@phdthesis{Kuester2002, author = {K{\"u}ster, Frank}, title = {Das Lektin aus der Erbse Pisum sativum : Bindungsstudien, Monomer-Dimer-Gleichgewicht und R{\"u}ckfaltung aus Fragmenten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000612}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2002}, abstract = {Das Lektin aus Pisum sativum, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quart{\"a}rstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminos{\"a}uresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabh{\"a}ngige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschr{\"a}nkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Dom{\"a}ne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der nat{\"u}rliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests f{\"u}r Erbsenlektin durchgef{\"u}hrt und seine Faltung, Stabilit{\"a}t und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung f{\"u}r Stabilit{\"a}t und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in E. coli exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilit{\"a}t gegen{\"u}ber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten k{\"o}nnen und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichts{\"u}bergang, und es ist nicht m{\"o}glich, die thermodynamische Stabilit{\"a}t zu bestimmen. Die Stabilit{\"a}t und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind f{\"u}r beide Proteine gleich. Dar{\"u}ber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden. Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 \% m{\"o}glich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 \%, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die l{\"a}ngere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativ{\"a}hnlicher Untereinheitenkontaktfl{\"a}che bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten k{\"u}rzeren Kette mit diesem Dimer.}, language = {de} } @phdthesis{Pacholsky2003, author = {Pacholsky, Dirk}, title = {Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte w{\"a}hrend der Muskelentwicklung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001161}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2003}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) {\"u}ber Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse n{\"a}her charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 - hXirp1 und 2 -bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminos{\"a}uren bestanden. Ihre Aminos{\"a}uresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier n{\"a}her untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-{\"U}bergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. W{\"a}hrend der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr fr{\"u}he Expression, zusammen mit einer pr{\"a}gnanten Lokalisation an den Pr{\"a}myofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend f{\"u}r die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine k{\"o}nnen somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch w{\"a}hrend der Myofibrillogenese zukommt.}, language = {de} } @phdthesis{Walter2002, author = {Walter, Monika}, title = {Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilit{\"a}t, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000588}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2002}, abstract = {Die Pektat-Lyasen geh{\"o}ren zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturons{\"a}ure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Prim{\"a}rzellw{\"a}nden. Der Abbau der alpha-1,4-verbr{\"u}ckten Galakturons{\"a}urereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer unges{\"a}ttigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. F{\"u}r die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium n{\"o}tig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsg{\"a}ngige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gel{\"o}st worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungef{\"a}hren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbr{\"u}cken enth{\"a}lt. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verh{\"a}ltnism{\"a}ßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen {\"u}ber die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins n{\"a}her zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage gekl{\"a}rt werden, welche Wechselwirkungen f{\"u}r die Stabilit{\"a}t dieses Proteins einerseits und f{\"u}r die Stabilit{\"a}t von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
R{\"u}ckfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollst{\"a}ndig m{\"o}glich. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit der R{\"u}ckfaltungsrate im Bereich des {\"U}bergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der R{\"u}ckfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollst{\"a}ndig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren k{\"o}nnen. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativ{\"a}hnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminos{\"a}uren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) f{\"u}hrte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivit{\"a}t, da die Mutationsstelle in der N{\"a}he der putativen Substratbindetasche liegt. Die R{\"u}ckfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10\&\#176;C ann{\"a}hernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht ver{\"a}ndert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands f{\"u}hrte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10\&\#176;C. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivit{\"a}t einen kooperativen Phasen{\"u}bergang mit einem {\"U}bergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die {\"U}bereinstimmung der Faltungs{\"u}berg{\"a}nge bei beiden Messparametern konnten die Faltungs{\"u}berg{\"a}nge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung f{\"u}r die Mutante von -\ 64.2\ \&\#177;\ 0.4\ kJ/mol und eine Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs von -\ 58.2\ \&\#177;\ 0.3\ kJ/(mol\&\#183;M) bestimmt.
BsPel enth{\"a}lt, wie die meisten monomeren rechtsg{\"a}ngigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbr{\"u}ckter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zug{\"a}nglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilit{\"a}t und R{\"u}ckfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A n{\"a}her analysiert. Dabei f{\"u}hrte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings f{\"u}hrten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsph{\"a}notyp und die Hysterese im Denaturierungs{\"u}bergang wurde verst{\"a}rkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr fr{\"u}h ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im {\"U}bergangszustand vorhanden.}, subject = {Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix }, language = {de} } @phdthesis{Barbirz2005, author = {Barbirz, Stefanie}, title = {Konservierte Struktur bei genetischer Mosaizit{\"a}t : die Tailspike Proteine dreier Phagen der Familie Podviridae}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-6885}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminos{\"a}uren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenz{\"u}bereinstimmung. Mit R{\"o}ntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsg{\"a}ngigen beta-Helix falten, wie dies schon f{\"u}r P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.}, subject = {Bakteriophagen}, language = {de} } @phdthesis{Lengefeld2010, author = {Lengefeld, Jan}, title = {Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung am BESSY : M{\"o}glichkeiten und Grenzen bei der Untersuchung biologischer Proben}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-44263}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit wurden die M{\"o}glichkeiten und Grenzen f{\"u}r Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau f{\"u}r Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring f{\"u}r Synchrotronstrahlung eingesetzt, die f{\"u}r Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zug{\"a}nglichen Wellenl{\"a}ngenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in w{\"a}ssriger L{\"o}sung einschr{\"a}nkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen F{\"a}llen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadl{\"a}nge deutlich reduziert werden und verschieden Probenk{\"u}vetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenk{\"u}vetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlensch{\"a}den begrenzen jedoch die Zuverl{\"a}ssigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schr{\"a}nkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in w{\"a}ssriger L{\"o}sung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden k{\"o}nnen, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in w{\"a}ssriger L{\"o}sung dar.}, language = {de} } @phdthesis{Schmidt2015, author = {Schmidt, Andreas}, title = {Charakterisierung der Lipopolysaccharid-Bindungseigenschaften von Adh{\"a}sionsproteinen aus Salmonella-Bakteriophagen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-79529}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {VIII, 114}, year = {2015}, abstract = {Die Interaktionen von komplexen Kohlenhydraten und Proteinen sind ubiquit{\"a}r. Sie spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen Prozessen wie Zelladh{\"a}sion, Signaltransduktion sowie bei viralen Infektionen. Die molekularen Grundlagen der Interaktion sind noch nicht komplett verstanden. Ein Modellsystem f{\"u}r Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen besteht aus Adh{\"a}sionsproteinen (Tailspikes) von Bakteriophagen, die komplexe Kohlenhydrate auf bakteriellen Oberfl{\"a}chen (O-Antigen) erkennen. Das Tailspike-Protein (TSP), das in dieser Arbeit betrachtet wurde, stammt aus dem Bakteriophagen 9NA (9NATSP). 9NATSP weist eine hohe strukturelle Homologie zum gut charakterisierten TSP des Phagen P22 (P22TSP) auf, bei einer niedriger sequenzieller {\"A}hnlichkeit. Die Substratspezifit{\"a}ten beider Tailspikes sind {\"a}hnlich mit Ausnahme der Toleranz gegen{\"u}ber den glucosylierten Formen des O-Antigens. Die Struktur der beiden Tailspikes ist bekannt, sodass sie ein geeignetes System f{\"u}r vergleichende Bindungsstudien darstellen, um die strukturellen Grundlagen f{\"u}r die Unterschiede der Spezifit{\"a}t zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ELISA-like tailspike adsorption assay (ELITA) etabliert, um Binderpaare aus TSPs und O-Antigen zu identifizieren. Dabei wurden 9NATSP und P22TSP als Sonden eingesetzt, deren Bindung an die intakten, an die Mikrotiterplatte adsorbierten Bakterien getestet wurde. Beim Test einer Sammlung aus 44 Salmonella-St{\"a}mmen wurden St{\"a}mme identifiziert, die bindendes O-Antigen exprimieren. Gleichzeitig wurden Unterschiede in der Bindung der beiden TSPs an Salmonella-St{\"a}mme mit gleichem O-Serotyp beobachtet. Die Ergebnisse der ELITA-Messung wurden qualitativ durch eine FACS-basierte Bindungsmessung best{\"a}tigt. Zus{\"a}tzlich erm{\"o}glichte die FACS-Messung bei St{\"a}mmen, die teilweise modifizierte O-Antigene herstellen, den Anteil an Zellen mit und ohne Modifikation zu erfassen. Die Oberfl{\"a}chenplasmonresonanz (SPR)-basierten Interaktionsmessungen wurden eingesetzt, um Bindungsaffinit{\"a}ten f{\"u}r eine TSP-O-Antigen Kombination zu quantifizieren. Daf{\"u}r wurden zwei Methoden getestet, um die Oligosaccharide auf einem SPR-Chip zu immobilisieren. Zum einen wurden die enzymatisch hergestellten O-Antigenfragmente mit einem bifunktionalen Oxaminadapter derivatisiert, der eine prim{\"a}re Aminogruppe f{\"u}r die Immobilisierung bereitstellt. Ein Versuch, diese Oligosaccharidfragmente zu immobilisieren, war jedoch nicht erfolgreich. Dagegen wurde das nicht derivatisierte Polysaccharid, bestehend aus repetitivem O-Antigen und einem konservierten Kernsaccharid, erfolgreich auf einem SPR-Chip immobilisiert. Die Immobilisierung wurde durch Interaktionsmessungen mit P22TSP best{\"a}tigt. Durch die Immobilisierung des Polysaccharids sind somit quantitative SPR-Bindungsmessungen mit einem polydispersen Interaktionspartner m{\"o}glich. Eine Auswahl von Salmonella-St{\"a}mmen mit einer ausgepr{\"a}gt unterschiedlichen Bindung von 9NATSP und P22TSP im ELITA-Testsystem wurde hinsichtlich der Zusammensetzung des O-Antigens mittels HPLC, Kapillargelelektrophorese und MALDI-MS analysiert. Dabei wurden nicht-st{\"o}chiometrische Modifikationen der O-Antigene wie Acetylierung und Glucosylierung detektiert. Das Ausmaß der Glucosylierung korrelierte negativ mit der Effizienz der Bindung und des Verdaus durch die beiden TSPs, wobei der negative Effekt bei 9NATSP weniger stark ausgepr{\"a}gt war als bei P22TSP. Dies stimmt mit den Literaturdaten zu Infektivit{\"a}tsstudien mit 9NA und P22 {\"u}berein, die mit St{\"a}mmen mit vergleichbaren O-Antigenvarianten durchgef{\"u}hrt wurden. Die Korrelation zwischen der Glucosylierung und Bindungseffizienz konnte strukturell interpretiert werden. Auf Grundlage der O-Antigenanalysen sowie der Ergebnisse der ELITA- und FACS-Bindungstests wurden die Salmonella-St{\"a}mme Brancaster und Kalamu identifiziert, die ann{\"a}hernd quantitativ glucosyliertes O-Antigen exprimieren. Damit eignen sich diese St{\"a}mme f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Studien, um die Zusammenh{\"a}nge zwischen der Spezifit{\"a}t und der Organisation der Bindestellen der beiden TSPs zu untersuchen.}, language = {de} } @phdthesis{Lehmann2018, author = {Lehmann, Andreas}, title = {Variability in human life history traits}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {110}, year = {2018}, language = {de} }