@phdthesis{Riedel2011,
  author    = {Riedel, Katja},
  title     = {Elucidation of the epithelial sodium channel as a salt taste receptor candidate and search for novel salt taste receptor candidates},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-58764},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2011},
  abstract  = {Salty taste has evolved to maintain electrolyte homeostasis, serving as a detector for salt containing food. In rodents, salty taste involves at least two transduction mechanisms. One is sensitive to the drug amiloride and specific for Na+, involving epithelial sodium channel (ENaC). A second rodent transduction pathway, which is triggered by various cations, is amiloride insensitive and not almost understood to date. Studies in primates showed amiloride-sensitive as well as amiloride-insensitive gustatory responses to NaCl, implying a role of both salt taste transduction pathways in humans. However, sensory studies in humans point to largely amiloride-insensitive sodium taste perception. An involvement of ENaC in human sodium taste perception was not shown, so far. In this study, ENaC subunit protein and mRNA could be localized to human taste bud cells (TBC). Thus, basolateral αβγ-ENaC ion channels are likely in TBC of circumvallate papillae, possibly mediating basolateral sodium entry. Similarly, basolateral βγ-ENaC might play a role in fungiform TBC. Strikingly, δ-ENaC subunit was confined to taste bud pores of both papillae, likely mediating gustatory sodium entry in TBC, either apical or paracellular via tight junctions. However, regional separation of δ-ENaC and βγ-ENaC in fungiform and circumvallate TBC indicate the presence of unknown interaction partner necessary to assemble into functional ion channels. However, screening of a macaque taste tissue cDNA library did neither reveal polypeptides assembling into a functional cation channel by interaction with δ-ENaC or βγ-ENaC nor ENaC independent salt taste receptor candidates. Thus, ENaC subunits are likely involved in human taste transduction, while exact composition and identity of an amiloride (in)sensitive salt taste receptors remain unclear. Localization of δ-ENaC in human taste pores strongly suggests a role in human taste transduction. In contrast, δ-ENaC is classified as pseudogene Scnn1d in mouse. However, no experimental detected sequences are annotated, while evidences for parts of Scnn1d derived mRNAs exist. In order to elucidate if Scnn1d is possibly involved in rodent salt taste perception, Scnn1d was evaluated in this study to clarify if Scnn1d is a gene or a transcribed pseudogene in mice. Comparative mapping of human SCNN1D to mouse chromosome 4 revealed complete Scnn1d sequence as well as its pseudogenization by Mus specific endogenous retroviruses. Moreover, tissue specific transcription of unitary Scnn1d pseudogene was found in mouse vallate papillae, kidney and testis and led to identification of nine Scnn1d transcripts. In vitro translation experiments showed that Scnn1d transcripts are coding competent for short polypeptides, possibly present in vivo. However, no sodium channel like function or sodium channel modulating activity was evident for Scnn1d transcripts and/or derived polypeptides. Thus, an involvement of mouse δ-ENaC in sodium taste transduction is unlikely and points to species specific differences in salt taste transduction mechanisms.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Lossow2011,
  author    = {Loßow, Kristina},
  title     = {Erzeugung und Charakterisierung von Mausmodellen mit lichtsensitivem Geschmackssystem zur Aufkl{\"a}rung der neuronalen Geschmackskodierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-58059},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2011},
  abstract  = {Die Wahrnehmung von Geschmacksempfindungen beruht auf dem Zusammenspiel verschiedener Sinneseindr{\"u}cke wie Schmecken, Riechen und Tasten. Diese Komplexit{\"a}t der gustatorischen Wahrnehmung erschwert die Beantwortung der Frage wie Geschmacksinformationen vom Mund ins Gehirn weitergeleitet, prozessiert und kodiert werden. Die Analysen zur neuronalen Prozessierung von Geschmacksinformationen erfolgten zumeist mit Bitterstimuli am Mausmodell. Zwar ist bekannt, dass das Genom der Maus f{\"u}r 35 funktionelle Bitterrezeptoren kodiert, jedoch war nur f{\"u}r zwei unter ihnen ein Ligand ermittelt worden. Um eine bessere Grundlage f{\"u}r tierexperimentelle Arbeiten zu schaffen, wurden 16 der 35 Bitterrezeptoren der Maus heterolog in HEK293T-Zellen exprimiert und in Calcium-Imaging-Experimenten funktionell charakterisiert. Die Daten belegen, dass das Funktionsspektrum der Bitterrezeptoren der Maus im Vergleich zum Menschen enger ist und widerlegen damit die Aussage, dass humane und murine orthologe Rezeptoren durch das gleiche Ligandenspektrum angesprochen werden. Die Interpretation von tierexperimentellen Daten und die {\"U}bertragbarkeit auf den Menschen werden folglich nicht nur durch die Komplexit{\"a}t des Geschmacks, sondern auch durch Speziesunterschiede verkompliziert. Die Komplexit{\"a}t des Geschmacks beruht u. a. auf der Tatsache, dass Geschmacksstoffe selten isoliert auftreten und daher eine Vielzahl an Informationen kodiert werden muss. Um solche geschmacksstoffassoziierten Stimuli in der Analyse der gustatorischen Kommunikationsbahnen auszuschließen, sollten Opsine, die durch Licht spezifischer Wellenl{\"a}nge angeregt werden k{\"o}nnen, f{\"u}r die selektive Ersetzung von Geschmacksrezeptoren genutzt werden. Um die Funktionalit{\"a}t dieser angestrebten Knockout-Knockin-Modelle zu evaluieren, die eine Kopplung von Opsinen mit dem geschmacksspezifischen G-Protein Gustducin voraussetzte, wurden Oozyten vom Krallenfrosch Xenopus laevis mit dem Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Verfahren hinsichtlich dieser Interaktion analysiert. Der positiven Bewertung dieser Kopplung folgte die Erzeugung von drei Mauslinien, die in der kodierenden Region eines spezifischen Geschmacksrezeptors (Tas1r1, Tas1r2, Tas2r114) Photorezeptoren exprimierten. Durch RT-PCR-, In-situ-Hybridisierungs- und immunhistochemische Experimente konnte der erfolgreiche Knockout der Rezeptorgene und der Knockin der Opsine belegt werden. Der Nachweis der Funktionalit{\"a}t der Opsine im gustatorischen System wird Gegenstand zuk{\"u}nftiger Analysen sein. Bei erfolgreichem Beleg der Lichtempfindlichkeit von Geschmacksrezeptorzellen dieser Mausmodelle w{\"a}re ein System geschaffen, dass es erm{\"o}glichen w{\"u}rde, gustatorische neuronale Netzwerke und Hirnareale zu identifizieren, die auf einen reinen geschmacks- und qualit{\"a}tsspezifischen Stimulus zur{\"u}ckzuf{\"u}hren w{\"a}ren.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schatz2011,
  author    = {Schatz, Daniela},
  title     = {LNA-clamp-PCR zum sensitiven Nachweis von Punktmutationen im Rahmen der Entwicklung eines Darmkrebsfr{\"u}herkennungstests},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-52308},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2011},
  abstract  = {Darmkrebs ist die zweith{\"a}ufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industriel{\"a}ndern. Durch eine fr{\"u}hzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfr{\"u}herkennung ist gegenw{\"a}rtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten f{\"u}r den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bev{\"o}lkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Fr{\"u}herkennung von humanem Darmkrebs", in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfr{\"u}herkennung. Der Nachweis soll {\"u}ber die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Ver{\"a}nderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivit{\"a}t f{\"u}r Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode f{\"u}r die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme f{\"u}r die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt f{\"u}r die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtyp{\"u}berschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte {\"u}ber das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit f{\"u}r die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgef{\"u}hrt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erh{\"o}hte Affinit{\"a}t zu komplement{\"a}ren DNA-Str{\"a}ngen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer gr{\"o}ßeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich {\"u}berspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation w{\"a}hrend der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verl{\"a}ngert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegen{\"u}ber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde f{\"u}r BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich f{\"u}r BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1\% bis 0,1\% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit f{\"u}r die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. F{\"u}r die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die {\"u}brigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingef{\"u}hrt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kosteng{\"u}nstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranf{\"a}llig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren f{\"u}r Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfr{\"u}herkennung. Dar{\"u}ber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden.},
  language  = {de}
}