abstract  = {Arachidons{\"a}urelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. F{\"u}r jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr {\"a}hnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabh{\"a}ngigkeit der enzymatischen Eigenschaften von S{\"a}ugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzh{\"o}rnchen (Tupaiidae) sind evolution{\"a}r n{\"a}her mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle f{\"u}r die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidons{\"a}urestoffwechsel von Spitzh{\"o}rnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften {\"a}hneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei M{\"a}usen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel f{\"u}r die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese k{\"o}nnen S{\"a}ugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidons{\"a}ure-12-lipoxygenierende- und Arachidons{\"a}ure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren S{\"a}ugetierspezies, die einen h{\"o}heren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidons{\"a}ure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, w{\"a}hrend evolution{\"a}r weniger weit entwickelte S{\"a}ugetiere Arachidons{\"a}ure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse f{\"u}gen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten best{\"a}tigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, k{\"o}nnen Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen {\"u}bertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in M{\"a}use durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparagins{\"a}ure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese M{\"a}use waren lebens- und fortpflanzungsf{\"a}hig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entz{\"u}ndungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entz{\"u}ndungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entz{\"u}ndungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b f{\"u}hrte zu einer verst{\"a}rkten Ausbildung von Entz{\"u}ndungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschw{\"a}chung der Entz{\"u}ndungssymptome im Freund'schen Adjuvans Pfoten{\"o}demmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entz{\"u}ndungsmodellen unterscheidet.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{ColemanMacGregorofInneregny,
  author    = {Coleman Mac Gregor of Inneregny, Charles Dominic},
  title     = {Rolle von mPGES1-abh{\"a}ngig gebildetem Prostaglandin E2 bei der Ausbildung von Insulinresistenz und nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung durch die Modulation der Funktion von Lebermakrophagen},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {183},
  abstract  = {Eine St{\"o}rung des Leberstoffwechsels durch die Ausbildung einer Insulinresistenz kann zu Folgeerkrankungen wie der nicht alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) bis hin zur Steatohepatitis (NASH) und zur Entwicklung eines Diabetes Typ II f{\"u}hren. Am Krankheitsverlauf sind residente (Kupfferzellen) sowie infiltrierende Makrophagen beteiligt, die durch inflammatorische Stimuli aktiviert werden und zur Progression von Lebererkrankungen f{\"u}hren k{\"o}nnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von mPGES1-abh{\"a}ngig gebildetem Prostaglandin E2 (PGE2) an der Modulation von aktivierten Lebermakrophagen untersucht. Dazu wurden Kupfferzellen und Peritonealmakrophagen (als Modell f{\"u}r infiltrierende Makrophagen) aus Wildtyp und mPGES1-defizienten M{\"a}usen isoliert. Beide Makrophagen­populationen wurden in Zellkulturversuchen mit Lipopolysacchariden (LPS) aktiviert und auf ihre PGE2-Synthese, Genexpression und Sekretion von verschiedenen Cytokinen hin untersucht. Die beiden Makrophagenpopulationen unterschieden sich hinsichtlich der PGE2-Synthese bei mPGSE1-Defizienz. W{\"a}hrend bei Peritonealmakrophagen die LPS-abh{\"a}ngige PGE2-Synthese bei Abwesenheit der mPGES1 fast vollst{\"a}ndig reprimiert war, war bei Kupfferzellen nur eine 25\%ige Abnahme zu verzeichnen. Die postulierte selbstverst{\"a}rkende R{\"u}ckkopplungsschleife von PGE2 im Hinblick auf seine eigene Synthese konnte in isolierten Peritonealmakrophagen, nicht jedoch in Kupfferzellen, best{\"a}tigt werden. In Kupfferzellen f{\"u}hrte exogenes PGE2 ferner zu einer Repression von den pro-inflammatorischen Cytokinen TNFα und IL-1β und f{\"u}r endogenes PGE2 konnte in diesem Zelltyp kein Effekt festgestellt werden. In Peritonealmakrophagen konnte hingegen auch f{\"u}r endogenes PGE2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von TNFα beobachtet werden. Das ist eventuell auf eine h{\"o}here Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber PGE2 von Peritonealmakrophagen im Vergleich zu Kupfferzellen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. PGE2 wirkte unter den gew{\"a}hlten Versuchsbedingungen in vitro somit eher anti-inflammatorisch. Cholesterolkristalle induzierten in Kupfferzellen die Expression der PGE2-synthetisierenden Enzyme und verschiedener pro-inflammatorische Cytokine. Sie k{\"o}nnten somit zu einer Progression von NAFL zu NASH beitragen. Die Daten aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass PGE2 im Rahmen von entz{\"u}ndlichen Leberver{\"a}nderungen eine eher protektive Wirkung im Hinblick auf die Progression von NAFLD und Insulinresistenz haben k{\"o}nnte.},
  language  = {de}
}