@phdthesis{Pitzen2022, author = {Pitzen, Valentin}, title = {Weitergef{\"u}hrte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Am{\"o}ben}, doi = {10.25932/publishup-54889}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XI, 104}, year = {2022}, abstract = {Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriol{\"a}r aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und m{\"o}gliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es w{\"a}hrend der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am st{\"a}rksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen w{\"a}hrend der Mitose wird f{\"u}r Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten {\"a}ußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 f{\"u}hrte zur Ausbildung von {\"u}berz{\"a}hligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erh{\"o}hten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochaufl{\"o}sende Expansion Microscopy f{\"u}r das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den {\"a}ußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in r{\"a}umlicher N{\"a}he zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als m{\"o}glicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und erm{\"o}glichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verst{\"a}ndnis der Topologie des Centrosoms.}, language = {de} } @phdthesis{Zemella2019, author = {Zemella, Anne}, title = {Fluoreszenzmarkierung und Modifizierung von komplexen Proteinen in eukaryotischen zellfreien Systemen durch die Etablierung von orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paaren}, doi = {10.25932/publishup-44236}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-442361}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XI, 141}, year = {2019}, abstract = {Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in ad{\"a}quaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren k{\"o}nnen. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abh{\"a}ngige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. F{\"u}r diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, k{\"o}nnten diese zuk{\"u}nftig in zellfreien Systemen f{\"u}r die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden k{\"o}nnen. Neben der reinen Proteinherstellung k{\"o}nnen Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, f{\"u}r den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden. Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminos{\"a}ure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zus{\"a}tzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminos{\"a}ure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders f{\"u}r eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformations{\"a}nderung im Adora2a {\"u}ber einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde dar{\"u}ber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilit{\"a}t und Halbwertszeit des Proteins ver{\"a}ndert wurden. Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminos{\"a}uren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue M{\"o}glichkeiten f{\"u}r die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden.}, language = {de} } @phdthesis{Fischbach2017, author = {Fischbach, Jens}, title = {Isothermale Amplifikationsmethoden f{\"u}r den DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Pathogennachweis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {viii, 125}, year = {2017}, abstract = {Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleins{\"a}ure-basierte Methoden f{\"u}r den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchf{\"u}hrbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleins{\"a}ure-basierten Diagnostik kann durch die Einf{\"u}hrung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kosteng{\"u}nstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielf{\"a}ltige Detektionsm{\"o}glichkeiten, die sowohl f{\"u}r Schnelltest- als auch f{\"u}r Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode f{\"u}r den einfachen, schnellen und g{\"u}nstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abh{\"a}ngiger Detektionsverfahren. Hier wurden zun{\"a}chst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abh{\"a}ngige Fluoreszenzfarbstoffe f{\"u}r die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden k{\"o}nnen. Als Alternative f{\"u}r die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe f{\"u}r den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus f{\"u}r die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: F{\"u}r den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivit{\"a}t zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegen{\"u}ber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zus{\"a}tzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen f{\"u}r die Endpunktdetektion verwendet werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das f{\"u}r den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch f{\"u}r die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zus{\"a}tzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abh{\"a}ngige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP {\"u}ber das Pyrophosphat identifiziert werden. Daf{\"u}r wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilit{\"a}t und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden k{\"o}nnen. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit zwischen den einzelnen Komponenten f{\"u}r einen fluorimetrischen Verdr{\"a}ngungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verh{\"a}ltnis' als Intensit{\"a}tsmatrix (heatmap) konnten zun{\"a}chst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als g{\"u}nstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abh{\"a}ngige Zunahme der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich f{\"u}r die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilit{\"a}t und Homogenit{\"a}t der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tr{\"o}pfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S m{\"o}glich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gew{\"a}hrleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die R{\"u}ckfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivit{\"a}t am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur m{\"o}glich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification" (HIP) konnte abschließend durch die Verk{\"u}rzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-{\"a}hnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsf{\"a}higen Alternative f{\"u}r die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsf{\"a}higkeit der qualitativen und quantitativen LAMP f{\"u}r die Feldanwendungen und f{\"u}r die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden k{\"o}nnen und so eine einfache Pathogendiagnostik erm{\"o}glichen. Die gezeigten Methoden k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegen{\"u}ber den herk{\"o}mmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP f{\"u}r den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei k{\"o}nnen die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngigen Reaktionen erm{\"o}glicht dar{\"u}ber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zuk{\"u}nftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik m{\"o}glich.}, language = {de} } @phdthesis{Schwonbeck2004, author = {Schwonbeck, Susanne}, title = {Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberfl{\"a}chen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001853}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. F{\"u}r die Analyse wurde ein faseroptischer Affinit{\"a}tssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die Versuche am faseroptischen Affinit{\"a}tssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied l{\"a}sst sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfl{\"a}che sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell f{\"u}r die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter f{\"u}r ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenit{\"a}t als auch im Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis wurden an NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen erreicht. F{\"u}r die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenl{\"a}nge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glastr{\"a}ger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96\%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen best{\"a}tigt werden. Ursache f{\"u}r die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem f{\"u}r die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverl{\"a}ssig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA m{\"o}glich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht ver{\"o}ffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kosteng{\"u}nstigere und weniger hoch dimensionierte L{\"o}sung f{\"u}r Fragestellungen beispielsweise in der Ern{\"a}hrungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zuk{\"u}nftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.}, language = {de} } @phdthesis{Steffen2005, author = {Steffen, Jenny}, title = {Transkription von Markergenen an immbolisierten Nukleins{\"a}uren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-10282}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberfl{\"a}chen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Dar{\"u}ber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Br{\"u}ckenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfl{\"a}che erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierf{\"u}r entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfl{\"a}che transferiert. {\"U}ber eine Oberfl{\"a}chen-PCR war es m{\"o}glich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfl{\"a}che zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize m{\"o}glich. Der Vorteil einer Oberfl{\"a}chen-Transkription gegen{\"u}ber der in L{\"o}sung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberfl{\"a}chen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel {\"u}ber eine echte Festphasen-Translation nicht ausger{\"a}umt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberfl{\"a}chen m{\"o}glich ist, wof{\"u}r die linearen Matrizen direkt auf der Oberfl{\"a}che synthetisiert werden k{\"o}nnen.}, subject = {Immobilisierung}, language = {de} } @phdthesis{Andresen2009, author = {Andresen, Dennie}, title = {Entwicklung von Microarrays f{\"u}r die Multiparameteranalytik und Etablierung einer Multiplex-OnChip-PCR}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-39462}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {In der molekularen Diagnostik besteht ein Bedarf an schnellen und spezifischen Testsystemen, die entweder f{\"u}r die Labordiagnostik oder in Point of Care-Umgebungen eingesetzt werden k{\"o}nnen. Um dieses Ziel zu erreichen, stehen die Miniaturisierung und Parallelisierung im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Die f{\"u}hrende Methode im Bereich der DNA-Analytik ist derzeit die Realtime-PCR. Dieser Technologie sind hinsichtlich der Multiplexf{\"a}higkeit technologischen H{\"u}rden gesetzt, da derzeit nur eine Analyse von maximal vier Parametern parallel in einem Versuchsansatz erfolgen kann. Microarrays stellen hingegen die ben{\"o}tigten Voraussetzungen zur Verf{\"u}gung, um als Werkzeuge f{\"u}r die Multiparameteranalyse in verschiedensten Anwendungsbereichen zu dienen. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Multiplex-PCRs und diagnostische Microarrays zu entwickeln, die f{\"u}r analytische Fragestellungen eine schnelle und zuverl{\"a}ssige Multiparameteranalytik erm{\"o}glichen, um die bisherigen Einschr{\"a}nkungen aktueller Nachweisverfahren zu vermeiden. Als Anwendungen wurden zum einen ein Nachweissystem f{\"u}r acht relevante Gefl{\"u}gelpathogene zur {\"U}berwachung in der Gefl{\"u}gelzucht, zum anderen ein Nachweissystem zur Identifikation potentiell allergener Lebensmittelinhaltstoffe entwickelt. Neben der Entwicklung geeigneter PCR und Multiplex-PCR-Verfahren sowie spezifischer Microarrays f{\"u}r die Detektion der gesuchten Zielsequenzen stand auch die weiterf{\"u}hrende Integration von DNA-Amplifikation und Microarray-Technologie im Fokus dieser Arbeit. Die OnChip-Amplifikation stellt eine M{\"o}glichkeit dar, um DNA-Analytik und Detektion in einem Reaktionsschritt zu integrieren. Entsprechend wurden die in der Arbeit entwickelten PCR- und Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis potentieller allergener Lebensmittelinhaltsstoffe f{\"u}r die OnChip-Amplifikation adaptiert und Reaktionsbedingungen getestet, die eine Multiparameteranalyse auf dem Chip erm{\"o}glichen. Die entwickelten OnChip-PCR-Verfahren zeigten eine hohe Spezifit{\"a}t sowohl in Single- als auch in der Multiplex-OnChip-PCR. Eine Sensitivit{\"a}t von 10 Kopien bzw. <10ppm konnte in Single-OnChip-PCRs f{\"u}r den Nachweis allergener Lebensmittelinhaltsstoffe gezeigt werden. In Multiplex-OnChip-PCRs konnten 10-100ppm allergene Verunreinigungen spezifisch in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden. Ein weiterer Schritt in Richtung einer m{\"o}glichen Verwendung im Point of Care-Bereich stellt der Einsatz eines isothermalen Amplifikationsverfahrens dar. Vorteil eines solchen Verfahrens ist die M{\"o}glichkeit, auf das ansonsten ben{\"o}tigte Thermocycling zu verzichten. Dies vereinfacht eine Integration der OnChip-Amplifikation in mobile Analyseger{\"a}te oder Lab on Chip-Systeme und qualifiziert das Verfahren f{\"u}r den Einsatz in Point of Care-Umgebungen. In dieser Arbeit wurde eine noch junge isothermale Amplifikationsmethode, die helikase-abh{\"a}ngige Amplifikation (HDA), hinsichtlich ihrer Eignung f{\"u}r die Integration auf einem Microarray getestet. Hierf{\"u}r konnte die bislang erste OnChip-HDA f{\"u}r Einzel- und Duplex-Nachweise von Pathogenen entwickelt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Breitenstein2012, author = {Breitenstein, Michael}, title = {Ortsaufgel{\"o}ster Aufbau von DNA-Nanostrukturen auf Glasoberfl{\"a}chen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-61857}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA erm{\"o}glicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA pr{\"a}destinieren dieses Makromolek{\"u}l f{\"u}r den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierf{\"u}r war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es erm{\"o}glicht, Funktionsmolek{\"u}le als Ankerelemente ortsaufgel{\"o}st auf eine Oberfl{\"a}che zu deponieren. Das Deponieren dieser Molek{\"u}le sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens f{\"u}r diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgel{\"o}sten Deponieren von Funktionsmolek{\"u}len nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift" umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte" beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab m{\"o}glich war. Dieses Neutravidinmolek{\"u}l {\"u}bernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfl{\"a}che und dem eigentlichen Adressmolek{\"u}l. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolek{\"u}l durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend f{\"u}r dieses Verfahren war die M{\"o}glichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschr{\"a}nkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu k{\"o}nnen, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu k{\"o}nnen. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplement{\"a}re Adressequenzen enth{\"a}lt, um gezielt mit den oberfl{\"a}chenst{\"a}ndigen Ankerelementen binden zu k{\"o}nnen. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molek{\"u}len mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden.}, language = {de} } @phdthesis{Marschan2005, author = {Marschan, Xenia}, title = {Mikroarray-basierte Detektion von mRNA aus Zellen mittels On-Chip-PCR}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-5457}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2005}, abstract = {Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. F{\"u}r ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 \&\#181;g Hybridisierungstarget ben{\"o}tigt. Dazu m{\"u}ssen entweder 15 - 20 \&\#181;g RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpr{\"a}parationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu l{\"o}sen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer L{\"o}sungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden k{\"o}nnen: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfl{\"a}che. Diese M{\"o}glichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden f{\"u}r die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung {\"u}ber Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde f{\"u}r amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberfl{\"a}chen sowie f{\"u}r EDC-Kopplung auf silanisierten Oberfl{\"a}chen gezeigt. F{\"u}r die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10\&\#181;M schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern w{\"a}hrend der PCR erm{\"o}glicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zus{\"a}tzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu k{\"o}nnen. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode f{\"u}r den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet.}, subject = {Polymerase-Kettenreaktion}, language = {de} } @phdthesis{Schmidt2003, author = {Schmidt, Peter Michael}, title = {Aktivit{\"a}tsmessung auf nukleins{\"a}uremodifizierten Oberfl{\"a}chen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000797}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2003}, abstract = {Im Bereich der medizinischen Diagnostik spielen DNA-Chips eine immer wichtigere Rolle. Dabei werden Glas- oder Silikon-Oberfl{\"a}chen mit Tausenden von einzelstr{\"a}ngigen DNA-Fragmenten, sog. Sonden, best{\"u}ckt, die mit den passenden DNA-Fragmenten in der zugef{\"u}gten Patientenprobe verschmelzen. Die Auswertung solcher Messungen liefert die Diagnose f{\"u}r Krankheiten wie z.B. Krebs, Alzheimer oder f{\"u}r den Nachweis pathogener Erreger. Durch fortschreitende Miniaturisierung dieser Meßsysteme k{\"o}nnen bis zu 40.000 Genfragmente des Menschen in einer einzigen Messung analysiert werden. Neben den DNA-Fragmenten k{\"o}nnen Bio-Chips auch f{\"u}r andere biologische Komponenten wie Antik{\"o}rper und Proteine eingesetzt werden, wobei bei letzteren neben der Bindung auch die Aktivit{\"a}t ein wichtiger Diagnoseparamter ist. Am Fraunhofer-Institut f{\"u}r medizinische Technik und am Lehrstuhl f{\"u}r Analytische Biochemie der Universit{\"a}t Potsdam wurden im Rahmen einer Doktorarbeit Methoden entwickelt, die es erm{\"o}glichen auf nukleins{\"a}uremodifizierten Sensoroberfl{\"a}chen die Aktivit{\"a}t von Proteinen zu messen. Es wurden Nukleins{\"a}uren auf Oberfl{\"a}chen optischer Sensoren verankert. Diese fungierten als Rezeptor f{\"u}r die Proteine sowie auch als Substrat f{\"u}r Restriktionsenzyme, die Nukleins{\"a}uren schneiden und Polymerasen, die Nukleins{\"a}uren synthetisieren und verl{\"a}ngern k{\"o}nnen. Seine Anwendung fand diese Messmethode in der Messung der Aktivit{\"a}t des Proteins Telomerase, das in 90\% aller Tumore erh{\"o}hte Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber gesunden Zellen aufweist. Die Vorteile dieses neuen Assays gegen{\"u}ber {\"a}lteren Methoden liegt im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten und einer deutlich verk{\"u}rzten Analysezeit. Die Arbeit schliesst mit einem funktionsf{\"a}higen Nachweis der Telomeraseaktivit{\"a}t im Zellextrakt von gesunden und kranken Zellen. Der direkte Einfluß von Hemmstoffen auf die Aktivit{\"a}t konnte sichtbar gemacht werden, und steht daher bei der Entwicklung neuer Tumor-Diagnostika und Therapeutika zur Verf{\"u}gung.}, language = {de} } @phdthesis{Froemmel2013, author = {Fr{\"o}mmel, Ulrike}, title = {Vergleichende geno- und ph{\"a}notypische Charakterisierung von Escherichia coli aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-69147}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2013}, abstract = {Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von S{\"a}ugern, jedoch zudem der h{\"a}ufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. H{\"a}ufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies f{\"u}hrte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterst{\"u}tzen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen {\"u}ber den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adh{\"a}sion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchf{\"u}hrung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. F{\"u}r die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. F{\"u}r die ph{\"a}notypische Charakterisierung wurden Adh{\"a}sions- und Zytotoxizit{\"a}tsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wilds{\"a}ugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adh{\"a}sionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adh{\"a}sionsraten als auch die Adh{\"a}sionsmuster der 317 nicht h{\"a}molytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizit{\"a}t der 81 h{\"a}molytischen Isolate wurde in Abh{\"a}ngigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien gepr{\"u}ft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Pr{\"a}valenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die gr{\"o}ßte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adh{\"a}sionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adh{\"a}rierten. Ein Drittel der Isolate adh{\"a}rierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adh{\"a}rierten stark an allen Zelllinien. Grunds{\"a}tzlich adh{\"a}rierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichh{\"o}rnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adh{\"a}rieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adh{\"a}sionsmuster diffuse Adh{\"a}sion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adh{\"a}sionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer h{\"o}heren Adh{\"a}sionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizit{\"a}tsassays zeigten eine sehr starke und zeitabh{\"a}ngige Zerst{\"o}rung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-H{\"a}molysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizit{\"a}t h{\"a}molytischer Isolate aus Wildtieren gegen{\"u}ber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es m{\"o}glich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein {\"U}berblick {\"u}ber die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adh{\"a}sionsf{\"a}higkeit und ausgepr{\"a}gter Zytotoxizit{\"a}t als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adh{\"a}sion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der m{\"o}gliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung best{\"a}tigt werden. In weiterf{\"u}hrenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerl{\"a}sslich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adh{\"a}sionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-H{\"a}molysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adh{\"a}sionsunterst{\"u}tzender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragw{\"u}rdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten erm{\"o}glichen.}, language = {de} } @phdthesis{Wunderlich2014, author = {Wunderlich, Kai}, title = {Entwicklung einer parallelen Mehrkomponentenanalyse von Antigen-Antik{\"o}rper-Reaktionen in der Dopinganalyse}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {VIII, 130}, year = {2014}, abstract = {Weltweit streben Anti-Doping Institute danach jene Sportler zu {\"u}berf{\"u}hren, welche sich unerlaubter Mittel oder Methoden bedienen. Die hierf{\"u}r notwendigen Testsysteme werden kontinuierlich weiterentwickelt und neue Methoden aufgrund neuer Wirkstoffe der Pharmaindustrie etabliert. Gegenstand dieser Arbeit war es, eine parallele Mehrkomponentenanalyse auf Basis von Antigen-Antik{\"o}rper Reaktionen zu entwickeln, bei dem es prim{\"a}r um Verringerung des ben{\"o}tigten Probevolumens und der Versuchszeit im Vergleich zu einem Standard Nachweis-Verfahren ging. Neben der Verwendung eines Multiplex Ansatzes und der Mikroarraytechnologie stellten ebenfalls die Genauigkeit aller Messparameter, die Stabilit{\"a}t des Versuchsaufbaus sowie die Performance {\"u}ber einen Einfach-Blind-Ansatz Herausforderungen dar. Die Anforderung an den Multiplex Ansatz, keine falschen Signale trotz {\"a}hnlicher Strukturen zu messen, konnte durch die gezielte Kombination von spezifischen Antik{\"o}rpern realisiert werden. Hierf{\"u}r wurden neben Kreuzreaktivit{\"a}tstests auf dem Mikroarray parallel erfolgreich Western Blot Versuche durchgef{\"u}hrt. Jene Antik{\"o}rper, welche in diesen Versuchen die gesetzten Anforderungen erf{\"u}llten, wurden f{\"u}r das Ermitteln der kleinsten nachweisbaren Konzentration verwendet. {\"U}ber das Optimieren der Versuchsbedingungen konnte unter Verwendung von Tween in der Waschl{\"o}sung sowohl auf Glas als auch auf Kunststoff die Hintergrundfluoreszenz reduziert und somit eine Steigerung des Signal/Hintergrundverh{\"a}ltnisses erreicht werden. In den Versuchen zu Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurde f{\"u}r das humane Choriongonadotropin (hCG-i) eine Konzentration von 10 mU/ml, f{\"u}r dessen beta-Untereinheit (hCG-beta) eine Konzentration von 3,6 mU/ml und f{\"u}r das luteinisierende Hormon (LH) eine Konzentration von 10 mU/ml bestimmt. Den ermittelten Wert im Serum f{\"u}r das hCG-i entspricht dem von der Welt-Anti-Dopin-Agentur (WADA) geforderten Wert in Urin von 5 mU/ml. Neben der Ermittlung von Bestimmungsgrenzen wurden diese hinsichtlich auftretender Matrixeffekte in Serum und Blut gemessen. Wie aus den Versuchen zur Ermittlung von Kreuzreaktivit{\"a}ten auf dem Mikroarray zu entnehmen ist, lassen sich das LH, das hCG-i und hCG-β ebenfalls in Serum und Blut messen. Die Durchf{\"u}hrung einer Performance-Analyse {\"u}ber einem Einfach-Blind-Ansatz mit 130 Serum Proben, wurde ebenfalls {\"u}ber dieses System realisiert. Die ausgewerteten Proben wurden anschließend {\"u}ber eine Grenzwertoptimierungskurve analysiert und die diagnostische Spezifit{\"a}t ermittelt. F{\"u}r die Messungen des LH konnte eine Sensitivit{\"a}t und Spezifit{\"a}t von 100\% erreicht werden. Demnach wurden alle negativen und positiven Proben eindeutig interpretiert. F{\"u}r das hCG-β konnte ebenfalls eine Spezifit{\"a}t von 100\% und eine Sensitivit{\"a}t von 97\% erreicht werden. Die hCG-i Proben wurden mit einer Spezifit{\"a}t von 100\% und eine Sensitivit{\"a}t von 97,5\% gemessen. Um den Nachweis zu erbringen, dass dieser Versuchsaufbau {\"u}ber mehrere Wochen stabile Signale bei Vermessen von identischen Proben liefert, wurde ein {\"u}ber zw{\"o}lf Wochen angesetzter Stabilit{\"a}tstest f{\"u}r alle Parameter erfolgreich in Serum und Blut durchgef{\"u}hrt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erfolgreich eine Mehrkomponentenanalyse als Multiplex Ansatz auf einem Mikroarray entwickelt werden. Die Durchf{\"u}hrung der Performance-Analyse und des Stabilit{\"a}tstests zeigen bereits die m{\"o}gliche Einsatzf{\"a}higkeit dieses Tests im Kontext einer Dopinganalyse.}, language = {de} } @phdthesis{Buechner2014, author = {B{\"u}chner, Kerstin}, title = {Modifizierung und Charakterisierung von Wellenleitermaterialien f{\"u}r Biosensoranwendungen}, pages = {129}, year = {2014}, language = {de} } @phdthesis{Connor2016, author = {Connor, Daniel Oliver}, title = {Identifikation und Charakterisierung neuer immunogener Proteine und anschließende Generierung rekombinanter Antik{\"o}rper mittels Phage Display}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-104120}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {VII, 112, lv Seiten}, year = {2016}, abstract = {Seit der Einf{\"u}hrung von Antibiotika in die medizinische Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten existiert ein Wettlauf zwischen der Evolution von Bakterienresistenzen und der Entwicklung wirksamer Antibiotika. W{\"a}hrend bis in die 80er Jahre verst{\"a}rkt an neuen Antibiotika geforscht wurde, gewinnen multiresistente Keime heute zunehmend die Oberhand. Um einzelne Pathogene erfolgreich nachzuweisen und zu bek{\"a}mpfen, ist ein grundlegendes Wissen {\"u}ber den Erreger unumg{\"a}nglich. Bakterielle Proteine, die bei einer Infektion vorrangig vom Immunsystem prozessiert und pr{\"a}sentiert werden, k{\"o}nnten f{\"u}r die Entwicklung von Impfstoffen oder gezielten Therapeutika n{\"u}tzlich sein. Auch f{\"u}r die Diagnostik w{\"a}ren diese immundominanten Proteine interessant. Allerdings herrscht ein Mangel an Wissen {\"u}ber spezifische Antigene vieler pathogener Bakterien, die eine eindeutige Diagnostik eines einzelnen Erregers erlauben w{\"u}rden. Daher wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Humanpathogene mittels Phage Display untersucht: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Hierf{\"u}r wurden aus der genomischen DNA der vier Erreger Bibliotheken konstruiert und durch wiederholte Selektion und Amplifikation, dem sogenannten Panning, immunogene Proteine isoliert. F{\"u}r alle Erreger bis auf C. difficile wurden immunogene Proteine aus den jeweiligen Bibliotheken isoliert. Die identifizierten Proteine von N. meningitidis und B. burgdorferi waren gr{\"o}ßtenteils bekannt, konnten aber in dieser Arbeit durch Phage Display verifiziert werden. F{\"u}r N. gonorrhoeae wurden 21 potentiell immunogene Oligopeptide isoliert, von denen sechs Proteine als neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Charakter identifiziert wurden. Von den Phagen-pr{\"a}sentierten Oligopeptide der 21 immunogenen Proteine wurden Epitopmappings mit verschiedenen polyklonalen Antik{\"o}rpern durchgef{\"u}hrt, um immunogene Bereiche n{\"a}her zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei zehn Proteinen wurden lineare Epitope eindeutig mit drei polyklonalen Antik{\"o}rpern identifiziert, von f{\"u}nf weiteren Proteinen waren Epitope mit mindestens einem Antik{\"o}rper detektierbar. F{\"u}r eine weitere Charakterisierung der ermittelten Epitope wurden Alaninscans durchgef{\"u}hrt, die eine detaillierte Auskunft {\"u}ber kritische Aminos{\"a}uren f{\"u}r die Bindung des Antik{\"o}rpers an das Epitop geben. Ausgehend von dem neu identifizierten Protein mit immunogenem Charakter NGO1634 wurden 26 weitere Proteine aufgrund ihrer funktionellen {\"A}hnlichkeit ausgew{\"a}hlt und mithilfe bioinformatischer Analysen auf ihre Eignung zur Entwicklung einer diagnostischen Anwendung analysiert. Durch Ausschluss der meisten Proteine aufgrund ihrer Lokalisation, Membrantopologie oder unspezifischen Proteinsequenz wurden scFv-Antik{\"o}rper gegen acht Proteine mittels Phage Display generiert und anschließend als scFv-Fc-Fusionsantik{\"o}rper produziert und charakterisiert. Die hier identifizierten Proteine und linearen Epitope k{\"o}nnten einen Ansatzpunkt f{\"u}r die Entwicklung einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bieten. Lineare Epitopsequenzen werden h{\"a}ufig f{\"u}r die Impfstoffentwicklung eingesetzt, sodass vor allem die in dieser Arbeit bestimmten Epitope von Membranproteinen interessante Kandidaten f{\"u}r weitere Untersuchungen in diese Richtung sind. Durch weitere Untersuchungen k{\"o}nnten m{\"o}glicherweise unbekannte Virulenzfaktoren entdeckt werden, deren Inhibierung einen entscheidenden Einfluss auf Infektionen haben k{\"o}nnten.}, language = {de} } @phdthesis{Tanne2015, author = {Tanne, Johannes}, title = {Direkter Elektronentransfer und Bioelektrokatalyse H{\"a}m-haltiger Redoxproteine und -enzyme an geladenen MWCNT-Polyanilin- Hybriden in elektrochemischen Biosensoren}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {112}, year = {2015}, language = {de} } @phdthesis{Danckert2018, author = {Danckert, Lena}, title = {Immunscreening Virulenz-adaptierter Expressionsbibliotheken aus einem in vitro Infektionsmodell mit Salmonella Enteritidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421108}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {144}, year = {2018}, abstract = {Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere f{\"u}r Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei geh{\"o}ren Salmonella und Campylobacter zu den h{\"a}ufigsten Erregern, die verantwortlich f{\"u}r gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Pr{\"a}vention und Bek{\"a}mpfung von Salmonellen in Gefl{\"u}gelbest{\"a}nden und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen k{\"o}nnen {\"u}ber Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten k{\"o}nnen. Dabei sind bestehende Pr{\"a}ventionsstrategien f{\"u}r Gefl{\"u}gel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen {\"u}bertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Pr{\"a}vention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf f{\"u}r spezifische, sensitive und zuverl{\"a}ssige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gew{\"a}hrleisten. Durch ein wachsendes Verst{\"a}ndnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektions{\"a}hnliches in vitro Modell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r den Erreger durchgef{\"u}hrt. W{\"a}hrend einer Salmonellen-Infektion ist die erste zellul{\"a}re Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) f{\"u}r die Pathogen-Wirt-Studie ausgew{\"a}hlt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Ph{\"a}notyp f{\"u}r die intrazellul{\"a}ren Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Fl{\"u}ssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zus{\"a}tzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adh{\"a}sion und Transmembran-Transport zu gew{\"a}hrleisten. Letzterer ist charakteristisch f{\"u}r die intrazellul{\"a}re Limitierung von N{\"a}hrstoffen und pr{\"a}gt den infektionsrelevanten Status. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Ph{\"a}notyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und m{\"o}glicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellul{\"a}ren Bakterien m{\"u}ssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt f{\"u}r Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r S. Enteritidis durchgef{\"u}hrt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder erm{\"o}glichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifit{\"a}t oder Membranst{\"a}ndigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektions{\"a}hnlichen Modell durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde deutlich, dass die H{\"a}ufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verf{\"u}gbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu m{\"o}glichen Klonen, die w{\"a}hrend des Microarray-Screenings untersucht werden k{\"o}nnen, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektions{\"a}hnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben. Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant f{\"u}r das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene n{\"a}her untersucht, indem ihr Einfluss im infektions{\"a}hnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-St{\"a}mme analysiert wurde. Dabei wurde f{\"u}r eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der sp{\"a}ten intrazellul{\"a}ren Phase nachgewiesen. Weiterf{\"u}hrende in vitro Analysen sind f{\"u}r die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren. Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind f{\"u}r diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell l{\"a}sst sich ebenso f{\"u}r andere intrazellul{\"a}re Pathogene {\"u}bertragen und gew{\"a}hrleistet eine zuverl{\"a}ssige Identifizierung von potentiellen Antigenen.}, language = {de} } @phdthesis{Roeser2012, author = {R{\"o}ser, Claudia}, title = {Charakterisierung der Serotonin-Rezeptoren in den Speicheldr{\"u}sen von Calliphora vicina}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-61486}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Die F{\"a}higkeit, mit anderen Zellen zu kommunizieren, ist eine grundlegende Eigenschaft aller lebenden Zellen und essentiell f{\"u}r die normale Funktionsweise vielzelliger Organismen. Die Speicheldr{\"u}sen der Schmeißfliege Calliphora vicina bilden ein ausgezeichnetes physiologisches Modellsystem um zellul{\"a}re Signaltransduktionsprozesse an einem intakten Organ zu untersuchen. Die Speichelsekretion wird dabei hormonell durch das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) reguliert. 5-HT aktiviert in den sekretorischen Zellen der Dr{\"u}sen {\"u}ber die Bindung an mindestens zwei membranst{\"a}ndige G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zwei separate Signalwege, den IP3/Ca2+- und den cAMP-Signalweg. Zur Identifizierung und Charakterisierung der 5-HT-Rezeptoren in den Speicheldr{\"u}sen von Calliphora wurden unter Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien zwei cDNAs (Cv5-ht2α und Cv5-ht7) isoliert, die große {\"A}hnlichkeit zu 5-HT2- und 5-HT7-Rezeptoren aus S{\"a}ugetieren aufweisen. Die Hydropathieprofile der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenzen postulieren die f{\"u}r GPCRs charakteristische heptahelikale Architektur. Alle Aminos{\"a}uremotive, die f{\"u}r die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine essentiell sind, liegen konserviert vor. Interessanterweise wurde f{\"u}r den Cv5-HT7-Rezeptor eine zus{\"a}tzliche hydrophobe Dom{\"a}ne im N Terminus vorhergesagt. Die Cv5-HT2α-mRNA liegt in zwei alternativ gespleißten Varianten vor. Mittels RT-PCR-Experimenten konnte die Expression beider Rezeptoren in Gehirn und Speicheldr{\"u}sen adulter Fliegen nachgewiesen werden. Ein Antiserum gegen den Cv5-HT7 Rezeptor markiert in den Speicheldr{\"u}sen die basolaterale Plasmamembran. Die Expression der Rezeptoren in einem heterologen System (HEK 293-Zellen) best{\"a}tigte diese als funktionelle 5-HT Rezeptoren. So f{\"u}hrte die Stimulation mit Serotonin f{\"u}r den Cv5-HT2α zu einer dosis-abh{\"a}ngigen Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i, EC50 = 24 nM). In Cv5-HT7-exprimierenden Zellen l{\"o}ste 5-HT dosisabh{\"a}ngig (EC50 = 4,1 nM) einen Anstieg der intrazellul{\"a}ren cAMP Konzentration ([cAMP]i) aus. F{\"u}r beide heterolog exprimierten Rezeptoren wurden pharmakologische Profile erstellt. Liganden, die eine Rezeptorsubtyp-spezifische Wirkung vermuten ließen, wurden daraufhin auf ihre Wirkung auf das transepitheliale Potential (TEP) intakter Speicheldr{\"u}senpr{\"a}parate getestet. Drei 5-HT-Rezeptoragonisten: AS 19, R-(+)-Lisurid und 5-Carboxamidotryptamin f{\"u}hrten zu einer cAMP-abh{\"a}ngigen Positivierung des TEP durch eine selektive Aktivierung der 5 HT7-Rezeptoren. Eine selektive Aktivierung des Ca2+-Signalweges durch den Cv5-HT2 Rezeptor ist mit Hilfe von 5-Methoxytryptamin m{\"o}glich. Dagegen konnte Clozapin im TEP als selektiver Cv5-HT7-Rezeptorantagonist best{\"a}tigt werden. Die Kombination eines molekularen Ansatzes mit physiologischen Messungen erm{\"o}glichte somit die Identifikation selektiver Liganden f{\"u}r 5-HT2- bzw. 5-HT7-Rezeptoren aus Calliphora vicina. Dies erm{\"o}glicht zuk{\"u}nftig eine separate Aktivierung der 5-HT-gesteuerten Signalwege und erleichtert dadurch die weitere Erforschung der intrazellul{\"a}ren Signalwege und ihrer Wechselwirkungen.}, language = {de} } @phdthesis{Schumann2008, author = {Schumann, Silvia}, title = {Funktionelle Charakterisierung von prokaryotischen und eukaryotischen Molybdoflavoenzymen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-43427}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die Xanthin-Dehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches ein (αβ)₂ Heterotetramer mit einer Gr{\"o}ße von 275 kDa bildet. Die drei Kofaktoren (Moco, 2[2Fe2S], FAD) sind auf zwei unterschiedlichen Polypeptidketten gebunden. So sind die beiden spektroskopisch unterscheidbaren Eisen-Schwefel-Zentren und das FAD in der XdhA-Untereinheit und der Moco in der XdhB-Untereinheit gebunden. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum die R. capsulatus XDH ein Dimer bildet und ob ein intramolekularer Elektronentransfer existiert. Daf{\"u}r wurde eine chim{\"a}re XDH-Variante [(α)₂(β₁wt/β₂E730A)] erzeugt, welche eine aktive und eine inaktive XdhB-Untereinheit tr{\"a}gt. Mit Hilfe von Reduktionsspektren sowie mit der Bestimmung der kinetischen Parameter f{\"u}r die Substrate Xanthin und NAD+ konnte gezeigt werden, dass die chim{\"a}re XDH-Variante katalytisch halb so aktiv war, wie der auf gleiche Weise gereinigte XDH-Wildtyp. Dies verdeutlicht, dass die noch aktive Untereinheit der Chim{\"a}ren selbstst{\"a}ndig und unabh{\"a}ngig Substrat binden und hydroxylieren kann und ein intramolekularer Elektronentransfer zwischen den beiden XdhB-Untereinheiten nicht stattfindet. Ein weiteres Ziel war die funktionelle Charakterisierung der Mus musculus AOX1 sowie der humanen AOX1 hinsichtlich ihrer Substratspezifit{\"a}ten und ihrer biophysikalischen Eigenschaften sowie der Charakterisierung der konservierten Aminos{\"a}uren im aktiven Zentrum der mAOX1. Da bislang noch kein heterologes Expressionssystem f{\"u}r ein aktives und stabiles rekombinantes AO-Protein existierte, wurde ein E. coli Expressionssystem mit der gleichzeitigen Expression der entsprechenden Mocosulfurase f{\"u}r mAOX1 und hAOX1 in dieser Arbeit etabliert. Mit Hilfe dieser Koexpression konnte die Aktivit{\"a}t der rekombinanten mAOX1 um 50 \% gesteigert werden, wenn gleich auch der sulfurierte Moco-Anteil nur 20 \% betrug. Um die konservierten Aminos{\"a}uren im aktiven Zentrum hinsichtlich ihrer Funktion der Substratbindung zu charakterisieren, wurden folgende Varianten erzeugt: V806E, M884R, V806/M884R sowie E1265Q. Mit Hilfe von kinetischen Substratuntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die beiden Aminos{\"a}uren Val806 und Met884 f{\"u}r die Erkennung und die Stabilisierung von Aldehyden und N-Heterozyklen essentiell sind. Ein Austausch dieser beiden gegen Glutamat bzw. Arginin (wie bei R. capsulatus XDH) zeigte jedoch keine Xanthin- oder Hypoxanthinumsetzung. F{\"u}r das Glu1265 wurde ebenfalls die Rolle als die Katalyse initiierende Aminos{\"a}ure belegt.}, language = {de} } @phdthesis{Scherling2009, author = {Scherling, Christian}, title = {Environmental Metabolomics - Metabolomische Studien zu Biodiversit{\"a}t, ph{\"a}notypischer Plastizit{\"a}t und biotischen Wechselwirkungen von Pflanzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-32411}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {Ein genereller Ansatz zur Charakterisierung von biologischen Systemen bietet die Untersuchung des Metaboloms, dessen Analyse als „Metabolomics" bezeichnet wird. "Omics"- Technologien haben das Ziel, ohne Selektionskriterien m{\"o}glichst alle Bestandteile einer biologischen Probe zu detektieren (identifizieren und quantifizieren), um daraus R{\"u}ckschl{\"u}sse auf nicht vorhersehbare und somit neuartige Korrelationen in biologischen Systemen zu ziehen. Ein zentrales Dogma in der Biologie besteht in der Kausalit{\"a}t zwischen Gen - Enzym - Metabolite. Perturbationen auf einer Ebene rufen systemische Antworten hervor, die in einem ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp m{\"u}nden k{\"o}nnen. Metabolite sind die Endprodukte von zellul{\"a}ren regulatorischen Prozessen, deren Abundanz durch die Resonanz auf genetische Modifikationen oder Umwelteinfl{\"u}sse zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Zudem repr{\"a}sentieren Metabolite ultimativ den Ph{\"a}notyp eines Organismus und haben die F{\"a}higkeit als Biomarker zu fungieren. Die integrale Analyse verschiedenster Stoffwechselwegen wie Krebszyklus, Pentosephosphatzyklus oder Calvinzyklus offeriert die Identifikation von metabolischen Mustern. In dieser Arbeit wurden sowohl das targeted Profiling via GC-TOF-MS als auch das untargeted Profiling via GC-TOF-MS und LC-FT-MS als analytische Strategien genutzt, um biologische Systeme anhand ihrer Metabolite zu charakterisieren und um physiologische Muster als Resonanz auf endogene oder exogene Stimuli zu erkennen. Dabei standen die metabolische, ph{\"a}notypische und genotypische Plastizit{\"a}t von Pflanzen im Fokus der Untersuchungen. Metabolische Varianzen eines Ph{\"a}notyps reflektieren die genotyp-abh{\"a}ngige Resonanz des Organismus auf umweltbedingte Parameter (abiotischer und biotischer Stress, Entwicklung) und k{\"o}nnen mit sensitiven Metabolite Profiling Methoden determiniert werden. Diese Anwendungen haben unter anderem auch zum Begriff des „Environmental Metabolomics" gef{\"u}hrt. In Kapitel 2 wurde der Einfluss biotischer Interaktionen von endophytischen Bakterien auf den Metabolismus von Pappelklonen untersucht; Kapitel 3 betrachtet die metabolische Plastizit{\"a}t von Pflanzen im Freiland auf ver{\"a}nderte biotische Interaktionsmuster (Konkurrenz/Diversit{\"a}t/Artenzusammensetzung); Abschließend wurde in Kapitel 4 der Einfluss von spezifischen genetischen Modifikationen an Peroxisomen und den daraus resultierenden ver{\"a}nderten metabolischen Fluss der Photorespiration dargestellt. Aufgrund der sensitiven Analyse- Technik konnten metabolische Ph{\"a}notypen, die nicht zwingend in einen morphologischen Ph{\"a}notyp m{\"u}ndeten, in drei biologischen Systemen identifiziert und in einen stoffwechselphysiologischen Kontext gestellt werden. Die drei untersuchten biologischen Systeme - in vitro- Pappeln, Gr{\"u}nland- Arten (Arrhenatherion-Gesellschaft) und der Modellorganismus (Arabidopsis) - belegten anschaulich die Plastizit{\"a}t des Metabolismus der Arten, welche durch endogene oder exogene Faktoren erzeugt wurden.}, language = {de} } @phdthesis{Pfluger2007, author = {Pfluger, Paul Thomas}, title = {Der Metabolismus der Tocopherole und Tocotrienole}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-16011}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2007}, abstract = {Vitamin E ist der {\"U}berbegriff f{\"u}r 4 Tocopherole (α, β, γ und δ) sowie 4 Tocotrienole (α, β, γ und δ), die als gemeinsames Merkmal ein Chromanolringsystem sowie eine ges{\"a}ttigte (Tocopherole) bzw. unges{\"a}ttigte (Tocotrienole) Seitenkette aufweisen. Neben ihrer antioxidativen Wirkung (Schutz von Membranen vor Lipidperoxidaton) konnten f{\"u}r einige Vitamin E - Formen auch eine Reihe von hochspezifischen, nicht-antioxidativen Wirkungen in vitro nachgewiesen werden. Meist bleibt jedoch unklar, ob ein solcher Effekt auch in vivo, also im Tiermodel oder direkt im Menschen, gefunden werden kann. In erster Linie m{\"u}sste hierbei gekl{\"a}rt werden, ob die jeweilige Vitamin E - Form auch bioverf{\"u}gbar, also in f{\"u}r eine Wirkung ausreichender Konzentration im Organismus vorhanden ist, oder aber vorher eliminiert und ausgeschieden wird. In dieser Doktorarbeit wurden deshalb wichtige Grundlagen zum Abbau der Tocopherole und Tocotrienole erarbeitet. • In HepG2-Zellen konnte der Abbau der Tocotrienole mit Hilfe fl{\"u}ssig- sowie gaschromatographischer Analysemethoden vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt werden. Wie sich hierbei ergab, verl{\"a}uft der Abbau weitgehend in Analogie zum Abbau der Tocopherole {\"u}ber eine durch Cytochrom P450 katalysierte initiale ω-Hydroxylierung mit 5 nachfolgenden β-Oxidationsschritten. • In vitro konnten in HepG2 - Zellen die Abbauraten der verschiedenen Vitamin E - Formen bestimmt werden. Dies nahmen in folgender Reihenfolge zu: α-Tocopherol < γ-Tocopherol < α-Tocotrienol < γ-Tocotrienol. • Wie sich mit Hilfe eines mit Cytochrom P450 hochangereicherten Homogenats aus Rattenlebern ergab, stellt die initiale ω-Hydroxylierung einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Abbaus dar: α-Tocopherol wurde weit langsamer hydroxyliert als alle anderen Vitamin E - Formen. • Der unterschiedliche Abbau von α-Tocopherol und γ-Tocotrienol konnte auch im M{\"a}useversuch in vivo best{\"a}tigt werden. Nach F{\"u}tterung von M{\"a}usen mit α-Tocopherol wurden nur geringe Mengen von α-Tocopherolmetaboliten im Urin der M{\"a}use gefunden, w{\"a}hrend nach Applikation von γ-Tocotrienol hohe Konzentrationen der γ-Tocotrienolmetabolite nachgewiesen wurden. In Plasma und Leber wiederum wurden (dem Futtergehalt entsprechende) hohe α-Tocopherolkonzentrationen entdeckt, w{\"a}hrend γ-Tocotrienol selbst nach hoher Gabe nicht oder nur in Spuren nachweisbar war. In HepG2 - Zellen konnte gezeigt werden, dass γ-Tocotrienol eine cytotoxische Wirkung auf die Hepatocarcinoma-Zelllinie HepG2 entfalten kann, indem durch die Aktivierung der proteolytischen Caspase 3 die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) ausgel{\"o}st wird. Abschliessend l{\"a}sst sich festhalten, dass der K{\"o}rper lediglich das nat{\"u}rliche α-Tocopherol vor dem Abbau bewahrt, die anderen Vitamin E - Formen jedoch als Fremdstoffe behandelt und rapide ausscheidet. Als doppelter Schutz vor Verlust des "wertvollen" α-Tocopherol dienen hierbei das α-Tocopherol Transfer Protein sowie die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede im ersten Schritt des Abbaus, der Cytochrom P450 - katalysierten ω-Hydroxylierung. Beides erkl{\"a}rt die bevorzugte Retention von α-Tocopherol im Organsimus und seine hohe Bioaktivit{\"a}t. Will man deshalb in vitro Ergebnisse anderer Vitamin E - Formen auf die in vivo Situation {\"u}bertragen, muss man die geringe Bioverf{\"u}gbarkeit dieser Substanzen ber{\"u}cksichtigen.}, language = {de} } @phdthesis{Urban2008, author = {Urban, Alexander}, title = {Charakterisierung der Funktion der Rhodanese YnjE f{\"u}r die Molybd{\"a}nkofaktor Biosynthese in Escherichia coli}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-29018}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die ubiquit{\"a}r verbreitete Molybd{\"a}nkofaktorbiosynthese ist in Escherichia coli (E. coli) bisher am umfassendsten untersucht. Bislang war jedoch nicht bekannt, welche physiologische Schwefelquelle im zweiten Schritt dieses Syntheseweges zur Bildung der charakteristischen Dithiolengruppe genutzt wird. Erste Untersuchungen deuteten auf eine der Cysteindesulfurasen E. colis hin, welche in Verbindung mit einem rhodanese{\"a}hnlichen Protein den Schwefel in Form eines Persulfids {\"u}bertragen. {\"A}hnliche Mechanismen wurden bereits in der humanen Moco-Biosynthese und der Thiaminbiosynthese identifiziert. In dieser Arbeit wurde das E. coli Protein YnjE n{\"a}her charakterisiert. Es handelt sich bei YnjE um ein rhodanese{\"a}hnliches Protein aus drei Rhodanesedom{\"a}nen. Durch Proteinkristallisation und anschliessender R{\"o}ntgenstrukturanalyse wurde die Terti{\"a}rstruktur des YnjE-Proteins analysiert. Die hergestellten Kristalle konnten zur Gewinnung von Strukturdaten vermessen und eine Proteinkristallstruktur f{\"u}r YnjE berechnet werden. Desweiteren besitzt YnjE ein N-terminales Typ I Sekretionssystem abh{\"a}ngiges Sipnalpeptid. Durch Lokalisieungsexperimente wurde die Bedeutung des Signalpeptids f{\"u}r das YnjE-Protein untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass endogenes YnjE sowohl im peri- als auch im cytoplasmatischen Raum lokalisiert ist. Auf Grund von vorhergehenden Studien, wurde eine Funktion des YnjE-Proteins innerhalb der Molybd{\"a}nkofaktorbiosynthese in der Schwefel{\"u}bertragung auf das Protein MoaD in E. coli vermutet und deshalb in dieser Arbeit n{\"a}her untersucht. Es wurde eine Interaktion des YnjE-Proteins mit dem MoeB-Protein, welches f{\"u}r die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins essentiell ist, durch Tandem-Affinit{\"a}tsreinigung und Antik{\"o}rper-basierte Affinit{\"a}tsreinigung nachgewiesen und ein signifikanter positiver Einfluss YnjEs auf die Bildung von Molybdopterin, einer Vorstufe des Molybd{\"a}nkofaktors, best{\"a}tigt. Dabei wurde sowohl der Sulfurierungsgrad des MoaD-Proteins in YnjE und Cysteindesulfurase-knock-out Mutanten untersucht, als auch die Bildung von Molybdopterin in einem in vitro Ansatz in Abh{\"a}ngigkeit von steigenden YnjE-Konzentrationen analysiert. Im Ergebnis kann man daraus schließen, dass der Mechanismus der Schwefel{\"u}bertragung {\"a}hnlich der Thiaminbiosynthese, {\"u}ber eine der drei Cysteindesulfurasen CsdA, SufS oder IscS geschieht, welche Schwefel in Form eines Persulfids auf YnjE {\"u}bertragen k{\"o}nnen. Thiosulfat und Mercaptopyruvat, die Substrate f{\"u}r die beiden Familien der rhodanese{\"a}hnlichen Proteine, Thiosulfat-Sulfurtransferasen und Mercaptopyruvat-Sulfurtransferasen, dienen nicht als Substrate f{\"u}r eine Persulfurierung YnjEs. Durch eine Austauschmutante des Cysteinrestes der aktiven Schleife von YnjE konnte nicht best{\"a}tigt werden, dass dieser Aminos{\"a}urerest und damit die Bildung eines YnjE-gebundenen Persulfids f{\"u}r die positive Beeinflussung der MPT-Synthese essentiell ist. Vielmehr kann durch diese Arbeit von einer Vermittlung der Interaktionen zwischen MoeB, IscS und der MPT-Synthase durch YnjE ausgegangen werden wobei die Cysteindesulfurase IscS den Schwefel f{\"u}r die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins liefert.}, language = {de} } @phdthesis{Leicht2008, author = {Leicht, Katja}, title = {Positionelle Klonierung von Tbc1d1 als Kandidatengen f{\"u}r Adipositas}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-34610}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Nob1 (New Zealand obese 1) bezeichnet einen Adipositas-QTL auf Chr. 5 der Maus (LODBMI >3,3), der in einem R{\"u}ckkreuzungsexperiment der Mausst{\"a}mme NZO (adip{\"o}s) und SJL (schlank) identifiziert wurde. Um Kandidatengene f{\"u}r Adipositas zu finden, wurden mehr als 300 Nob1-Transkripte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen auf Unterschiede in stoffwechselrelevanten Geweben zwischen beiden Mausst{\"a}mmen untersucht. Sieben Gene zeigten eine differentielle Expression: 2310045A20Rik, Tbc1d1, Ppp1cb, Mll5, Insig1, Abhd1 und Alox5ap. Die codierenden Bereiche dieser Gene wurden anschließend auf Sequenzunterschiede zwischen NZO und SJL untersucht. Nur im Gen Tbc1d1, das im Peak-Bereich des Nob1 lokalisiert ist, wurde eine SJL-spezifische Deletion von sieben Basen detektiert, die zu einer Leserasterverschiebung und einem vorzeitigen Abbruch des Proteins in der funktionellen Rab-GAP-Dom{\"a}ne f{\"u}hrt (Loss-of-Function-Mutation). Interessanterweise wurde eine Variante von TBC1D1 (R125W) in Kopplungsanalysen mit Adipositas beim Menschen assoziiert (Stone et al., 2006). TBC1D1 zeigt eine hohe Homologie zu TBC1D4 (AS160), das im Insulinsignalweg eine wichtige Rolle spielt. In 17 weiteren Genen im Peak-Bereich des Nob1 wurde keine weitere SJL-spezifischen Mutation detektiert. Bei NZO-Tieren erfolgte die Tbc1d1-mRNA-Expression vorwiegend in glycolytischen Fasern des Skelettmuskels. Zudem wurden zwei gewebsspezifisch exprimierte Tbc1d1-Isoformen identifiziert, die sich durch alternatives Splicen der Exone 12 und 13 unterscheiden. Die im Rahmen dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse machen Tbc1d1 zu einem plausiblen Kandidatengen f{\"u}r den Nob1-QTL. Welche Funktion Tbc1d1 im Glucose- und Fettstoffwechsel des Skelettmuskels hat, muss in weiteren Analysen untersucht werden.}, language = {de} } @phdthesis{Witt2009, author = {Witt, Sandra}, title = {Die Rolle der DGDG Synthase DGD1 bei der Galaktolipid Synthese in den H{\"u}llmembranen von Chloroplasten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-33447}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {In den Chloroplasten von h{\"o}heren Pflanzen sind die Galaktolipide Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG) und Digalaktosyldiacylglycerol (DGDG) die am weitesten verbreiteten Lipide. In dieser Forschungsarbeit wurde die Funktion der DGDG Synthase DGD1, und insbesondere die Funktion des N-terminalen Bereichs dieses Enzyms in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht. Die {\"U}berexpression des N-terminalen Bereichs von DGD1 in WT-Col2 resultierte in einem reduzierten Wachstum, welches sich jedoch von der dgd1-1 Mutante unterschied. Dies legte bereits nahe, dass die Expression von N-DGD1 einen negativen Einfluss auf das Wachstum hat. Durch Studien in einem heterologen E.coli Expressionssystem konnte diese These best{\"a}tigt werden. Zellen, die ausschließlich N-DGD1 zusammen mit einer MGD Synthase aus Gurke exprimierten, waren im Wachstum stark beeintr{\"a}chtigt. Nicht nur der N-terminale Bereich von DGD1, auch der N-terminale Bereich von MGD1 besitzt eine Funktion als Transitpeptid und ist somit ein wichtiger Faktor zur korrekten Lokalisierung des MGD1 Proteins. In dieser Arbeit ist es gelungen, ein Fusionskonstrukt aus N-MGD1 und DGD2 in die dgd1-1 Mutante zu transferieren und damit das reduzierte Wachstum zu komplementieren. Fr{\"u}here Versuche, ein reduziertes dgd1-1 Wachstum mit DGD2 allein zu komplementieren, scheiterten. Somit gibt dies einen Hinweis darauf, dass N-MGD1 als Transitpeptid fungieren kann. Bindungsstudien zur Interaktion von DGD1 und N-DGD1 Protein zeigten, dass die polaren Lipide MGDG und DGDG in Wechselwirkung mit dem N-terminalen Bereich von DGD1 treten. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht erforscht, wie der Transport von DGDG und MGDG zwischen den H{\"u}llmembranen des Chloroplasten erfolgt. Die in dieser Arbeit angefertigen Bindungsstudien konnten Hinweise darauf geben, dass N-DGD1 als eine Art „Antiporter" fungiert, um MGDG und DGDG zwischen den H{\"u}llmembranen zu transportieren. Weiterhin wurden Bindungsstudien zur Erforschung von Interaktionen der Glykosyltransferasen DGD1, DGD2, MGD1, MGD2 und MGD3 angefertigt. Dabei wurden Wechselwirkungen zwischen den Glykosyltransferasen DGD1, DGD2 und MGD2 detektiert. Interessant ist, dass Hinweise auf eine Dimerbildung bestimmter Enzyme gefunden wurden, so f{\"u}r DGD1 und MGD2. Ein weiterer Ansatz zur Erforschung von Wechselwirkungen von DGD1 Protein mit bis jetzt unbekannten Proteinen war die Expression von DGD1-StrepIITag und DGD1-CTAPTag Fusionsproteinen in dgd1-1 Mutanten. Es wurden f{\"u}r beide Tags transgene Linien generiert, die im Wachstum komplementiert waren und wildtyp{\"a}hnliche Mengen an DGDG akkumulierten. Die Expression der verschiedenen Tags in den Pflanzen war sehr unterschiedlich, wobei der DGD1-CTAP-Tag am st{\"a}rksten exprimiert war. Mit Pflanzenmaterial dieser Linien kann nun eine Aufreinigung des getaggten Proteins und eventueller Interaktionspartner erfolgen.}, language = {de} } @phdthesis{Maier2016, author = {Maier, Natalia}, title = {Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von Ethylglucuronid (EtG) in Haaren}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {IX, 122}, year = {2016}, language = {de} } @phdthesis{Ramm2022, author = {Ramm, Timo}, title = {Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antik{\"o}rper-Charakterisierung und Validierung}, doi = {10.25932/publishup-56153}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XIV, 138}, year = {2022}, abstract = {Antik{\"o}rper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antik{\"o}rpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegen{\"u}ber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abh{\"a}ngigkeit des Einsatzes, der Antik{\"o}rper, f{\"u}r den gew{\"u}nschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu k{\"o}nnen. Daf{\"u}r wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antik{\"o}rper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminos{\"a}uren auf die Bindung des Antik{\"o}rpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antik{\"o}rperbindungsverhalten in Abh{\"a}ngigkeit der Aminos{\"a}ure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antik{\"o}rpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antik{\"o}rper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antik{\"o}rper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Daf{\"u}r wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden k{\"o}nnen. F{\"u}r die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor s{\"a}mtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antik{\"o}rpern sowie ihre Validierung f{\"u}r verschiedene Testsysteme.}, language = {de} } @phdthesis{Korn2012, author = {Korn, Ulrike}, title = {Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und Fusarium graminearum-Isolate auf die Schadbildauspr{\"a}gung bei Winterweizen sowie die M{\"o}glichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-62908}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und F. graminearum-Isolate auf die Schadbildauspr{\"a}gung bei Winterweizen sowie die M{\"o}glichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza Die durch Pilzarten der Gattung Fusarium spp. hervorgerufene partielle Taub{\"a}hrigkeit ist ein ernstes Problem im weltweiten Weizenanbau. Eine f{\"u}r die Schaderreger g{\"u}nstige feuchte Witterung zum Zeitpunkt der Weizenbl{\"u}te in Kombination mit befallsf{\"o}rdernden agrotechnischen Maßnahmen l{\"o}st immer wieder Epidemien aus. Haupts{\"a}chlich verursacht durch F. culmorum und F. graminearum f{\"u}hrt eine Erkrankung zu Ertrags- und Qualit{\"a}tseinbußen sowie zu einer Belastung des Ernteguts mit Mykotoxinen, die bereits in niedrigen Konzentrationen toxisch auf den tierischen und menschlichen Organismus wirken. Die am h{\"a}ufigsten vorkommenden Fusarium-Toxine in Weizen sind Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZEA). Isolate von F. graminearum- und F. culmorum k{\"o}nnen in ihrem DON- und ZEA-Bildungsverm{\"o}gen und ihrem Potential, Nekrosen zu verursachen, stark variieren. In Laborversuchen (in vitro) wurden F. graminearum- und F. culmorum-Isolate hinsichtlich dieser Eigenschaften (hier als Aggressivit{\"a}t bezeichnet) charakterisiert und anschließend wurde im Feldversuch {\"u}berpr{\"u}ft, ob die in vitro-ermittelte Aggressivit{\"a}t die Schadbildauspr{\"a}gung bei Weizenpflanzen beeinflusst. Nur im ersten Versuchsjahr, das durch hohe Niederschl{\"a}ge gekennzeichnet war, konnte ein Einfluss der Aggressivit{\"a}t und einer zus{\"a}tzlichen Beregnung im Feldversuch nachgewiesen werden. Die als hoch-aggressiv eingestuften Fusarium-Isolate reduzierten unter dem Einfluss der Beregnung den Ertrag und das Tausendkorngewicht. Die Beregnung f{\"u}hrte zu einer Erh{\"o}hung des Pilzwachstums und der DON- und ZEA-Produktion. Ein extrem trockener Sommer verhinderte die Infektion der Weizenpflanzen durch die beimpften Fusarium-Isolate und ein anschließendes Pilzwachstum in den {\"A}hren im zweiten Versuchsjahr. Um den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. vorzubeugen, stehen verschiedene pflanzenbauliche Maßnahmen zur Verf{\"u}gung. Eine M{\"o}glichkeit stellen in diesem Zusammenhang die symbiotischen Mykorrhizapilze (MP) dar. Die Pilze sind in der Lage, Pflanzen zu st{\"a}rken und antagonistisch auf pilzliche Schaderreger zu wirken. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob MP dazu beitragen k{\"o}nnten, den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. niedrig zu halten, wurden Weizenpflanzen mit MP und Fusarium spp. beimpft und die Auswirkungen der Interaktionen auf die Weizenpflanzen in einem Klimakammer- und einem Feldversuch getestet. In der Klimakammer wurde eine Reduzierung des Fusarium-Befalls nachgewiesen. Die mykorrhizierten Weizenpflanzen wiesen außerdem h{\"o}here Photosyntheseraten, h{\"o}here Sprosstrockenmassen und mehr {\"A}hren im Vergleich zu den nicht-mykorrhizierten und mit Fusarium-beimpften Weizenpflanzen auf. Insgesamt wurde durch die Mykorrhizierung der negative Einfluss von Fusarium spp. kompensiert. Im Freiland konnte kein Einfluss der MP auf Fusarium spp. beobachtet werden. Im ersten Versuchsjahr f{\"u}hrte das Beimpfen der Weizenpflanzen mit MP zu h{\"o}heren Wurzel- und Sprosstrockenmassen sowie zu h{\"o}heren Tausendkorngewichten im Vergleich zu den mit Fusarium spp.-beimpften Weizenpflanzen. Im zweiten Versuchsjahr konnte dieses Ergebnis nicht wiederholt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Hammer2012, author = {Hammer, Paul}, title = {Transkriptomweite Untersuchungen von Prostata-Krebszelllinien im Kontext medizinischer Strahlentherapie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-63190}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die st{\"a}rkste Waffe f{\"u}r die Bek{\"a}mpfung b{\"o}sartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweith{\"a}ufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die h{\"a}ufigste, m{\"a}nnliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzf{\"a}higkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen n{\"a}her beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell {\"u}ber das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, gr{\"o}ßtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre {\"U}berlebensf{\"a}higkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalit{\"a}tstest gepr{\"u}ft. Die proliferative Kapazit{\"a}t wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die gr{\"o}ßten Differenzen bez{\"u}glich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgew{\"a}hlt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker f{\"u}r die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu erm{\"o}glichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgef{\"u}hrt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu k{\"o}nnen. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 st{\"a}rker in der PC3 und 425 st{\"a}rker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivit{\"a}t (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auff{\"a}llig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verst{\"a}ndnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile {\"u}ber 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. W{\"a}hrend es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserh{\"o}hungen, die eine Aktivierung sch{\"u}tzender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, ausl{\"o}sen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsver{\"a}nderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten ver{\"a}ndert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressions{\"a}nderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellul{\"a}ren Antwort eine tragende Rolle. {\"A}ußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivit{\"a}ten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und sch{\"u}tzenden Einfluss auf das Zell{\"u}berleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese sch{\"u}tzenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell f{\"u}r das Zell{\"u}berleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm.}, language = {de} } @phdthesis{Lerm2012, author = {Lerm, Stephanie}, title = {Mikroorganismen in geothermischen Aquiferen : Einfluss mikrobieller Prozesse auf den Anlagenbetrieb}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-63705}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {In Fluid-, Filter- und Sedimentproben von vier geothermischen Anlagen des Norddeutschen Beckens wurden mit molekulargenetischen Verfahren unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften nachgewiesen. Die mikrobielle Zusammensetzung in den Prozessw{\"a}ssern wurde dabei durch die Aquiferteufe, die Salinit{\"a}t, die Temperatur und den verf{\"u}gbaren Elektronendonatoren und -akzeptoren beeinflusst. Die in den anoxischen Prozessw{\"a}ssern identifizierten Organismen zeichneten sich durch einen chemoheterotrophen oder chemoautotrophen Stoffwechsel aus, wobei Nitrat, Sulfat, Eisen (III) oder Bikarbonat als terminale Elektronenakzeptoren fungierten. Mikroorganismen beeinflussten den Betrieb von zwei Anlagen negativ. So reduzierten im Prozesswasser des K{\"a}ltespeichers am Berliner Reichstag vorhandene Eisenoxidierer, nahe verwandt zu der Gattung Gallionella, die Injektivit{\"a}t der Bohrungen durch Eisenhydroxidausf{\"a}llungen in den Filterschlitzen. Biofilme, die von schwefeloxidierenden Bakterien der Gattung Thiothrix in den Filtern der obert{\"a}gigen Anlage gebildet wurden, f{\"u}hrten ebenfalls zu Betriebsst{\"o}rungen, indem sie die Injektion des Fluids in den Aquifer behinderten. Beim W{\"a}rmespeicher in Neubrandenburg waren Sulfatreduzierer vermutlich an der Bildung von Eisensulfidausf{\"a}llungen in den obert{\"a}gigen Filtern und im bohrlochnahen Bereich beteiligt und verst{\"a}rkten Korrosionsprozesse an der Pumpe im Bohrloch der kalten Aquiferseite. Organische S{\"a}uren in den Fluiden sowie mineralische Ausf{\"a}llungen in den Filtern der obert{\"a}gigen Anlagen waren Belege f{\"u}r die Aktivit{\"a}t der in den verschiedenen Anlagen vorhandenen Mikroorganismen. Es wurde zudem deutlich, dass Mikroorganismen auf Grund der hohen Durchflussraten in den Anlagen chemische Ver{\"a}nderungen in den Prozessw{\"a}ssern deutlich sensitiver anzeigen als chemische Analyseverfahren. So deuteten {\"A}nderungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Bioz{\"o}nosen und speziell die Identifikation von Indikatororganismen wie Eisen- und Schwefeloxidierern, fermentativen Bakterien und Sulfatreduzierern auf eine erh{\"o}hte Verf{\"u}gbarkeit von Elektronendonatoren oder akzeptoren in den Prozessw{\"a}ssern hin. Die Ursachen f{\"u}r die an den Geothermieanlagen auftretenden Betriebsst{\"o}rungen konnten dadurch erkannt werden.}, language = {de} } @phdthesis{Reinert2012, author = {Reinert, Armin}, title = {Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von f{\"u}r die arbuskul{\"a}re Mykorrhizasymbiose spezifischen Genen in Medicago truncatula}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-63805}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Die Mykorrhiza (griechisch: m{\´y}kēs f{\"u}r „Pilz"; rhiza f{\"u}r „Wurzel") stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit N{\"a}hrstoffen, w{\"a}hrend die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskul{\"a}re Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei w{\"a}hrend der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des prim{\"a}ren N{\"a}hrstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgef{\"u}hrt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivit{\"a}t der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der gr{\"o}ßten Promotoraktivit{\"a}t waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am st{\"a}rksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zus{\"a}tzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde f{\"u}r drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivit{\"a}ts- studie durchgef{\"u}hrt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, w{\"a}hrend die Aktivit{\"a}t des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. F{\"u}r zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgef{\"u}hrt. Dabei stellte sich in beiden F{\"a}llen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT k{\"o}nnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt m{\"u}sste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch f{\"u}r arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN k{\"o}nnten ebenfalls aufschlussreich f{\"u}r das weitere Verst{\"a}ndnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen.}, language = {de} } @phdthesis{Schwuchow2019, author = {Schwuchow, Viola}, title = {Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd-Oxidoreduktase (PaoABC) aus Escherichia coli}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {119}, year = {2019}, abstract = {Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Analysen zur Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd Oxidoreduktase aus E. coli. Kinetische Untersuchungen mit Ferricyanid als Elektronenakzeptor unter anaeroben Bedingungen zeigten f{\"u}r dieses Enzym eine h{\"o}here Aktivit{\"a}t als unter aeroben Bedingungen. Die getroffene Hypothese, dass PaoABC f{\"a}hig ist Elektronen an molekularen Sauerstoff weiter zu geben, konnte best{\"a}tigt werden. F{\"u}r den Umsatz aromatischer Aldehyde mit molekularem Sauerstoff wurde ein Optimum von pH 6,0 ermittelt. Dies steht im Gegensatz zur Reaktion mit Ferricyanid, mit welchem ein pH-Optimum von 4,0 gezeigt wurde. Die Reaktion von PaoABC mit molekularem Sauerstoff generiert zwar Wasserstoffperoxid, die Produktion von Superoxid konnte dagegen nicht beobachtet werden. Dass aerobe Bedingungen einen Einfluss auf das Ausl{\"o}sen der Expression von PaoABC haben, wurde in dieser Arbeit ebenfalls ermittelt. Im Zusammenhang mit der Produktion von ROS durch PaoABC wurde die Funktion eines k{\"u}rzlich in Elektronentransfer-Distanz zum FAD identifizierten [4Fe4S]-Clusters untersucht. Ein Austausch der f{\"u}r die Bindung des Clusters zust{\"a}ndigen Cysteine f{\"u}hrte zur Instabilit{\"a}t der Proteinvarianten, weswegen f{\"u}r diese keine weiteren Untersuchungen erfolgten. Daher wird zumindest ein struktur-stabilisierender Einfluss des [4Fe4S]-Clusters angenommen. Zur weiteren Untersuchung der Funktion dieses Clusters, wurde ein zwischen FAD und [4Fe4S]-Cluster lokalisiertes Arginin gegen ein Alanin ausgetauscht. Diese Proteinvariante zeigte eine reduzierte Geschwindigkeit der Reaktion gegen{\"u}ber dem Wildtyp. Die Bildung von Superoxid konnte auch hier nicht beobachtet werden. Die Vermutung, dass dieser Cluster einen elektronen-sammelnden Mechanismus unterst{\"u}tzt, welcher die Radikalbildung verhindert, kann trotz allem nicht ausgeschlossen werden. Da im Umkreis des Arginins weitere geladene und aromatische Aminos{\"a}uren lokalisiert sind, k{\"o}nnen diese den notwendigen Elektronentransfer {\"u}bernehmen. Neben der Ermittlung eines physiologischen Elektronenakzeptors und dessen Einfluss auf die Expression von PaoABC zeigt diese Arbeit auch, dass die Chaperone PaoD und MocA w{\"a}hrend der Reifung des MCD-Kofaktor eine gemeinsame Bindung an PaoABC realisieren. Es konnte im aktiven Zentrum von PaoABC ein Arginin beschrieben werden, welches auf Grund der engen Nachbarschaft zum MCD-Kofaktor und zum Glutamat (PaoABC-EC692) am Prozess der Substratbindung beteiligt ist. Im Zusammenhang mit dem Austausch dieses Arginins gegen ein Histidin oder ein Lysin wurden die Enzymspezifit{\"a}t und der Einfluss physiologischer Bedingungen, wie pH und Ionenst{\"a}rke, auf die Reaktion des Enzyms untersucht. Gegen{\"u}ber dem Wildtyp zeigten die Varianten mit molekularem Sauerstoff eine geringere Affinit{\"a}t zum Substrat aber auch eine h{\"o}here Geschwindigkeit der Reaktion. Vor allem f{\"u}r die Histidin-Variante konnte im gesamten pH-Bereich ein instabiles Verhalten bestimmt werden. Der Grund daf{\"u}r wurde durch das L{\"o}sen der Struktur der Histidin-Variante beschreiben. Durch den Austausch der Aminos{\"a}uren entf{\"a}llt die stabilisierende Wirkung der delokalisierten Elektronen des Arginins und es kommt zu einer Konformations{\"a}nderung im aktiven Zentrum. Neben der Reaktion von PaoABC mit einer Vielzahl aromatischer Aldehyde konnte auch der Umsatz von Salicylaldehyd zu Salicyls{\"a}ure durch PaoABC in einer Farbreaktion bestimmt werden. Durch Ausschluss von molekularem Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor, in einer enzym-gekoppelten Reaktion, erfolgte ein Elektronentransport auf Ferrocencarboxyls{\"a}ure. Die Kombination aus beiden Methoden erm{\"o}glichte eine Verwendung von Ferrocen-Derivaten zur Generierung einer enzym-gekoppelten Reaktion mit PaoABC. Die Untersuchungen zu PaoABC zeigen, dass die Vielfalt der durch das Enzym katalysierten Rektionen weitere M{\"o}glichkeiten der enzymatischen Bestimmung biokatalytischer Prozesse bietet.}, language = {de} } @phdthesis{Hiller2015, author = {Hiller, Franziska}, title = {Effekte des Selenstatus und des Selenoproteins Glutathionperoxidase 2 auf die experimentelle Colitis in M{\"a}usen}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {99}, year = {2015}, language = {de} } @phdthesis{Huebner2014, author = {H{\"u}bner, Sandra}, title = {Molekulare Grundlagen der Bittergeschmackswahrnehmung in der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77720}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {X, 171, iii}, year = {2014}, abstract = {Der Bittergeschmack dient S{\"a}ugern vermutlich zur Wahrnehmung und Vermeidung toxischer Substanzen. Bitterstoffe k{\"o}nnen jedoch auch gesund sein oder werden oft bereitwillig mit der Nahrung aufgenommen. Ob sie geschmacklich unterschieden werden k{\"o}nnen, ist allerdings umstritten. Detektiert werden Bitterstoffe von oralen Bittergeschmacksrezeptoren, den TAS2R (human) bzw. Tas2r (murin). In der Literatur gibt es aber immer mehr Hinweise darauf, dass {\"u}berdies Tas2r nicht nur in extragustatorischen Organen exprimiert werden, sondern dort auch wichtige Aufgaben erf{\"u}llen k{\"o}nnten, was wiederum die Aufkl{\"a}rung ihrer noch nicht vollst{\"a}ndig entschl{\"u}sselten Funktionsweisen erfordert. So ist noch unbekannt, ob alle bisher als funktionell identifizierten Tas2r wirklich gustatorische Funktionen erf{\"u}llen. Im Rahmen der Charakterisierung neu generierter, im Locus des Bittergeschmacksrezeptors Tas2r131 genetisch modifizierter Mauslinien, wurde in vorliegender Arbeit die gustatorische sowie extragustatorische Expression von Tas2r131 untersucht. Dass Tas2r131 nicht nur in Pilzpapillen, Wall- und Bl{\"a}tterpapillen (VP+FoP), Gaumen, Ductus nasopalatinus, Vomeronasalorgan und Kehldeckel, sondern auch in Thymus, Testes und Nebenhodenkopf, in Gehirnarealen sowie im Ganglion geniculatum nachgewiesen wurde, bildete die Grundlage f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Studien. Die vorliegende Arbeit zeigt außerdem, dass Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137 und Tas2r143 in Blut exprimiert werden, was auf eine heterogene Funktion der Tas2r hindeutet. Dass zus{\"a}tzlich erstmals die Expression aller 35 als funktionell beschriebenen Tas2r im gustatorischen VP+FoP-Epithel von C57BL/6-M{\"a}usen nachgewiesen wurde, verweist auf deren Relevanz als funktionelle Geschmacksrezeptoren. Weiter zeigten Untersuchungen zur Aufkl{\"a}rung eines m{\"o}glichen Bitter-Unterscheidungsverm{\"o}gens in Geschmackspapillen von M{\"a}usen mit fluoreszenzmarkierten oder ablatierten Tas2r131-Zellen, dass Tas2r131 exprimierende Zellen eine Tas2r-Zellsubpopulation bilden. Dar{\"u}ber hinaus existieren innerhalb der Bitterzellen geordnete Tas2r-Expressionsmuster, die sich nach der chromosomalen Lage ihrer Gene richten. Isolierte Bitterzellen reagieren heterogen auf bekannte Bitterstoffe. Und M{\"a}use mit ablatierter Tas2r131-Zellpopulation besitzen noch andere Tas2r-Zellen und schmecken damit einige Bitterstoffe kaum noch, andere aber noch sehr gut. Diese Befunde belegen die Existenz verschiedener gustatorischer Tas2r-Zellpopulationen, welche die Voraussetzung bilden, Bitterstoffe heterogen zu detektieren. Ob dies die Grundlage f{\"u}r ein divergierendes Verhalten gegen{\"u}ber unvertr{\"a}glichen und harmlosen oder gar n{\"u}tzlichen Bitterstoffen darstellt, kann mit Hilfe der dargelegten Tas2r-Expressionsmuster k{\"u}nftig in Verhaltensexperimenten gepr{\"u}ft werden. Die Bittergeschmackswahrnehmung in S{\"a}ugetieren stellt sich als ein hochkomplexer Mechanismus dar, dessen Vielschichtigkeit durch die hier neu aufgezeigten heterogenen Tas2r-Expressions- und Funktionsmuster erneut verdeutlicht wird.}, language = {de} } @phdthesis{Schwarz2014, author = {Schwarz, Franziska}, title = {Einfluss von Kalorienrestriktion auf den Metabolismus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-83147}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {130}, year = {2014}, abstract = {Die H{\"a}ufung von Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einigen Krebsarten, deren Entstehung auf {\"U}bergewicht und Bewegungsmangel zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, ist ein aktuelles Problem unserer Gesellschaft. Insbesondere mit fortschreitendem Alter nehmen die damit einhergehenden Komplikationen zu. Umso bedeutender ist das Verst{\"a}ndnis der pathologischen Mechanismen in Folge von Adipositas, Bewegungsmangel, des Alterungsprozesses und den Einfluss-nehmenden Faktoren. Ziel dieser Arbeit war die Entstehung metabolischer Erkrankungen beim Menschen zu untersuchen. Die Auswertung von Verlaufsdaten anthropometrischer und metabolischer Parameter der 584 Teilnehmern der prospektiven ‚Metabolisches Syndrom Berlin Potsdam Follow-up Studie' wies f{\"u}r die gesamte Kohorte einen Anstieg an {\"U}bergewicht, ebenso eine Verschlechterung des Blutdrucks und des Glukosestoffwechsels auf. Wir untersuchten, ob das Hormon FGF21 Einfluss an dem Auftreten eines Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM) oder des Metabolischen Syndroms (MetS) hat. Wir konnten zeigen, dass Personen, die sp{\"a}ter ein MetS entwickeln, bereits zu Studienbeginn einen erh{\"o}hten FGF21-Spiegel, einen h{\"o}heren BMI, WHR, Hb1Ac und diastolischen Blutdruck aufwiesen. Neben FGF21 wurde auch Vaspin in diesem Zusammenhang untersucht. Es zeigte sich, dass Personen, die sp{\"a}ter einen T2DM entwickeln, neben einer Erh{\"o}hung klinischer Parameter tendenziell erh{\"o}hte Spiegel des Hormons aufwiesen. Mit FGF21 und Vaspin wurden hier zwei neue Faktoren f{\"u}r die Vorhersage des Metabolischen Syndroms bzw. Diabetes mellitus Typ 2 identifiziert. Der langfristige Effekt einer Gewichtsreduktion wurde in einer Subkohorte von 60 Personen untersucht. Der {\"u}berwiegende Teil der Probanden mit Gewichtsabnahme-Intervention nahm in der ersten sechsmonatigen Phase erfolgreich ab. Jedoch zeigte sich ein deutlicher Trend zur Wiederzunahme des verlorenen Gewichts {\"u}ber den Beobachtungszeitraum von f{\"u}nf Jahren. Von besonderem Interesse war die Absch{\"a}tzung des kardiovaskul{\"a}ren Risikos {\"u}ber den Framingham Score. Es wurde deutlich, dass f{\"u}r Personen mit konstanter Gewichtsabnahme ein deutlich geringeres kardiovaskul{\"a}res Risiko bestand. Hingegen zeigten Personen mit konstanter Wiederzunahme oder starken Gewichtsschwankungen ein hohes kardiovaskul{\"a}res Risiko. Unsere Daten legten nahe, dass eine erfolgreiche dauerhafte Gewichtsreduktion statistisch mit einem erniedrigten kardiovaskul{\"a}ren Risiko assoziiert ist, w{\"a}hrend Probanden mit starken Gewichtsschwankungen oder einer Gewichtszunahme ein gesteigertes Risiko haben k{\"o}nnten. Um die Interaktion der molekularen Vorg{\"a}nge hinsichtlich der Gewichtsreduktion und Lebensspanne untersuchen zu k{\"o}nnen, nutzen wir den Modellorganismus C.elegans. Eine kontinuierliche Restriktion wirkte sich verl{\"a}ngernd, eine {\"U}berversorgung verk{\"u}rzend auf die Lebensspanne des Rundwurms aus. Der Einfluss eines zeitlich eingeschr{\"a}nkten, intermittierenden Nahrungsregimes, analog zum Weight-Cycling im Menschen, auf die Lebensspanne war von großem Interesse. Dieser regelm{\"a}ßige Wechsel zwischen ad libitum F{\"u}tterung und Restriktion hatte in Abh{\"a}ngigkeit von der H{\"a}ufigkeit der Restriktion einen unterschiedlich starken lebensverl{\"a}ngernden Effekt. Ph{\"a}nomene, wie Gewichtswiederzunahmen, sind in C.elegans nicht zu beobachten und beruhen vermutlich auf einem Mechanismus ist, der evolution{\"a}r j{\"u}nger und in C.elegans noch nicht angelegt ist. Um neue Stoffwechselwege zu identifizieren, die die Lebensspanne beeinflussen, wurden Metabolitenprofile genetischer als auch di{\"a}tetischer Langlebigkeitsmodelle analysiert. Diese Analysen wiesen den Tryptophan-Stoffwechsel als einen neuen, bisher noch nicht im Fokus stehenden Stoffwechselweg aus, der mit Langlebigkeit in Verbindung steht.}, language = {de} } @phdthesis{Nitezki2017, author = {Nitezki, Tina}, title = {Charakterisierung von Stereotypien bei der FVB/NJ-Maus hinsichtlich metabolischer und immunologischer Aspekte auf die Stoffwechselleistung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-402265}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {149}, year = {2017}, abstract = {Im Sinne des Refinements von Tierversuchen sollen alle Bedingungen w{\"a}hrend der Zucht, der Haltung und des Transports von zu Versuchszwecken gehaltenen Tieren und alle Methoden w{\"a}hrend des Versuchs so verbessert werden, dass die verwendeten Tiere ein minimales Maß an potentiellem Distress, Schmerzen oder Leiden erfahren. Zudem soll ihr Wohlbefinden durch die M{\"o}glichkeit des Auslebens speziesspezifischer Verhaltensweisen und die Anwendung tierschonender Verfahren maximal gef{\"o}rdert werden. Zur Etablierung von Grunds{\"a}tzen des Refinements sind grundlegende Kenntnisse {\"u}ber die physiologischen Bed{\"u}rfnisse und Verhaltensanspr{\"u}che der jeweiligen Spezies unabdingbar. Die Experimentatoren sollten das Normalverhalten der Tiere kennen, um potentielle Verhaltensabweichungen, wie Stereotypien, zu verstehen und interpretieren zu k{\"o}nnen. Standardisierte Haltungsbedingungen von zu Versuchszwecken gehaltenen M{\"a}usen weichen in diversen Aspekten von der nat{\"u}rlichen Umgebung ab und erfordern eine gewisse Adaptation. Ist ein Tier {\"u}ber einen l{\"a}ngeren Zeitraum unf{\"a}hig, sich an die gegebenen Umst{\"a}nde anzupassen, k{\"o}nnen abnormale Verhaltensweisen, wie Stereotypien auftreten. Stereotypien werden definiert als Abweichungen vom Normalverhalten, die repetitiv und ohne Abweichungen im Ablauf ausgef{\"u}hrt werden, scheinbar keiner Funktion dienen und der konkreten Umweltsituation nicht immer entsprechen. Bisher war unklar, in welchem Ausmaß stereotypes Verhalten den metabolischen Ph{\"a}notyp eines Individuums beeinflusst. Ziel dieser Arbeit war es daher, das stereotype Verhalten der FVB/NJ-Maus erstmals detailliert zu charakterisieren, systematisch zusammenzutragen, welche metabolischen Konsequenzen dieses Verhalten bedingt und wie sich diese auf das Wohlbefinden der Tiere und die Verwendung stereotyper Tiere in Studien mit tierexperimentellem Schwerpunkt auswirken. Der Versuch begann mit der Charakterisierung der m{\"u}tterlichen F{\"u}rsorge in der Parentalgeneration. Insgesamt wurden 35 Jungtiere der F1-Generation vom Absatz an, {\"u}ber einen Zeitraum von 11 Wochen einzeln gehalten, kontinuierlich beobachtet, bis zum Versuchsende w{\"o}chentlich Kotproben gesammelt und das K{\"o}rpergewicht bestimmt. Zus{\"a}tzlich erfolgten begleitende Untersuchungen wie Verhaltenstests und die Erfassung der physischen Aktivit{\"a}t und metabolischer Parameter. Anschließend wurden u.a. die zerebralen Serotonin- und Dopamingehalte, f{\"a}kale Glucocorticoidlevels, hepatisches Glykogen und muskul{\"a}re Glykogen- und Triglyceridlevels bestimmt. Nahezu unabh{\"a}ngig von der m{\"u}tterlichen Herkunft entwickelte sich bei mehr als der H{\"a}lfte der 35 Jungtiere in der F1-Generation stereotypes Verhalten. Diese Daten deuten darauf hin, dass es keine Anzeichen f{\"u}r das Erlernen oder eine direkte genetische Transmission stereotypen Verhaltens bei der FVB/NJ-Maus gibt. {\"U}ber den gesamten Beobachtungszeitraum zeichneten sich die stereotypen FVB/NJ-M{\"a}use durch ein eingeschr{\"a}nktes Verhaltensrepertoire aus. Zu Gunsten der erh{\"o}hten Aktivit{\"a}t und des Aus{\"u}bens stereotypen Verhaltens lebten sie insgesamt weniger andere Verhaltensweisen (Klettern, Graben, Nagen) aus. Dar{\"u}ber hinaus waren Stereotypien sowohl im 24-Stunden Open Field Test als auch in der Messeinrichtung der indirekten Tierkalorimetrie mit einer erh{\"o}hten Aktivit{\"a}t und Motilit{\"a}t assoziiert, w{\"a}hrend die circadiane Rhythmik nicht divergierte. Diese erh{\"o}hte k{\"o}rperliche Bet{\"a}tigung spiegelte sich in den niedrigeren K{\"o}rpergewichtsentwicklungen der stereotypen Tiere wieder. Außerdem unterschieden sich die K{\"o}rperfett- und K{\"o}rpermuskelanteile. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass das Aus{\"u}ben stereotypen Verhaltens zu Differenzen im metabolischen Ph{\"a}notyp nicht-stereotyper und stereotyper FVB/NJ-M{\"a}use f{\"u}hrt. Im Sinne der „Guten Wissenschaftlichen Praxis" sollte das zentrale Ziel jedes Wissenschaftlers sein, aussagekr{\"a}ftige und reproduzierbare Daten hervorzubringen. Jedoch k{\"o}nnen keine validen Resultate von Tieren erzeugt werden, die in Aspekten variieren, die f{\"u}r den vorgesehenen Zweck der Studie nicht ber{\"u}cksichtigt wurden. Deshalb sollten nicht-stereotype und stereotype Individuen nicht innerhalb einer Versuchsgruppe randomisiert werden. Stereotype Tiere demzufolge von geplanten Studien auszuschließen, w{\"u}rde allerdings dem Gebot des zweiten R's - der Reduction - widersprechen. Um Refinement zu garantieren, sollte der Fokus auf der maximal erreichbaren Pr{\"a}vention stereotypen Verhaltens liegen. Diverse Studien haben bereits gezeigt, dass die Anreicherung der Haltungsumwelt (environmental enrichment) zu einer Senkung der Pr{\"a}valenz von Stereotypien bei M{\"a}usen f{\"u}hrt, dennoch kommen sie weiterhin vor. Daher sollte environmental enrichment zuk{\"u}nftig weniger ein „Kann", sondern ein „Muss" sein - oder vielmehr: der Goldstandard. Zudem w{\"u}rde eine profunde ph{\"a}notypische Charakterisierung dazu beitragen, Mausst{\"a}mme zu erkennen, die zu Stereotypien neigen und den f{\"u}r den spezifischen Zweck am besten geeigneten Mausstamm zu identifizieren, bevor ein Experiment geplant wird.}, language = {de} } @phdthesis{Voigt2008, author = {Voigt, Andrea}, title = {K{\"o}rperbau, Gelenkbeweglichkeit und Handkr{\"a}fte Erwachsener im Generationenvergleich}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-31217}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die ergonomische Anpassung von Produkten der k{\"o}rpernahen Umwelt an den menschlichen K{\"o}rper in seiner gesamten Variabilit{\"a}t erfordert anthropometrische Grundlagen. Die vorliegende Arbeit beschreibt und analysiert die K{\"o}rpermasse, 17 L{\"a}ngenmaße, 5 Skelettrobustizit{\"a}tsmaße, 6 Korpulenzmaße, 3 Kopfmaße, 5 Handmaße, 3 Fußmaße, sowie 10 Beweglichkeitsmaße der Wirbels{\"a}ule, 8 Beweglichkeitsmaße der Hand, 2 Beweglichkeitsmaße des Beines und 7 Handkr{\"a}fte von 295 Probanden der drei Altersgruppen 20 bis 29 Jahre, 50 bis 59 Jahre und 60 bis 69 Jahre. Die Untersuchungen wurden im Zeitraum von September 2006 bis April 2007 durchgef{\"u}hrt. Ziel der Arbeit ist es, f{\"u}r den {\"u}berwiegenden Teil der untersuchten k{\"o}rperlichen Merkmale erstmals f{\"u}r die deutsche Bev{\"o}lkerung geschlechts- und altersspezifische Mittelwerte und Variabilit{\"a}tsbereiche bis zum vollendeten 70. Lebensjahr zur Verf{\"u}gung zu stellen. Das gilt insbesondere f{\"u}r die untersuchten Beweglichkeitsmaße und Handkr{\"a}fte. Erstmals werden Korrelationen zwischen der K{\"o}rperform, wie sie sich im Maßzusammenhang der unterschiedlichen K{\"o}rperbautypen darstellt, der Gelenkbeweglichkeit und den Handkr{\"a}ften vorgestellt. Dar{\"u}ber hinaus wird durch den Vergleich der Ergebnisse der jungen und der beiden {\"a}lteren Erwachsenengruppen untersucht, welche Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen bestehen. Im Hinblick auf die zeitliche G{\"u}ltigkeit der aktuellen Untersuchungsergebnisse werden der Einfluss des s{\"a}kularen Trends und der Einfluss der ontogenetischen Alternsprozesse auf L{\"a}ngenmaße und Korpulenzmaße diskutiert. Die Arbeit zeigt auf, dass innerhalb der untersuchten Probanden eine große Variationsbreite in den K{\"o}rpermaßen auftritt. Es lassen sich typische Altersunterschiede erkennen. Die {\"A}lteren sind im Mittel kleiner, weisen jedoch gr{\"o}ßere Skelettrobustizit{\"a}ts- und Korpulenzmaße auf. Die dynamischen Maße weisen auf eine geringere Beweglichkeit der Wirbels{\"a}ule, teilweise auch der Hand hin. Die Handkr{\"a}fte der Frauen werden mit zunehmendem Alter geringer, bei den M{\"a}nnern sind die {\"A}lteren kr{\"a}ftiger als die jungen Erwachsenen. Die Ergebnisse deuten auf einen gegen{\"u}ber fr{\"u}heren Generationen verz{\"o}gerten Beginn von k{\"o}rperlichen Alterserscheinungen hin, der im Hinblick auf die steigende Lebenserwartung der Bev{\"o}lkerung eingehender untersucht werden sollte.}, language = {de} } @phdthesis{Dobbernack2008, author = {Dobbernack, Gisela}, title = {Konstruktion und Charakterisierung transgener Mauslinien f{\"u}r humane Sulfotransferasen als Modellsysteme f{\"u}r eine SULT-vermittelte metabolische Aktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-30447}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die Enzyme der Sulfotransferase-Gensuperfamilie (SULT) konjugieren nukleophile Gruppen von kleinen endogenen Verbindungen und Fremdstoffen mit der negativ geladenen Sulfo-Gruppe. Dadurch wird die Polarit{\"a}t dieser Verbindungen erh{\"o}ht, ihre passive Permeation von Zellmembranen verhindert und somit ihre Ausscheidung erleichtert. Jedoch stellt die Sulfo-Gruppe in bestimmten chemischen Verbindungen eine gute Abgangsgruppen dar. Aus der Spaltung resultierende Carbenium- oder Nitreniumionen k{\"o}nnen mit DNA oder anderen zellul{\"a}ren Nukleophilen reagieren. In Testsystemen f{\"u}r Mutagenit{\"a}t wurden zahlreiche Verbindungen, darunter Nahrungsinhaltsstoffe und Umweltkontaminanten, durch SULT zu Mutagenen aktiviert. Dabei zeigten sich zum einen eine ausgepr{\"a}gte Substratspezifit{\"a}t selbst orthologer SULT-Formen unterschiedlicher Spezies und zum anderen Interspezies-Unterschiede in der SULT-Gewebeverteilung. Daher k{\"o}nnten sich die Zielgewebe einer SULT-induzierten Krebsentstehung bei Mensch und Nager unterscheiden. Um die Beteiligung von humanen SULT an der Bioaktivierung von Fremdstoffen im Tiermodell untersuchen zu k{\"o}nnen, wurden transgene Mauslinien f{\"u}r den Cluster der humanen SULT1A1- und -1A2-Gene sowie f{\"u}r die humane SULT1B1 generiert. Zur Herstellung der transgenen Linien wurden große genomische Konstrukte verwendet, die die SULT-Gene sowie - zum Erreichen einer der Humansituation entsprechenden Gewebeverteilung der Proteinexpression - deren potentielle regulatorische Sequenzen enthielten. Es wurden je drei transgene Linien f{\"u}r hSULT1A1/hSULT1A2 und drei transgene Linien f{\"u}r hSULT1B1 etabliert. Die Expression der humanen Proteine konnte in allen Linien gezeigt werden und f{\"u}nf der sechs Linien konnten zur Homozygotie bez{\"u}glich der Transgene gez{\"u}chtet werden. In der molekularbiologischen Charakterisierung der transgenen Linien wurde der chromosomale Integrationsort der Konstrukte bestimmt und die Kopienzahl pro Genom untersucht. Mit Ausnahme einer hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linie, bei der Kopien des Konstrukts in zwei unterschiedliche Chromosomen integriert vorliegen, wiesen alle Linien nur einen Transgen-Integrationsort auf. Die Untersuchung der Transgen-Kopienzahl ergab, dass die Mauslinien zwischen einer und etwa 20 Kopien des Transgen-Konstrukts pro Genom trugen. In der proteinbiochemischen Charakterisierung wurde gezeigt, dass die transgenen Linien die humanen Proteine mit einer weitgehend der des Menschen entsprechenden Gewebeverteilung exprimieren. Die Intensit{\"a}t der im Immunblot nachgewiesenen Expression korrelierte mit der Kopienzahl der Transgene. Die zellul{\"a}re und subzellul{\"a}re Verteilung der Transgen-Expression wurden bei einer der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien in Leber, Niere, Lunge, Pankreas, D{\"u}nndarm und Kolon und bei einer der hSULT1B1-transgenen Linien im Kolon untersucht. Sie stimmte ebenfalls mit der Verteilung der entsprechenden SULT-Formen im Menschen {\"u}berein. Da sich die erzeugten transgenen Linien aufgrund ihrer mit dem Menschen vergleichbaren Gewebeverteilung der SULT-Expression als Modellsystem zur Untersuchung der menschlichen SULT-vermittelten metabolischen Aktivierung eigneten, wurde eine der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien f{\"u}r zwei erste toxikologische Untersuchungen eingesetzt. Den M{\"a}usen wurden chemische Verbindungen verabreicht, f{\"u}r die in in-vitro-Versuchen eine hSULT1A1/hSULT1A2-vermittelte Bioaktivierung zu Mutagenen gezeigt worden war. In beiden Untersuchungen wurde die Gewebeverteilung der entstandenen DNA-Addukte als Endpunkt einer gewebespezifischen genotoxischen Wirkung ermittelt. In der ersten Untersuchung wurden 90 mg/kg K{\"o}rpergewicht 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin - ein in gebratenem Fleisch gebildetes heterozyklisches aromatisches Amin - transgenen sowie Wildtyp-M{\"a}usen oral verabreicht. Acht Stunden nach Applikation wiesen die transgenen M{\"a}use signifikant h{\"o}here Adduktniveaus als die Wildtyp-M{\"a}use in Leber, Lunge, Niere, Milz und Kolon auf. In der Leber der transgen M{\"a}use war das Adduktniveau 17fach h{\"o}her als in der Leber der Wildtyp-M{\"a}use. Die Leber war bei den transgenen Tieren das Organ mit dem h{\"o}chsten, bei den Wildtyp-Tieren hingegen mit dem niedrigsten DNA-Adduktniveau. In der zweiten Untersuchung (Pilotstudie mit geringer Tierzahl) wurde transgenen und Wildtyp-M{\"a}usen 19 mg/kg K{\"o}rpergewicht des polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs 1-Hydroxymethylpyren - ein Metabolit der Nahrungs- und Umweltkontaminante 1-Methylpyren - intraperitoneal verabreicht. Nach 30 Minuten wurden, verglichen mit den Wildtyp-M{\"a}usen, bis zu 25fach erh{\"o}hte Adduktniveaus bei den transgenen M{\"a}usen in Leber, Niere, Lunge und Jejunum nachgewiesen. Somit konnte anhand einer in dieser Arbeit generierten transgenen Mauslinie erstmals gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1/hSULT1A2 tats{\"a}chlich sowohl auf die St{\"a}rke als auch die Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo eine Auswirkung hat.}, language = {de} } @phdthesis{Kipp2008, author = {Kipp, Anna Patricia}, title = {Selen, Selenoproteine und der Wnt-Signalweg : Regulation der gastrointestinalen Glutathionperoxidase durch β-Catenin und Beeinflussung des Wnt-Signalwegs durch den Selenstatus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-30484}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion haupts{\"a}chlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminos{\"a}ure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene f{\"u}r Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion h{\"a}ufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikron{\"a}hrstoffe, f{\"u}r das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage daf{\"u}r liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden f{\"u}r 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalit{\"a}t um 50 \%. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gew{\"a}hrleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungekl{\"a}rt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europ{\"a}ischen Bev{\"o}lkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte M{\"a}use f{\"u}r sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenad{\"a}quat (0,15 mg/kg Futter) gef{\"u}ttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 \% und der GPx-Aktivit{\"a}t in der Leber auf 35 \%. Zun{\"a}chst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker f{\"u}r die in dieser Studie gew{\"a}hlte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgef{\"u}hrt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um m{\"o}gliche molekularbiologische Erkl{\"a}rungsans{\"a}tze f{\"u}r die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schl{\"u}sselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tats{\"a}chlich aktiver ist als bei selenad{\"a}quater Versorgung. Ein weiterer m{\"o}glicher Erkl{\"a}rungsansatz f{\"u}r die postulierte pr{\"a}ventive Funktion von Selen gegen{\"u}ber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verk{\"u}rzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den f{\"u}r die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu geh{\"o}ren, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gew{\"a}hrleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu {\"u}ber 90 \% mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 m{\"o}glicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 w{\"a}hrend der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen.}, language = {de} } @phdthesis{Donath2008, author = {Donath, Claudia}, title = {Sulfotransferase-vermittelte Genotoxizit{\"a}t von benzylischen Metaboliten alkylierter polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-29717}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe werden in vielen Matrizes wie Fahrzeugabgasen und Tabakrauch und auch als Kontaminanten in Nahrungsmitteln neben rein aromatischen Kongeneren gefunden. Alkylierte PAK k{\"o}nnen {\"u}ber die Alkylseitenkette {\"u}ber benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfonierung katalysiert {\"u}ber Sulfotransferasen (SULT) zu reaktiven Schwefels{\"a}ureestern umgesetzt werden. Die SULT-vermittelte Bioaktivierung zu einem genotoxischen Schwefels{\"a}ureester wurde f{\"u}r den benzylischen Alkohol 1-Hydroxymethylpyren des Hepatokanzerogens 1-Methylpyren in fr{\"u}heren Arbeiten gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob die benzylischen Alkohole weiterer alkylierter PAK {\"u}ber Sulfonierung zu genotoxischen Schwefels{\"a}ureestern umgesetzt werden. Hierzu wurde eine Gruppe von 17 Modellsubstanzen ausgew{\"a}hlt, um die Ableitung von Struktur-Aktivit{\"a}ts-Beziehungen zu erm{\"o}glichen. Das genotoxische Potenzial authentischer benzylischer Schwefels{\"a}ureester der Modellsubstanzen wurde zun{\"a}chst in vitro {\"u}ber DNA-Adduktbildung im zellfreien System und Mutagenit{\"a}t im Salmonella-R{\"u}ckmutationstest untersucht. Die Sulfate zeigten große Reaktivit{\"a}tsunterschiede in Abh{\"a}ngigkeit von der Struktur des aromatischen Systems und der Position der Alkylseitenkette, wobei die Endpunkte DNA-Adduktbildung und Mutagenit{\"a}t gut korrelierten. Des Weiteren wurde der Salmonella-Mutagenit{\"a}tstest mit den benzylischen Alkoholen der untersuchten alkylierten PAK und gentechnisch ver{\"a}nderten S. typhimurium-St{\"a}mmen, die SULT-Formen des Menschen heterolog exprimieren, durchgef{\"u}hrt. Bis auf die Alkohole 2- und 4-HMP zeigten alle untersuchten benzylischen Alkohole deutliche mutagene Effekte in einem oder mehreren humane SULT exprimierenden St{\"a}mmen. Die durchgef{\"u}hrten in vitro-Versuche zeigten das Potenzial der benzylischen Metabolite alkylierter PAK f{\"u}r genotoxische Wirkungen. Nachfolgend musste gekl{\"a}rt werden, welche Relevanz die beobachteten Effekte f{\"u}r die komplexere in vivo-Situation haben. Nach Verabreichung verschiedener benzylischer Schwefels{\"a}ureester und Alkohole an m{\"a}nnliche Ratten konnten DNA-Addukte in den untersuchten Organen detektiert werden, was im Fall der Schwefels{\"a}ureester deren systemische Bioverf{\"u}gbarkeit und im Fall der benzylischen Alkohole deren Umsatz durch SULT der m{\"a}nnlichen Ratte zeigte. Da im Gegensatz zum Menschen die SULT-Expression in der Ratte auf die Leber fokussiert ist, musste ein Großteil des Umsatzes zu genotoxischen Sulfaten in der Leber stattgefunden haben. DNA-Addukte wurden jedoch auch in extrahepatischen Organen gefunden, was {\"u}ber einen hepatischen Export der gebildeten reaktiven Sulfate und deren Transport {\"u}ber den Blutkreislauf zu diesen Geweben erkl{\"a}rt werden kann. F{\"u}r die weiterf{\"u}hrenden in vivo-Studien wurden die benzylischen Alkohole 1-HMP und 1-HM-8-MP ausgew{\"a}hlt, die trotz großer struktureller {\"A}hnlichkeit toxikodynamische Unterschiede zeigten. Zur Untersuchung der Bedeutung des SULT-vermittelten Toxifizierungsweges als auch konkurrierender detoxifizierender oxidativer Stoffwechselprozesse, wurden f{\"u}r 1-HMP und 1-HM-8-MP in vivo-Inhibitionsstudien mit SULT-Inhibitoren und f{\"u}r 1-HM-8-MP auch mit ADH/ALDH-Inhibitoren durchgef{\"u}hrt. Eine Vorbehandlung mit dem SULT-Hemmstoff Pentachlorphenol f{\"u}hrte zu einer Reduktion der DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HMP- und 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Die Verabreichung von Quercetin hatte keine Auswirkung auf die DNA-Adduktniveaus. Die Hemmung der DNA-Adduktbildung bei Verabreichung von Pentachlorphenol verdeutlichte jedoch, dass benzylische Alkohole alkylierter PAK in vivo {\"u}ber Sulfonierung bioaktiviert werden. Eine Vorbehandlung mit dem ADH-Inhibitor 4-Methylpyrazol und dem ADH-Substrat Ethanol f{\"u}hrte zu erh{\"o}hten DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Den gleichen Effekt, jedoch in geringerem Ausmaß, hatte auch die Vorbehandlung mit dem ALDH-Inhibitor Disulfiram. Dies deutet darauf hin, dass oxidative Modifikationen an der Seitenkette des 1-HM-8-MP einen Detoxifizierungsmechanismus darstellen. Nach Verabreichung benzylischer Metabolite alkylierter PAK wurden oftmals hohe Adduktniveaus in der Niere detektiert. Als m{\"o}gliche Ursache hierf{\"u}r wurde eine Transporter-vermittelte renale Sekretion reaktiver Sulfate postuliert, die {\"u}ber Vorbehandlung mit Probenecid vor Verabreichung von 1-HMP und 1-HM-8-MP {\"u}berpr{\"u}ft wurde. Der Haupteffekt der Probenecid-Behandlung wurde jedoch nicht in der Niere, sondern in der Leber beobachtet, die stark erh{\"o}hte Adduktniveaus zeigte. Eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung hierf{\"u}r ist die Hemmung des Exportes in der Leber gebildeter reaktiver Sulfate {\"u}ber Inhibition hepatischer organischer Anionentransporter.}, language = {de} } @phdthesis{Thamm2009, author = {Thamm, Markus}, title = {Charakterisierung der Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene Apis mellifera : von den Genen zum Verhalten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-40736}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {Das serotonerge System besitzt sowohl bei Invertebraten als auch bei Vertebraten eine große Bedeutung f{\"u}r die Kontrolle und Modulation vieler physiologischer Prozesse und Verhaltensleistungen. Bei der Honigbiene Apis mellifera spielt Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) eine wichtige Rolle bei der Arbeitsteilung und dem Lernen. Die 5-HT-Rezeptoren, die {\"u}berwiegend zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) geh{\"o}ren, besitzen eine Schl{\"u}sselstellung f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der molekularen Mechanismen der serotonergen Signalweiterleitung. Ziel dieser Arbeit war es, 5-HT-Rezeptoren der Honigbiene zu charakterisieren. Dazu z{\"a}hlt die Identifizierung der molekularen Struktur, die Ermittlung der intrazellul{\"a}ren Signalwege, die Erstellung von pharmakologischen Profilen, die Ermittlung der Expressionsmuster und die Ermittlung der physiologischen Funktionen der Rezeptoren. Mit Hilfe der Informationen aus dem Honey Bee Genome Project, konnten drei RezeptorcDNAs kloniert werden. Vergleiche der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenzen mit den Aminos{\"a}uresequenzen bereits charakterisierter Rezeptoren legten nahe, dass es sich dabei um einen 5-HT1- (Am5-HT1) und zwei 5-HT2-Rezeptoren (Am5-HT2α und Am5-HT2β) handelt. Die strukturelle Analyse der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenz dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur von GPCRs und zeigt starkkonservierte Motive, die bedeutend f{\"u}r die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine sind. F{\"u}r die beiden 5 HT2-Rezeptoren konnte zudem alternatives Spleißen nachgewiesen werden. Mit den cDNAs des Am5-HT1- und des Am5-HT2α-Rezeptors wurden HEK293-Zellen stabil transfiziert und anschließend die Rezeptoren funktionell und pharmakologisch analysiert. Am5-HT1 hemmt bei Aktivierung abh{\"a}ngig von der 5-HT-Konzentration die cAMPProduktion.Die Substanzen 5-Methoxytryptamin (5-MT) und 5-Carboxamidotryptamin konnten als Agonisten identifiziert werden. Methiothepin dagegen blockiert die 5-HTWirkung vollst{\"a}ndig. Prazosin und WAY100635 stellen partielle Antagonisten des Am5-HT1-Rezeptors dar. Der Am5-HT2_-Rezeptor stimuliert bei Aktivierung die Synthese des sekund{\"a}ren Botenstoffs Inositoltrisphosphat, was wiederum zu einer messbaren Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration f{\"u}hrt. 5-MT und 8-OH-DPAT zeigen eine deutliche agonistische Wirkung auf Am5-HT2α. Dagegen besitzen Clozapin, Methiothepin, Mianserin und Cyproheptadin die F{\"a}higkeit, die 5-HT-Wirkung um 51-64 \% zu vermindern. Die bereits erw{\"a}hnte alternative Spleißvariante von Am5-HT2α wurde ebenfalls in HEK293-Zellen exprimiert und analysiert, scheint jedoch eigenst{\"a}ndig nicht funktionell zu sein. Gegen die dritte cytoplasmatische Schleife (CPL3) wurde ein polyklonales Antiserum generiert. Dieses erkennt in Western-Blot-Analysen ein Protein mit einer Masse von ca. 50 kDa. Durch immunhistochemische Analysen am Bienengehirn wurde die Verteilung des Rezeptors genauer untersucht. Dabei zeigten die optischen Neuropile, besonders die Lamina und die Ocellarnerven, stets eine starke Markierung. Außerdem wird der Rezeptor in den α- und β-Loben sowie der Lippe, dem Basalring und dem Pedunculus der Pilzk{\"o}rper exprimiert. Doppelmarkierungen zeigen stets eine enge Nachbarschaft von serotonergen Fasern und dem Am5-HT1-Rezeptor. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Am5-HT1-Rezeptor sehr wahrscheinlich an der Regulation des phototaktischen Verhalten der Honigbiene beteiligt ist. Verf{\"u}tterung von 5-HT hat eine deutlich negative Wirkung auf das phototaktischen Verhalten. Diese kann durch den Am5-HT1-Rezeptor-Agonisten 5-CT imitiert werden. Schließlich konnte gezeigt werden, dass der Am5-HT1-Antagonist Prazosin die 5-HT-Wirkung deutlich vermindern kann.}, language = {de} } @phdthesis{Buehning2018, author = {B{\"u}hning, Martin}, title = {Charakterisierung des Zusammenspiels von FeS-Cluster-Assemblierung, Molybd{\"a}nkofaktor-Biosynthese und tRNA-Thiolierung in Escherichia coli}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {167}, year = {2018}, language = {de} } @phdthesis{Kammel2018, author = {Kammel, Anne}, title = {Identifizierung fr{\"u}her epigenetischer Ver{\"a}nderungen, die zur Ausbildung einer Fettleber beitragen}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {130}, year = {2018}, language = {de} } @phdthesis{Schwanhold2018, author = {Schwanhold, Nadine}, title = {Die Funktion und Spezifit{\"a}t der Molybd{\"a}n-Cofaktor-bindenden Chaperone f{\"u}r die Formiat-Dehydrogenasen aus Escherichia coli und Rhodobacter capsulatus}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {132}, year = {2018}, language = {de} } @phdthesis{Pellengahr2004, author = {Pellengahr, Klaus}, title = {Charakterisierung von ausgew{\"a}hlten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2500}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle f{\"u}nf ausgew{\"a}hlten Gene kodieren f{\"u}r PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs pr{\"a}ferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte f{\"u}r die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer {\"U}bereinstimmung auf Aminos{\"a}ureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz erm{\"o}glichte es, die sehr {\"a}hnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit ver{\"a}nderter Genaktivit{\"a}t von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich ver{\"a}ndertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Bl{\"a}tter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. F{\"u}r TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen l{\"a}sst. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivit{\"a}t zu einem deutlichen Blattph{\"a}notyp mit gezahnten Blattr{\"a}ndern f{\"u}hrte. F{\"u}r STH2-Insertionsmutanten wurde dieses ver{\"a}nderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches f{\"u}r ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer f{\"u}r das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erh{\"o}hte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und f{\"u}hrte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. W{\"a}hrend NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erh{\"o}hte, f{\"u}hrte NIC4-Expresion zu einer h{\"o}heren Sensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten ausw{\"a}rts gerichtete Chloridstr{\"o}me, die spannungsabh{\"a}ngig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumstr{\"o}me, die spannungsunabh{\"a}ngig waren. F{\"u}r NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivit{\"a}t detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivit{\"a}t in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war haupts{\"a}chlich in den vaskul{\"a}ren Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Ph{\"a}notyp bei Ver{\"a}nderung der Genaktivit{\"a}t von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu {\"u}bernehmen.}, subject = {Biologie}, language = {de} } @phdthesis{Qin2022, author = {Qin, Miaojing}, title = {The role of heat shock proteins (HSP23s and HSP70-4) for heat stress memory in plants}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {138}, year = {2022}, abstract = {Heat is a significant climatic condition that threatens crop growth and survival. Extreme temperature occurrences in nature are becoming more severe, more frequent and longer-lasting, all of which have deleterious repercussions for agricultural production. As a result, it is critical to learn more about the mechanisms that lead to increased heat tolerance in plants. To endure and survive, higher plants have evolved complex mechanisms to respond to various amounts of heat stress. Plants have a thermal tolerance that permits them to survive rapid and dramatic temperature rises for a limited time. Plants can also be primed to withstand heat stress (HS) that would otherwise be lethal by exposing them to short, moderate, and non-lethal HS (referred to as a priming stimulus) before being exposed to severe HS. A prepared acquired thermotolerance in primed plants can be maintained for a long time under optimal circumstances, implying that plants can store information during this period. Several studies have shown that acquired thermotolerance (thermopriming) refers to the increased resistance of cells, tissues, and organisms to elevated temperatures after prior heat exposure. Maintenance of acquired thermotolerance (thermomemory) is associated with the synthesis of specialized stress proteins involved in cellular protection and accelerated tissue repair, such as heat shock proteins (HSPs). Recent studies showed a main role of heat shock proteins for turnover of protein quality components, e.g. HSP21 in the chloroplast in the regulation of thermomemory. As an important organelle, mitochondrial function is critical for plant cell responses to heat. However, it is still unknown what the molecular and physiological involvement of HSPs is in mitochondrial function and thermomemory. In our study, we showed that thermopriming induces transcript and protein levels of two mitochondrial small heat shock proteins, HSP23.5 (AT5G51440) and HSP23.6 (AT4G25200), which last for 2-3 days throughout the thermomemory phase. The morphological analysis of HSP23.5/6 transgenic plants demonstrated HSP23.5/6 function redundantly in heat stress. We showed that hsp23.5/6 double knockout plants had abnormalities in thermomemory at the seedling stage, and that mature hsp23.5/6 4 plants are more sensitive to both basal thermotolerance and thermomemory. Heat treatment significantly impacted the respiration rate of hsp23.5/6 seedlings compared to WT, indicating mitochondrial dysfunction dependent on HSP23.5 and HSP23.6. In addition, we tested and confirmed the chaperone activity of HSP23.6 toward the model substrate protein malate dehydrogenase (MDH) in vitro, indicating that HSP23.6 potentially contributes to the maintenance of cellular viability. Furthermore, we discovered a novel HSP23.6 client protein, CIB22, a mitochondrial complex-I subunit protein. According to experimental data (BiFC and Co-IP), HSP23.6 and CIB22 interact in plant cells. We also identified a heat response phenotype in the cib22 mutant compared to WT, as well as CIB22 protein degradation in the hsp23.5/6 mutant when exposed to heat. Our findings suggest that the two mitochondrial-localized heat shock proteins play a role in thermotolerance, presumably by influencing mitochondrial function and structure. More broadly, to identify novel genetic components associated with thermomemory in plants, we performed proteome profiling for Arabidopsis WT (Col-0) seedlings during thermomemory. Multiple time point samples of priming and triggering with controls were collected and analyzed to reveal the dynamic proteome changes during the memory phase in Arabidopsis cells. Among the top memory-associated proteins, we discovered that HSP70-4 was significantly upregulated after priming and remains high (at least 2-fold) for the next four days. By morphologically analyzing their heat stress behaviors, we were able to verify that HSP70-4 is involved in plant heat stress response. More intriguingly, we discovered that following priming, HSP70-4-GFP creates cytosolic foci that persist for a few days into the recovery period. We propose that these foci are linked to SGs due to cycloheximide (CHX) repressing the GFP-foci signal when exposed to heat. These findings indicate an HSP70-4-mediated transcription and translation control link (module) during basal thermotolerance and thermomemory, as well as its potential role(s) in heat stress response. To summarize, our research provides new insight into the role of heat shock proteins in controlling heat stress tolerance and memory.}, language = {de} } @phdthesis{Niedl2015, author = {Niedl, Robert Raimund}, title = {Nichtlineare Kinetik und responsive Hydrogele f{\"u}r papierbasierte Schnelltestanwendungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-77735}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {iv, 128}, year = {2015}, abstract = {Viele klinische Schnelltestsysteme ben{\"o}tigen vorpr{\"a}parierte oder aufgereinigte Analyte mit frisch hergestellten L{\"o}sungen. Fernab standardisierter Laborbedingungen wie z.B. in Entwicklungsl{\"a}ndern oder Krisengebieten sind solche Voraussetzungen oft nur unter einem hohen Aufwand herstellbar. Zus{\"a}tzlich stellt die erforderliche Sensitivit{\"a}t die Entwicklung einfach zu handhabender Testsysteme vor große Herausforderungen. Autokatalytische Reaktionen, die sich mit Hilfe sehr geringer Initiatorkonzentrationen ausl{\"o}sen lassen, k{\"o}nnen hier eine Perspektive f{\"u}r Signalverst{\"a}rkungsprozesse bieten. Aus diesem Grund wird im ersten Teil der vorliegenden Arbeit das Verhalten der autokatalytischen Arsenit-Jodat-Reaktion in einem mikrofluidischen Kanal untersucht. Dabei werden insbesondere die diffusiven und konvektiven Einfl{\"u}sse auf die Reaktionskinetik im Vergleich zu makroskopischen Volumenmengen betrachtet. Im zweiten Teil werden thermoresponsive Hydrogele mit einem kanalstrukturierten Papiernetzwerk zu einem neuartigen, kapillargetriebenen, extern steuerbaren Mikrofluidik-System kombiniert. Das hier vorgestellte Konzept durch Hydrogele ein papierbasiertes LOC-System zu steuern, erm{\"o}glicht zuk{\"u}nftig die Herstellung von komplexeren, steuerbaren Point-Of-Care Testsystemen (POCT). Durch z.B. einen thermischen Stimulus, wird das L{\"o}sungsverhalten eines Hydrogels so ver{\"a}ndert, dass die gespeicherte Fl{\"u}ssigkeit freigesetzt und durch die Kapillarkraft des Papierkanals ins System transportiert wird. Die Eigenschaften dieses Gelnetzwerks k{\"o}nnen dabei so eingestellt werden, dass eine Freisetzung von Fl{\"u}ssigkeiten sogar bei K{\"o}rpertemperatur m{\"o}glich w{\"a}re und damit eine Anwendung g{\"a}nzlich ohne weitere Hilfsmittel denkbar ist. F{\"u}r die Anwendung notwendige Chemikalien oder Enzyme lassen sich hierbei bequem in getrocknetem Zustand im Papiersubstrat vorlagern und bei Bedarf in L{\"o}sung bringen. Im abschließenden dritten Teil der Arbeit wird ein durch Hydrogele betriebener, Antik{\"o}rper-basierter Mikroorganismenschnelltest f{\"u}r Escherichia coli pr{\"a}sentiert. Dar{\"u}ber hinaus wird weiterf{\"u}hrend eine einfache Methode zur Funktionalisierung eines Hydrogels mit Biomolek{\"u}len {\"u}ber EDC/NHS-Kopplung vorgestellt.}, language = {de} } @phdthesis{Sieber2010, author = {Sieber, Matthias}, title = {Modulatoren des Calcineurin-NFATc-Signalweges in humanen TH-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-44676}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Die Ca2+/Calmodulin-aktivierte Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin ist ein Schl{\"u}sselmolek{\"u}l des T-Zell-Rezeptorabh{\"a}ngigen Signalnetzwerkes. Calcineurin aktiviert die Transkriptionsfaktoren der NFATc-Familie durch Dephosphorylierung und reguliert dar{\"u}ber die Expression wichtiger Zytokine und Oberfl{\"a}chenproteine. Die Aktivit{\"a}t von Calcineurin wird durch zahlreiche endogene Proteine moduliert und ist Angriffspunkt der immunsuppressiven Substanzen Cyclosporin A und FK506. In dieser Arbeit wurde der alternative niedermolekulare Calcineurin-NFATc-Inhibitor NCI3 hinsichtlich seiner Effekte auf T-Zell-Rezeptor-abh{\"a}ngige Signalwege charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Pyrazolopyrimidinderivat NCI3 nichttoxisch und zellmembranpermeabel ist. In T-Zell-Rezeptor-stimulierten prim{\"a}ren humanen TH-Zellen unterdr{\"u}ckt NCI3 die Proliferation und IL-2-Produktion (IC50-Wert ~4 µM), da die Dephosphorylierung von NFATc und die anschließende nukle{\"a}re Translokation gehemmt wird. NCI3 inhibiert die calcineurinabh{\"a}ngige NFAT- und NF-κB-, aber nicht die AP-1-kontrollierte Reprtergenexpression, in mikromolaren Konzentrationen (IC50-Werte 2 bzw. 7 µM). Im Gegensatz zu Cyclosporin A st{\"o}rt NCI3 nicht die Phosphataseaktivit{\"a}t von Calcineurin, sondern interferiert mit der Calcineurin-NFATc-Bindung. Ein wichtiges endogenes Modulatorprotein f{\"u}r die Calcineurinaktivit{\"a}t ist RCAN1, das vermutlich den Calcineurin-NFATc-Signalweg {\"u}ber einen negativen R{\"u}ckkopplungsmechanismus reguliert. Hier wurde gezeigt, daß RCAN1 in humanen TH-Zellen exprimiert wird. Die Spleißvariante RCAN1-1 ist in ruhenden T-Zellen basal exprimiert und wird nicht durch T-Zell-Rezeptor-Stimulierung in seiner Expression ver{\"a}ndert. RCAN1-4 dagegen ist in ruhenden Zellen kaum zu detektieren und wird stimulierungsabh{\"a}ngig induziert. Durch die Verwendung Calcineurin-NFATc-spezifischer Inhibitoren wie NCI3 wurde gezeigt, daß die RCAN1-4-Induktion durch diesen Signalweg limitiert ist. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten und Erkenntnisse tragen dazu bei, das Verst{\"a}ndnis der Funktion und Regulation von Calcineurin in T-Zellen zu vertiefen.}, language = {de} } @phdthesis{Andres2008, author = {Andres, Janin}, title = {Untersuchungen {\"u}ber Regulationsmechanismen der 11beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-33033}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2008}, abstract = {Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellul{\"a}r die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquit{\"a}r exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber f{\"u}hrte eine erh{\"o}hte Aktivit{\"a}t aufgrund einer {\"U}berexpression in M{\"a}usen zu einer verst{\"a}rkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erh{\"o}hte Expression und erh{\"o}hte Enzymaktivit{\"a}t der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipid{\"a}mie. {\"U}ber die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivit{\"a}t wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgew{\"a}hlte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fetts{\"a}uren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abh{\"a}ngig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fetts{\"a}uren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivit{\"a}t der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalit{\"a}t analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und K{\"o}rpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine m{\"o}gliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivit{\"a}t und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Ph{\"a}notyp, jedoch Tendenzen f{\"u}r eine erh{\"o}htes K{\"o}rper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abh{\"a}ngigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen n{\"a}her charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche best{\"a}tigt und n{\"a}her charakterisiert werden konnten.}, language = {de} } @phdthesis{Sureshkumar2023, author = {Sureshkumar, Priyavathi}, title = {Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System f{\"u}r die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkan{\"a}le}, doi = {10.25932/publishup-61987}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {x, 110}, year = {2023}, abstract = {Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als g{\"a}ngige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten f{\"u}r das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkan{\"a}le sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der {\"U}berexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten k{\"o}nnen, wie z. B. Zelltoxizit{\"a}t, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund ver{\"a}nderter Dom{\"a}nen sowie die zeitaufw{\"a}ndige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkan{\"a}len in zellfreien Proteinsyntheseplattformen f{\"u}r das k{\"u}nftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung f{\"u}r die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkan{\"a}len in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ {\"u}berexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkan{\"a}len (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie {\"u}berexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) {\"u}ber Mas und die Beteiligung von TRP-Kan{\"a}len nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode f{\"u}r chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran f{\"u}r die Integration synthetisierter Ionenkan{\"a}le in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkan{\"a}le zu untersuchen. Die Enzymaktivit{\"a}t der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkan{\"a}le wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkan{\"a}le zu analysieren. Nach entsprechender Forschung k{\"o}nnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkan{\"a}le wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkan{\"a}le.}, language = {de} } @phdthesis{Radon2017, author = {Radon, Christin}, title = {Analyse der Funktion der dualen Lokalisation der 3-Mercaptopyruvat Sulfurtransferase im Menschen}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {123}, year = {2017}, language = {de} } @phdthesis{Schroeder2015, author = {Schr{\"o}der, Christine}, title = {Identifizierung und Charakterisierung der Isoflavon-umsetzenden Enzyme aus dem humanen Darmbakterium Slackia isoflavoniconvertens}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-80065}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {X, 129}, year = {2015}, abstract = {Aufgrund ihrer potenziell gesundheitsf{\"o}rdernden Wirkung sind die polyphenolischen Isoflavone f{\"u}r die menschliche Ern{\"a}hrung von großem Interesse. Eine Vielzahl an experimentellen und epidemiologischen Studien zeigen f{\"u}r die in Soja enthaltenen Isoflavone Daidzein und Genistein eine pr{\"a}ventive Wirkung bez{\"u}glich hormon-abh{\"a}ngiger und altersbedingter Erkrankungen, wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie des menopausalen Syndroms. Die Metabolisierung und Bioaktivierung dieser sekund{\"a}ren Pflanzenstoffe durch die humane intestinale Darmmikrobiota ist individuell unterschiedlich. Nur in einem geringen Teil der westlichen Bev{\"o}lkerung wird der Daidzein-Metabolit Equol durch spezifische Darmbakterien gebildet. Ein isoliertes Equol-produzierendes Bakterium des menschlichen Darmtrakts ist Slackia isoflavoniconvertens. Anhand dieser Spezies sollten die bislang unbekannten, an der Umsetzung von Daidzein und Genistein beteiligten Enzyme identifiziert und charakterisiert werden. Fermentationsexperimente mit S. isoflavoniconvertens zeigten, dass die Gene der Daidzein und Genistein-umsetzenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern induziert werden m{\"u}ssen. Mit Hilfe der zweidimensionalen differentiellen Gelelektrophorese wurden sechs Proteine detektiert, welche in einer S. isoflavoniconvertens-Kultur in Anwesenheit von Daidzein induziert wurden. Auf Grundlage einzelner Peptidsequenzen erfolgte die Sequenzierung eines Genkomplexes mit den in gleicher Orientierung angeordneten Genen der durch Daidzein induzierten Proteine. Sequenzvergleiche identifizierten zudem {\"a}quivalente Genprodukte zu den Proteinen von S. isoflavoniconvertens in anderen Equolproduzierenden Bakterien. Nach der heterologen Expression in Escherichia coli wurden drei dieser Gene durch enzymatische Aktivit{\"a}tstests als Daidzein-Reduktase (DZNR), Dihydrodaidzein-Reduktase (DHDR) und Tetrahydrodaidzein-Reduktase (THDR) identifiziert. Die Kombination der E. coli-Zellextrakte f{\"u}hrte zur vollst{\"a}ndigen Umsetzung von Daidzein {\"u}ber Dihydrodaidzein zu Equol. Neben Daidzein setzte die DZNR auch Genistein zu Dihydrogenistein um. Dies erfolgte mit einer gr{\"o}ßeren Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zur Reduktion von Daidzein zu Dihydrodaidzein. Enzymatische Aktivit{\"a}tstests mit dem Zellextrakt von S. isoflavoniconvertens zeigten ebenfalls eine schnellere Umsetzung von Genistein. Die Kombination der rekombinanten DHDR und THDR f{\"u}hrte zur Umsetzung von Dihydrodaidzein zu Equol. Der korrespondierende Metabolit 5-Hydroxyequol konnte als Endprodukt des Genistein-Metabolismus nicht detektiert werden. Zur Reinigung der drei identifizierten Reduktasen wurden diese genetisch an ein Strep-tag fusioniert und mittels Affinit{\"a}tschromatographie gereinigt. Die {\"u}brigen durch Daidzein induzierten Proteine IfcA, IfcBC und IfcE wurden ebenfalls in E. coli exprimiert und als Strep-Fusionsproteine gereinigt. Vergleichende Aktivit{\"a}tstests identifizierten das induzierte Protein IfcA als Dihydrodaidzein-Racemase. Diese katalysierte die Umsetzung des (R)- und (S)-Enantiomers von Dihydrodaidzein und Dihydrogenistein zum korrespondierenden Racemat. Neben dem Elektronentransfer-Flavoprotein IfcBC wurden auch die THDR, DZNR und IfcE als FAD-haltige Flavoproteine identifiziert. Zudem handelte es sich bei IfcE um ein Eisen-Schwefel-Protein. Nach Induktion der f{\"u}r die Daidzein-Umsetzung kodierenden Gene wurden mehrere verschieden lange mRNA-Transkripte gebildet. Dies zeigte, dass die Transkription des durch Daidzein induzierten Genkomplexes in S. isoflavoniconvertens nicht in Form eines einzelnen Operonsystems erfolgte. Auf Grundlage der identifizierten Daidzein-umsetzenden Enzyme kann der Mechanismus der bakteriellen Umsetzung von Isoflavonen durch S. isoflavoniconvertens eingehend erforscht werden. Die ermittelten Gensequenzen der durch Daidzein induzierten Proteine sowie die korrespondierenden Gene weiterer Equol-produzierender Bakterien bieten zudem die M{\"o}glichkeit der mikrobiellen Metagenomanalyse im humanen Darmtrakt.}, language = {de} } @phdthesis{Gottmann2019, author = {Gottmann, Pascal}, title = {In silico Analyse zur Kl{\"a}rung der Beteiligung von micro-RNAs, die in QTL lokalisiert sind, an den metabolischen Erkrankungen Adipositas und Typ-2-Diabetes mit Hilfe von Mausmodellen}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XIII, 106}, year = {2019}, language = {de} }