@phdthesis{Schaefer2024,
  author    = {Sch{\"a}fer, Marj{\"a}nn Helena},
  title     = {Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei S{\"a}ugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-M{\"a}usen mit humanisierter Reaktionsspezifit{\"a}t der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b)},
  doi       = {10.25932/publishup-62034},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XVII, 280},
  year      = {2024},
  abstract  = {Arachidons{\"a}urelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. F{\"u}r jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr {\"a}hnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabh{\"a}ngigkeit der enzymatischen Eigenschaften von S{\"a}ugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzh{\"o}rnchen (Tupaiidae) sind evolution{\"a}r n{\"a}her mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle f{\"u}r die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidons{\"a}urestoffwechsel von Spitzh{\"o}rnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften {\"a}hneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei M{\"a}usen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel f{\"u}r die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese k{\"o}nnen S{\"a}ugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidons{\"a}ure-12-lipoxygenierende- und Arachidons{\"a}ure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren S{\"a}ugetierspezies, die einen h{\"o}heren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidons{\"a}ure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, w{\"a}hrend evolution{\"a}r weniger weit entwickelte S{\"a}ugetiere Arachidons{\"a}ure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse f{\"u}gen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten best{\"a}tigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, k{\"o}nnen Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen {\"u}bertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in M{\"a}use durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparagins{\"a}ure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese M{\"a}use waren lebens- und fortpflanzungsf{\"a}hig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entz{\"u}ndungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entz{\"u}ndungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entz{\"u}ndungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b f{\"u}hrte zu einer verst{\"a}rkten Ausbildung von Entz{\"u}ndungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschw{\"a}chung der Entz{\"u}ndungssymptome im Freund'schen Adjuvans Pfoten{\"o}demmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entz{\"u}ndungsmodellen unterscheidet.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Sureshkumar2023,
  author    = {Sureshkumar, Priyavathi},
  title     = {Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System f{\"u}r die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkan{\"a}le},
  doi       = {10.25932/publishup-61987},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {x, 110},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als g{\"a}ngige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten f{\"u}r das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkan{\"a}le sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der {\"U}berexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten k{\"o}nnen, wie z. B. Zelltoxizit{\"a}t, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund ver{\"a}nderter Dom{\"a}nen sowie die zeitaufw{\"a}ndige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkan{\"a}len in zellfreien Proteinsyntheseplattformen f{\"u}r das k{\"u}nftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung f{\"u}r die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkan{\"a}len in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ {\"u}berexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkan{\"a}len (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie {\"u}berexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) {\"u}ber Mas und die Beteiligung von TRP-Kan{\"a}len nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode f{\"u}r chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran f{\"u}r die Integration synthetisierter Ionenkan{\"a}le in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkan{\"a}le zu untersuchen. Die Enzymaktivit{\"a}t der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkan{\"a}le wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkan{\"a}le zu analysieren. Nach entsprechender Forschung k{\"o}nnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkan{\"a}le wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkan{\"a}le.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Geisendoerfer2022,
  author    = {Geisend{\"o}rfer, Birte},
  title     = {Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden f{\"u}r die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {166},
  year      = {2022},
  abstract  = {Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Pr{\"a}valenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivit{\"a}tsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, R{\"o}tung, Bl{\"a}schenbildung und Absch{\"a}lung der Haut {\"a}ußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszul{\"o}sen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eind{\"a}mmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD ver{\"o}ffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Pr{\"u}fung auf hautsensibilisierendes Potenzial war {\"u}ber lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. {\"A}nderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche f{\"u}r Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekr{\"a}ftig, da sie lediglich singul{\"a}re Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schl{\"u}sselereignisse ber{\"u}cksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus prim{\"a}ren Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ans{\"a}tzen verglichen. Zus{\"a}tzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgef{\"u}hrt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos m{\"o}glich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell prim{\"a}rer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zus{\"a}tzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll f{\"u}hrte zu einer maßgeblich verst{\"a}rkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Molek{\"u}ls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ans{\"a}tzen durchgef{\"u}hrt. {\"A}hnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkultur{\"u}berstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, best{\"a}tigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. {\"U}berraschenderweise traten auch hier keine verst{\"a}rkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Prim{\"a}rzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern d{\"u}rfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung prim{\"a}rer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgef{\"u}hrt, wobei autologe MoLC in die Epidermis{\"a}quivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Tanner2022,
  author    = {Tanner, Norman},
  title     = {Methoden zur routinem{\"a}ßigen Untersuchung von Bienenprodukten mittels Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {VI, 194},
  year      = {2022},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wetzel2022,
  author    = {Wetzel, Alexandra},
  title     = {Epigenetische Regulation des Epstein-Barr Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) und dessen Bedeutung bei Colitis ulcerosa},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {164},
  year      = {2022},
  abstract  = {Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entz{\"u}ndungen erniedrigt sind. Eine m{\"o}gliche Ursache k{\"o}nnte eine transkriptionelle Stilllegung {\"u}ber epigenetische Modifikationen sein. Tats{\"a}chlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell f{\"u}r ein lokales Entz{\"u}ndungsgeschehen dienten. Diese Regulation {\"u}ber DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem nat{\"u}rlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer {\"u}ber-additiven Induktion von EBI3. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte dar{\"u}ber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation haupts{\"a}chlich {\"u}ber NFκB (Nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verl{\"a}uft dabei {\"u}ber p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), w{\"a}hrend die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung w{\"a}hrend eines entz{\"u}ndlichen Zustandes auch in einer erh{\"o}hten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die H{\"o}he der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im {\"U}berstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als m{\"o}gliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antik{\"o}rper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht m{\"o}glich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz f{\"u}r die problematischen Antik{\"o}rper-basierten Analysen wie Immunpr{\"a}zipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, w{\"a}hrend IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivit{\"a}t des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen. Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 {\"u}ber Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. {\"A}hnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte. Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten M{\"a}usen und dem dazugeh{\"o}rigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalit{\"a}tsrate und K{\"o}rper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant st{\"a}rkere colitische Symptome auf. Dies best{\"a}tigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zus{\"a}tzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-M{\"a}use nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation best{\"a}tigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsph{\"a}notyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht. Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-M{\"a}use mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse {\"u}ber die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome {\"u}ber einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der st{\"a}rkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 {\"u}ber DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und -Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative f{\"u}r die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer {\"u}berm{\"a}ßigen Immunantwort w{\"a}hrend schubweiser entz{\"u}ndlicher Phasen k{\"o}nnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Steppert2022,
  author    = {Steppert, Isabel},
  title     = {Entwicklung einer nichtinvasiven Diagnostikmethode zum Nachweis von Infektionserregern},
  doi       = {10.25932/publishup-57544},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-575441},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XIV, 101, LVIII},
  year      = {2022},
  abstract  = {Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten k{\"o}nnen. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch fr{\"u}hzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen. Herk{\"o}mmliche kulturelle Verfahren ben{\"o}tigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern f{\"u}r Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren ben{\"o}tigt. Im klassischen Griechenland verließen sich die {\"A}rzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Ger{\"u}che sind fl{\"u}chtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren. Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilit{\"a}tsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographies{\"a}ule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verl{\"a}ssliche Methode handelt. Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Ger{\"u}che produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden k{\"o}nnen. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen. Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen {\"u}berpr{\"u}ft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden. Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Ver{\"a}nderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden k{\"o}nnen. Zur {\"U}berpr{\"u}fung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden. Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Demin2022,
  author    = {Demin, Paul},
  title     = {Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae},
  doi       = {10.25932/publishup-55969},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {127},
  year      = {2022},
  abstract  = {Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie nat{\"u}rliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedom{\"a}ne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdom{\"a}ne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den nat{\"u}rlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedom{\"a}ne als auch die Aktivierungsdom{\"a}ne wirtsfremd sein k{\"o}nnen und dadurch k{\"u}nstliche Stoffwechselwege im Wirt, gr{\"o}ßtenteils chemisch, induziert werden k{\"o}nnen. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedom{\"a}ne nicht mehr an die Aktivierungsdom{\"a}ne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdom{\"a}ne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Dom{\"a}nen, sodass ein funktionsf{\"a}higer Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedom{\"a}ne, die Aktivierungsdom{\"a}ne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedom{\"a}ne anlagert, ver{\"a}ndert wurden. Um das System f{\"u}r industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pitzen2022,
  author    = {Pitzen, Valentin},
  title     = {Weitergef{\"u}hrte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Am{\"o}ben},
  doi       = {10.25932/publishup-54889},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XI, 104},
  year      = {2022},
  abstract  = {Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriol{\"a}r aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und m{\"o}gliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es w{\"a}hrend der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am st{\"a}rksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen w{\"a}hrend der Mitose wird f{\"u}r Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten {\"a}ußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 f{\"u}hrte zur Ausbildung von {\"u}berz{\"a}hligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erh{\"o}hten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochaufl{\"o}sende Expansion Microscopy f{\"u}r das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den {\"a}ußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in r{\"a}umlicher N{\"a}he zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als m{\"o}glicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und erm{\"o}glichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verst{\"a}ndnis der Topologie des Centrosoms.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ramm2022,
  author    = {Ramm, Timo},
  title     = {Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antik{\"o}rper-Charakterisierung und Validierung},
  doi       = {10.25932/publishup-56153},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XIV, 138},
  year      = {2022},
  abstract  = {Antik{\"o}rper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antik{\"o}rpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegen{\"u}ber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abh{\"a}ngigkeit des Einsatzes, der Antik{\"o}rper, f{\"u}r den gew{\"u}nschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu k{\"o}nnen. Daf{\"u}r wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antik{\"o}rper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminos{\"a}uren auf die Bindung des Antik{\"o}rpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antik{\"o}rperbindungsverhalten in Abh{\"a}ngigkeit der Aminos{\"a}ure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antik{\"o}rpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antik{\"o}rper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antik{\"o}rper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Daf{\"u}r wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden k{\"o}nnen. F{\"u}r die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor s{\"a}mtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antik{\"o}rpern sowie ihre Validierung f{\"u}r verschiedene Testsysteme.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Qin2022,
  author    = {Qin, Miaojing},
  title     = {The role of heat shock proteins (HSP23s and HSP70-4) for heat stress memory in plants},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {138},
  year      = {2022},
  abstract  = {Heat is a significant climatic condition that threatens crop growth and survival. Extreme temperature occurrences in nature are becoming more severe, more frequent and longer-lasting, all of which have deleterious repercussions for agricultural production. As a result, it is critical to learn more about the mechanisms that lead to increased heat tolerance in plants. To endure and survive, higher plants have evolved complex mechanisms to respond to various amounts of heat stress. Plants have a thermal tolerance that permits them to survive rapid and dramatic temperature rises for a limited time. Plants can also be primed to withstand heat stress (HS) that would otherwise be lethal by exposing them to short, moderate, and non-lethal HS (referred to as a priming stimulus) before being exposed to severe HS. A prepared acquired thermotolerance in primed plants can be maintained for a long time under optimal circumstances, implying that plants can store information during this period. Several studies have shown that acquired thermotolerance (thermopriming) refers to the increased resistance of cells, tissues, and organisms to elevated temperatures after prior heat exposure. Maintenance of acquired thermotolerance (thermomemory) is associated with the synthesis of specialized stress proteins involved in cellular protection and accelerated tissue repair, such as heat shock proteins (HSPs). Recent studies showed a main role of heat shock proteins for turnover of protein quality components, e.g. HSP21 in the chloroplast in the regulation of thermomemory. As an important organelle, mitochondrial function is critical for plant cell responses to heat. However, it is still unknown what the molecular and physiological involvement of HSPs is in mitochondrial function and thermomemory. In our study, we showed that thermopriming induces transcript and protein levels of two mitochondrial small heat shock proteins, HSP23.5 (AT5G51440) and HSP23.6 (AT4G25200), which last for 2-3 days throughout the thermomemory phase. The morphological analysis of HSP23.5/6 transgenic plants demonstrated HSP23.5/6 function redundantly in heat stress. We showed that hsp23.5/6 double knockout plants had abnormalities in thermomemory at the seedling stage, and that mature hsp23.5/6 4 plants are more sensitive to both basal thermotolerance and thermomemory. Heat treatment significantly impacted the respiration rate of hsp23.5/6 seedlings compared to WT, indicating mitochondrial dysfunction dependent on HSP23.5 and HSP23.6. In addition, we tested and confirmed the chaperone activity of HSP23.6 toward the model substrate protein malate dehydrogenase (MDH) in vitro, indicating that HSP23.6 potentially contributes to the maintenance of cellular viability. Furthermore, we discovered a novel HSP23.6 client protein, CIB22, a mitochondrial complex-I subunit protein. According to experimental data (BiFC and Co-IP), HSP23.6 and CIB22 interact in plant cells. We also identified a heat response phenotype in the cib22 mutant compared to WT, as well as CIB22 protein degradation in the hsp23.5/6 mutant when exposed to heat. Our findings suggest that the two mitochondrial-localized heat shock proteins play a role in thermotolerance, presumably by influencing mitochondrial function and structure. More broadly, to identify novel genetic components associated with thermomemory in plants, we performed proteome profiling for Arabidopsis WT (Col-0) seedlings during thermomemory. Multiple time point samples of priming and triggering with controls were collected and analyzed to reveal the dynamic proteome changes during the memory phase in Arabidopsis cells. Among the top memory-associated proteins, we discovered that HSP70-4 was significantly upregulated after priming and remains high (at least 2-fold) for the next four days. By morphologically analyzing their heat stress behaviors, we were able to verify that HSP70-4 is involved in plant heat stress response. More intriguingly, we discovered that following priming, HSP70-4-GFP creates cytosolic foci that persist for a few days into the recovery period. We propose that these foci are linked to SGs due to cycloheximide (CHX) repressing the GFP-foci signal when exposed to heat. These findings indicate an HSP70-4-mediated transcription and translation control link (module) during basal thermotolerance and thermomemory, as well as its potential role(s) in heat stress response. To summarize, our research provides new insight into the role of heat shock proteins in controlling heat stress tolerance and memory.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nieschalke2021,
  author    = {Nieschalke, Kai},
  title     = {Proteinaddukte und Urinmetaboliten des Nagetierkanzerogens Methyleugenol als Biomarker der Exposition},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {142, XLIV},
  year      = {2021},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Raffeiner2021,
  author    = {Raffeiner, Margot},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung des Xanthomonas Typ-III Effektorproteins XopS},
  doi       = {10.25932/publishup-52553},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525532},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {IX, 185},
  year      = {2021},
  abstract  = {Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdr{\"u}cken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort st{\"o}ren diese die Immunantwort des Wirts oder f{\"o}rdern die Etablierung einer f{\"u}r das Pathogen g{\"u}nstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunit{\"a}t gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu st{\"o}ren. Die Aufkl{\"a}rung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv w{\"a}hrend der pr{\"a}invasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfl{\"a}che suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abh{\"a}ngigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die pr{\"a}-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen w{\"a}hrend des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis f{\"u}hrte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmons{\"a}ure (JA), w{\"a}hrend eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicyls{\"a}ure (SA)-Gehalts f{\"u}hrte. So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv f{\"o}rdert, indem JA-abh{\"a}ngige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdr{\"u}ckung SA-abh{\"a}ngiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erh{\"o}hte die Toleranz der Pflanze gegen{\"u}ber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier {\"u}ber verschiedene experimentelle Ans{\"a}tze bekr{\"a}ftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abh{\"a}ngigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gew{\"a}hrleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 {\"u}ber das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter best{\"a}tigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins f{\"u}hrt, indem er auf bislang ungekl{\"a}rte Weise dessen Abbau {\"u}ber das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu f{\"u}hrt, dass eine dar{\"u}ber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen f{\"o}rdert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die f{\"u}r seine Interaktion mit WRKY40 bzw. f{\"u}r die Aufschl{\"u}sselung seines Wirkmechanismus relevant sein k{\"o}nnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion k{\"o}nnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. W{\"a}hrend einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion f{\"u}hrte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegen{\"u}ber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung w{\"a}hrend der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zus{\"a}tzlich verst{\"a}rkt wird. Weiterf{\"u}hrende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgef{\"u}hrt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschl{\"u}sseln.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Finke2020,
  author    = {Finke, Hannah},
  title     = {Toxicological Characterization of Arsenolipids in vitro and Analysis of Global DNA (Hydroxy)methylation in the Context of Aging, Trace Element Status, and Genomic Stability},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {t, 222, XXVII},
  year      = {2020},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zemella2019,
  author    = {Zemella, Anne},
  title     = {Fluoreszenzmarkierung und Modifizierung von komplexen Proteinen in eukaryotischen zellfreien Systemen durch die Etablierung von orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paaren},
  doi       = {10.25932/publishup-44236},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-442361},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XI, 141},
  year      = {2019},
  abstract  = {Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in ad{\"a}quaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren k{\"o}nnen. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abh{\"a}ngige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. F{\"u}r diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, k{\"o}nnten diese zuk{\"u}nftig in zellfreien Systemen f{\"u}r die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden k{\"o}nnen. Neben der reinen Proteinherstellung k{\"o}nnen Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, f{\"u}r den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden. Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminos{\"a}ure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zus{\"a}tzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminos{\"a}ure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders f{\"u}r eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformations{\"a}nderung im Adora2a {\"u}ber einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde dar{\"u}ber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilit{\"a}t und Halbwertszeit des Proteins ver{\"a}ndert wurden. Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminos{\"a}uren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue M{\"o}glichkeiten f{\"u}r die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schwuchow2019,
  author    = {Schwuchow, Viola},
  title     = {Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd-Oxidoreduktase (PaoABC) aus Escherichia coli},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {119},
  year      = {2019},
  abstract  = {Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Analysen zur Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd Oxidoreduktase aus E. coli. Kinetische Untersuchungen mit Ferricyanid als Elektronenakzeptor unter anaeroben Bedingungen zeigten f{\"u}r dieses Enzym eine h{\"o}here Aktivit{\"a}t als unter aeroben Bedingungen. Die getroffene Hypothese, dass PaoABC f{\"a}hig ist Elektronen an molekularen Sauerstoff weiter zu geben, konnte best{\"a}tigt werden. F{\"u}r den Umsatz aromatischer Aldehyde mit molekularem Sauerstoff wurde ein Optimum von pH 6,0 ermittelt. Dies steht im Gegensatz zur Reaktion mit Ferricyanid, mit welchem ein pH-Optimum von 4,0 gezeigt wurde. Die Reaktion von PaoABC mit molekularem Sauerstoff generiert zwar Wasserstoffperoxid, die Produktion von Superoxid konnte dagegen nicht beobachtet werden. Dass aerobe Bedingungen einen Einfluss auf das Ausl{\"o}sen der Expression von PaoABC haben, wurde in dieser Arbeit ebenfalls ermittelt. Im Zusammenhang mit der Produktion von ROS durch PaoABC wurde die Funktion eines k{\"u}rzlich in Elektronentransfer-Distanz zum FAD identifizierten [4Fe4S]-Clusters untersucht. Ein Austausch der f{\"u}r die Bindung des Clusters zust{\"a}ndigen Cysteine f{\"u}hrte zur Instabilit{\"a}t der Proteinvarianten, weswegen f{\"u}r diese keine weiteren Untersuchungen erfolgten. Daher wird zumindest ein struktur-stabilisierender Einfluss des [4Fe4S]-Clusters angenommen. Zur weiteren Untersuchung der Funktion dieses Clusters, wurde ein zwischen FAD und [4Fe4S]-Cluster lokalisiertes Arginin gegen ein Alanin ausgetauscht. Diese Proteinvariante zeigte eine reduzierte Geschwindigkeit der Reaktion gegen{\"u}ber dem Wildtyp. Die Bildung von Superoxid konnte auch hier nicht beobachtet werden. Die Vermutung, dass dieser Cluster einen elektronen-sammelnden Mechanismus unterst{\"u}tzt, welcher die Radikalbildung verhindert, kann trotz allem nicht ausgeschlossen werden. Da im Umkreis des Arginins weitere geladene und aromatische Aminos{\"a}uren lokalisiert sind, k{\"o}nnen diese den notwendigen Elektronentransfer {\"u}bernehmen. Neben der Ermittlung eines physiologischen Elektronenakzeptors und dessen Einfluss auf die Expression von PaoABC zeigt diese Arbeit auch, dass die Chaperone PaoD und MocA w{\"a}hrend der Reifung des MCD-Kofaktor eine gemeinsame Bindung an PaoABC realisieren. Es konnte im aktiven Zentrum von PaoABC ein Arginin beschrieben werden, welches auf Grund der engen Nachbarschaft zum MCD-Kofaktor und zum Glutamat (PaoABC-EC692) am Prozess der Substratbindung beteiligt ist. Im Zusammenhang mit dem Austausch dieses Arginins gegen ein Histidin oder ein Lysin wurden die Enzymspezifit{\"a}t und der Einfluss physiologischer Bedingungen, wie pH und Ionenst{\"a}rke, auf die Reaktion des Enzyms untersucht. Gegen{\"u}ber dem Wildtyp zeigten die Varianten mit molekularem Sauerstoff eine geringere Affinit{\"a}t zum Substrat aber auch eine h{\"o}here Geschwindigkeit der Reaktion. Vor allem f{\"u}r die Histidin-Variante konnte im gesamten pH-Bereich ein instabiles Verhalten bestimmt werden. Der Grund daf{\"u}r wurde durch das L{\"o}sen der Struktur der Histidin-Variante beschreiben. Durch den Austausch der Aminos{\"a}uren entf{\"a}llt die stabilisierende Wirkung der delokalisierten Elektronen des Arginins und es kommt zu einer Konformations{\"a}nderung im aktiven Zentrum. Neben der Reaktion von PaoABC mit einer Vielzahl aromatischer Aldehyde konnte auch der Umsatz von Salicylaldehyd zu Salicyls{\"a}ure durch PaoABC in einer Farbreaktion bestimmt werden. Durch Ausschluss von molekularem Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor, in einer enzym-gekoppelten Reaktion, erfolgte ein Elektronentransport auf Ferrocencarboxyls{\"a}ure. Die Kombination aus beiden Methoden erm{\"o}glichte eine Verwendung von Ferrocen-Derivaten zur Generierung einer enzym-gekoppelten Reaktion mit PaoABC. Die Untersuchungen zu PaoABC zeigen, dass die Vielfalt der durch das Enzym katalysierten Rektionen weitere M{\"o}glichkeiten der enzymatischen Bestimmung biokatalytischer Prozesse bietet.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gottmann2019,
  author    = {Gottmann, Pascal},
  title     = {In silico Analyse zur Kl{\"a}rung der Beteiligung von micro-RNAs, die in QTL lokalisiert sind, an den metabolischen Erkrankungen Adipositas und Typ-2-Diabetes mit Hilfe von Mausmodellen},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XIII, 106},
  year      = {2019},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Danckert2018,
  author    = {Danckert, Lena},
  title     = {Immunscreening Virulenz-adaptierter Expressionsbibliotheken aus einem in vitro Infektionsmodell mit Salmonella Enteritidis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421108},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {144},
  year      = {2018},
  abstract  = {Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere f{\"u}r Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei geh{\"o}ren Salmonella und Campylobacter zu den h{\"a}ufigsten Erregern, die verantwortlich f{\"u}r gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Pr{\"a}vention und Bek{\"a}mpfung von Salmonellen in Gefl{\"u}gelbest{\"a}nden und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen k{\"o}nnen {\"u}ber Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten k{\"o}nnen. Dabei sind bestehende Pr{\"a}ventionsstrategien f{\"u}r Gefl{\"u}gel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen {\"u}bertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Pr{\"a}vention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf f{\"u}r spezifische, sensitive und zuverl{\"a}ssige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gew{\"a}hrleisten. Durch ein wachsendes Verst{\"a}ndnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektions{\"a}hnliches in vitro Modell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r den Erreger durchgef{\"u}hrt. W{\"a}hrend einer Salmonellen-Infektion ist die erste zellul{\"a}re Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) f{\"u}r die Pathogen-Wirt-Studie ausgew{\"a}hlt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Ph{\"a}notyp f{\"u}r die intrazellul{\"a}ren Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Fl{\"u}ssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zus{\"a}tzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adh{\"a}sion und Transmembran-Transport zu gew{\"a}hrleisten. Letzterer ist charakteristisch f{\"u}r die intrazellul{\"a}re Limitierung von N{\"a}hrstoffen und pr{\"a}gt den infektionsrelevanten Status. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Ph{\"a}notyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und m{\"o}glicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellul{\"a}ren Bakterien m{\"u}ssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt f{\"u}r Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r S. Enteritidis durchgef{\"u}hrt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder erm{\"o}glichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifit{\"a}t oder Membranst{\"a}ndigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektions{\"a}hnlichen Modell durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde deutlich, dass die H{\"a}ufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verf{\"u}gbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu m{\"o}glichen Klonen, die w{\"a}hrend des Microarray-Screenings untersucht werden k{\"o}nnen, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektions{\"a}hnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben. Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant f{\"u}r das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene n{\"a}her untersucht, indem ihr Einfluss im infektions{\"a}hnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-St{\"a}mme analysiert wurde. Dabei wurde f{\"u}r eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der sp{\"a}ten intrazellul{\"a}ren Phase nachgewiesen. Weiterf{\"u}hrende in vitro Analysen sind f{\"u}r die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren. Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind f{\"u}r diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell l{\"a}sst sich ebenso f{\"u}r andere intrazellul{\"a}re Pathogene {\"u}bertragen und gew{\"a}hrleistet eine zuverl{\"a}ssige Identifizierung von potentiellen Antigenen.},
  language  = {de}
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@phdthesis{Lehmann2018,
  author    = {Lehmann, Andreas},
  title     = {Variability in human life history traits},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {110},
  year      = {2018},
  language  = {de}
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@phdthesis{Buehning2018,
  author    = {B{\"u}hning, Martin},
  title     = {Charakterisierung des Zusammenspiels von FeS-Cluster-Assemblierung, Molybd{\"a}nkofaktor-Biosynthese und tRNA-Thiolierung in Escherichia coli},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {167},
  year      = {2018},
  language  = {de}
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@phdthesis{Kammel2018,
  author    = {Kammel, Anne},
  title     = {Identifizierung fr{\"u}her epigenetischer Ver{\"a}nderungen, die zur Ausbildung einer Fettleber beitragen},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {130},
  year      = {2018},
  language  = {de}
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