@phdthesis{Ziemann2020,
  author    = {Ziemann, Vanessa},
  title     = {Toxische Effekte von Arsenolipiden in humanen Kulturzellen und Caenorhabditis elegans},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {112},
  year      = {2020},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Geisendoerfer2022,
  author    = {Geisend{\"o}rfer, Birte},
  title     = {Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden f{\"u}r die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {166},
  year      = {2022},
  abstract  = {Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Pr{\"a}valenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivit{\"a}tsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, R{\"o}tung, Bl{\"a}schenbildung und Absch{\"a}lung der Haut {\"a}ußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszul{\"o}sen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eind{\"a}mmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD ver{\"o}ffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Pr{\"u}fung auf hautsensibilisierendes Potenzial war {\"u}ber lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. {\"A}nderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche f{\"u}r Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekr{\"a}ftig, da sie lediglich singul{\"a}re Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schl{\"u}sselereignisse ber{\"u}cksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus prim{\"a}ren Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ans{\"a}tzen verglichen. Zus{\"a}tzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgef{\"u}hrt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos m{\"o}glich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell prim{\"a}rer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zus{\"a}tzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll f{\"u}hrte zu einer maßgeblich verst{\"a}rkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Molek{\"u}ls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ans{\"a}tzen durchgef{\"u}hrt. {\"A}hnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkultur{\"u}berstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, best{\"a}tigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. {\"U}berraschenderweise traten auch hier keine verst{\"a}rkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Prim{\"a}rzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern d{\"u}rfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung prim{\"a}rer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgef{\"u}hrt, wobei autologe MoLC in die Epidermis{\"a}quivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Finke2020,
  author    = {Finke, Hannah},
  title     = {Toxicological Characterization of Arsenolipids in vitro and Analysis of Global DNA (Hydroxy)methylation in the Context of Aging, Trace Element Status, and Genomic Stability},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {t, 222, XXVII},
  year      = {2020},
  language  = {de}
}
@phdthesis{HaferkornStarke2021,
  author    = {Haferkorn-Starke, Robert Christian},
  title     = {Entwicklung eines Lebensmitteluntersuchungssystems f{\"u}r mikrobielle Erreger mit Hilfe molekularbiologischer Methoden},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XVII, 239, vi},
  year      = {2021},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schjeide2021,
  author    = {Schjeide, Brit-Maren},
  title     = {Development and characterization of the MoN-Light BoNT assay to determine the toxicity of botulinum neurotoxin in motor neurons differentiated from CRISPR-modified induced pluripotent stem cells},
  doi       = {10.25932/publishup-51627},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-516278},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {e, xviii, 265},
  year      = {2021},
  abstract  = {Botulinum neurotoxin (BoNT) is produced by the anaerobic bacterium Clostridium botulinum. It is one of the most potent toxins found in nature and can enter motor neurons (MN) to cleave proteins necessary for neurotransmission, resulting in flaccid paralysis. The toxin has applications in both traditional and esthetic medicine. Since BoNT activity varies between batches despite identical protein concentrations, the activity of each lot must be assessed. The gold standard method is the mouse lethality assay, in which mice are injected with a BoNT dilution series to determine the dose at which half of the animals suffer death from peripheral asphyxia. Ethical concerns surrounding the use of animals in toxicity testing necessitate the creation of alternative model systems to measure the potency of BoNT. Prerequisites of a successful model are that it is human specific; it monitors the complete toxic pathway of BoNT; and it is highly sensitive, at least in the range of the mouse lethality assay. One model system was developed by our group, in which human SIMA neuroblastoma cells were genetically modified to express a reporter protein (GLuc), which is packaged into neurosecretory vesicles, and which, upon cellular depolarization, can be released - or inhibited by BoNT - simultaneously with neurotransmitters. This assay has great potential, but includes the inherent disadvantages that the GLuc sequence was randomly inserted into the genome and the tumor cells only have limited sensitivity and specificity to BoNT. This project aims to improve these deficits, whereby induced pluripotent stem cells (iPSCs) were genetically modified by the CRISPR/Cas9 method to insert the GLuc sequence into the AAVS1 genomic safe harbor locus, precluding genetic disruption through non-specific integrations. Furthermore, GLuc was modified to associate with signal peptides that direct to the lumen of both large dense core vesicles (LDCV), which transport neuropeptides, and synaptic vesicles (SV), which package neurotransmitters. Finally, the modified iPSCs were differentiated into motor neurons (MNs), the true physiological target of BoNT, and hypothetically the most sensitive and specific cells available for the MoN-Light BoNT assay. iPSCs were transfected to incorporate one of three constructs to direct GLuc into LDCVs, one construct to direct GLuc into SVs, and one "no tag" GLuc control construct. The LDCV constructs fused GLuc with the signal peptides for proopiomelanocortin (hPOMC-GLuc), chromogranin-A (CgA-GLuc), and secretogranin II (SgII-GLuc), which are all proteins found in the LDCV lumen. The SV construct comprises a VAMP2-GLuc fusion sequence, exploiting the SV membrane-associated protein synaptobrevin (VAMP2). The no tag GLuc expresses GLuc non-specifically throughout the cell and was created to compare the localization of vesicle-directed GLuc. The clones were characterized to ensure that the GLuc sequence was only incorporated into the AAVS1 safe harbor locus and that the signal peptides directed GLuc to the correct vesicles. The accurate insertion of GLuc was confirmed by PCR with primers flanking the AAVS1 safe harbor locus, capable of simultaneously amplifying wildtype and modified alleles. The PCR amplicons, along with an insert-specific amplicon from candidate clones were Sanger sequenced to confirm the correct genomic region and sequence of the inserted DNA. Off-target integrations were analyzed with the newly developed dc-qcnPCR method, whereby the insert DNA was quantified by qPCR against autosomal and sex-chromosome encoded genes. While the majority of clones had off-target inserts, at least one on-target clone was identified for each construct. Finally, immunofluorescence was utilized to localize GLuc in the selected clones. In iPSCs, the vesicle-directed GLuc should travel through the Golgi apparatus along the neurosecretory pathway, while the no tag GLuc should not follow this pathway. Initial analyses excluded the CgA-GLuc and SgII-GLuc clones due to poor quality protein visualization. The colocalization of GLuc with the Golgi was analyzed by confocal microscopy and quantified. GLuc was strongly colocalized with the Golgi in the hPOMC-GLuc clone (r = 0.85±0.09), moderately in the VAMP2-GLuc clone (r = 0.65±0.01), and, as expected, only weakly in the no tag GLuc clone (r = 0.44±0.10). Confocal microscopy of differentiated MNs was used to analyze the colocalization of GLuc with proteins associated with LDCVs and SVs, SgII in the hPOMC-GLuc clone (r = 0.85±0.08) and synaptophysin in the VAMP2-GLuc clone (r = 0.65±0.07). GLuc was also expressed in the same cells as the MN-associated protein, Islet1. A significant portion of GLuc was found in the correct cell type and compartment. However, in the MoN-Light BoNT assay, the hPOMC-GLuc clone could not be provoked to reliably release GLuc upon cellular depolarization. The depolarization protocol for hPOMC-GLuc must be further optimized to produce reliable and specific release of GLuc upon exposure to a stimulus. On the other hand, the VAMP2-GLuc clone could be provoked to release GLuc upon exposure to the muscarinic and nicotinic agonist carbachol. Furthermore, upon simultaneous exposure to the calcium chelator EGTA, the carbachol-provoked release of GLuc could be significantly repressed, indicating the detection of GLuc was likely associated with vesicular fusion at the presynaptic terminal. The application of the VAMP2-GLuc clone in the MoN-Light BoNT assay must still be verified, but the results thus far indicate that this clone could be appropriate for the application of BoNT toxicity assessment.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wetzel2022,
  author    = {Wetzel, Alexandra},
  title     = {Epigenetische Regulation des Epstein-Barr Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) und dessen Bedeutung bei Colitis ulcerosa},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {164},
  year      = {2022},
  abstract  = {Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entz{\"u}ndungen erniedrigt sind. Eine m{\"o}gliche Ursache k{\"o}nnte eine transkriptionelle Stilllegung {\"u}ber epigenetische Modifikationen sein. Tats{\"a}chlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell f{\"u}r ein lokales Entz{\"u}ndungsgeschehen dienten. Diese Regulation {\"u}ber DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem nat{\"u}rlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer {\"u}ber-additiven Induktion von EBI3. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte dar{\"u}ber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation haupts{\"a}chlich {\"u}ber NFκB (Nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verl{\"a}uft dabei {\"u}ber p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), w{\"a}hrend die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung w{\"a}hrend eines entz{\"u}ndlichen Zustandes auch in einer erh{\"o}hten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die H{\"o}he der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im {\"U}berstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als m{\"o}gliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antik{\"o}rper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht m{\"o}glich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz f{\"u}r die problematischen Antik{\"o}rper-basierten Analysen wie Immunpr{\"a}zipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, w{\"a}hrend IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivit{\"a}t des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen. Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 {\"u}ber Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. {\"A}hnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte. Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten M{\"a}usen und dem dazugeh{\"o}rigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalit{\"a}tsrate und K{\"o}rper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant st{\"a}rkere colitische Symptome auf. Dies best{\"a}tigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zus{\"a}tzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-M{\"a}use nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation best{\"a}tigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsph{\"a}notyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht. Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-M{\"a}use mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse {\"u}ber die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome {\"u}ber einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der st{\"a}rkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 {\"u}ber DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und -Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative f{\"u}r die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer {\"u}berm{\"a}ßigen Immunantwort w{\"a}hrend schubweiser entz{\"u}ndlicher Phasen k{\"o}nnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Luckert2016,
  author    = {Luckert, Claudia},
  title     = {Molekulare Mechanismen von hepatotoxischen Pyrrolizidinalkaloiden},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {127, LXXVII},
  year      = {2016},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hasan2018,
  author    = {Hasan, Ahmed Abdallah Abdalrahman Mohamed},
  title     = {GLP-1 receptor-independent mechanisms of DPP-4 inhibition on renal disease progression},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {113},
  year      = {2018},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Weber2016,
  author    = {Weber, Florian Till},
  title     = {In vitro Toxizit{\"a}t von Elektrolytl{\"o}sungen der Lithium-Ionen Batterie},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {119},
  year      = {2016},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gaballa2019,
  author    = {Gaballa, Mohamed Mahmoud Salem Ahmed},
  title     = {New pharmacological approaches targeting vascular calcification in chronic kidney disease},
  address   = {Potsdam},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {X, 110},
  year      = {2019},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Nieschalke2021,
  author    = {Nieschalke, Kai},
  title     = {Proteinaddukte und Urinmetaboliten des Nagetierkanzerogens Methyleugenol als Biomarker der Exposition},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {142, XLIV},
  year      = {2021},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rohn,
  author    = {Rohn, Isabelle},
  title     = {Food-relevant selenium species},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {132,VIII},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kehm2019,
  author    = {Kehm, Richard},
  title     = {The impact of metabolic stress and aging on functionality and integrity of pancreatic islets and beta-cells},
  doi       = {10.25932/publishup-44109},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-441099},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {VI, 138},
  year      = {2019},
  abstract  = {The increasing age of worldwide population is a major contributor for the rising prevalence of major pathologies and disease, such as type 2 diabetes, mediated by massive insulin resistance and a decline in functional beta-cell mass, highly associated with an elevated incidence of obesity. Thus, the impact of aging under physiological conditions and in combination with diet-induced metabolic stress on characteristics of pancreatic islets and beta-cells, with the focus on functionality and structural integrity, were investigated in the present dissertation. Primarily induced by malnutrition due to chronic and excess intake of high caloric diets, containing large amounts of carbohydrates and fats, obesity followed by systemic inflammation and peripheral insulin resistance occurs over time, initiating metabolic stress conditions. Elevated insulin demands initiate an adaptive response by beta-cell mass expansion due to increased proliferation, but prolonged stress conditions drive beta-cell failure and loss. Aging has been also shown to affect beta-cell functionality and morphology, in particular by proliferative limitations. However, most studies in rodents were performed under beta-cell challenging conditions, such as high-fat diet interventions. Thus, in the first part of the thesis (publication I), a characterization of age-related alterations on pancreatic islets and beta-cells was performed by using plasma samples and pancreatic tissue sections of standard diet-fed C57BL/6J wild-type mice in several age groups (2.5, 5, 10, 15 and 21 months). Aging was accompanied by decreased but sustained islet proliferative potential as well as an induction of cellular senescence. This was associated with a progressive islet expansion to maintain normoglycemia throughout lifespan. Moreover, beta-cell function and mass were not impaired although the formation and accumulation of AGEs occurred, located predominantly in the islet vasculature, accompanied by an induction of oxidative and nitrosative (redox) stress. The nutritional behavior throughout human lifespan; however, is not restricted to a balanced diet. This emphasizes the significance to investigate malnutrition by the intake of high-energy diets, inducing metabolic stress conditions that synergistically with aging might amplify the detrimental effects on endocrine pancreas. Using diabetes-prone NZO mice aged 7 weeks, fed a dietary regimen of carbohydrate restriction for different periods (young mice - 11 weeks, middle-aged mice - 32 weeks) followed by a carbohydrate intervention for 3 weeks, offered the opportunity to distinguish the effects of diet-induced metabolic stress in different ages on the functionality and integrity of pancreatic islets and their beta-cells (publication II, manuscript). Interestingly, while young NZO mice exhibited massive hyperglycemia in response to diet-induced metabolic stress accompanied by beta-cell dysfunction and apoptosis, middle-aged animals revealed only moderate hyperglycemia by the maintenance of functional beta-cells. The loss of functional beta-cell mass in islets of young mice was associated with reduced expression of PDX1 transcription factor, increased endocrine AGE formation and related redox stress as well as TXNIP-dependent induction of the mitochondrial death pathway. Although the amounts of secreted insulin and the proliferative potential were comparable in both age groups, islets of middle-aged mice exhibited sustained PDX1 expression, almost regular insulin secretory function, increased capacity for cell cycle progression as well as maintained redox potential. The results of the present thesis indicate a loss of functional beta-cell mass in young diabetes-prone NZO mice, occurring by redox imbalance and induction of apoptotic signaling pathways. In contrast, aging under physiological conditions in C57BL/6J mice and in combination with diet-induced metabolic stress in NZO mice does not appear to have adverse effects on the functionality and structural integrity of pancreatic islets and beta-cells, associated with adaptive responses on changing metabolic demands. However, considering the detrimental effects of aging, it has to be assumed that the compensatory potential of mice might be exhausted at a later point of time, finally leading to a loss of functional beta-cell mass and the onset and progression of type 2 diabetes. The polygenic, diabetes-prone NZO mouse is a suitable model for the investigation of human obesity-associated type 2 diabetes. However, mice at advanced age attenuated the diabetic phenotype or do not respond to the dietary stimuli. This might be explained by the middle age of mice, corresponding to the human age of about 38-40 years, in which the compensatory mechanisms of pancreatic islets and beta cells towards metabolic stress conditions are presumably more active.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Engel2021,
  author    = {Engel, Anika},
  title     = {Endocrine effects of plasticizers and the development of a breast cell-based toxicity screening system},
  doi       = {10.25932/publishup-53117},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {VIII, 89},
  year      = {2021},
  abstract  = {Humans are frequently exposed to a variety of endocrine disrupting chemicals (EDCs), which can cause harmful effects, e.g. disturbance of growth, development and reproduction, and cancer (UBA, 2016). EDCs are often components of synthetically manufactured products. Materials made of plastics, building materials, electronic items, textiles or cosmetic products can be particularly contaminated (Ain et al., 2021). One group of EDCs that has gained increased interest in recent years is phthalates. They are used as plasticizers in plastic materials to which people are daily exposed to. Phthalate plasticizers exert their harmful effects among others via activation of the estrogen receptor α (ERα), the estrogen receptor β (ERβ) and via inhibition of the androgen receptor (AR). Some phthalates have already been classified by the EU as Cancerogenic-, Mutagenic-, Reprotoxic- (CMR) substances and their use in industry has been restricted. After oral ingestion, phthalates are metabolized and are finally excreted with the urine. Numerous toxicological studies exist on phthalates, but mainly with the parent substances, not with their primary and secondary metabolites. In the course of the restriction of phthalates by the EU, the phthalate-free plasticizer di-isononylcyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCH®), was introduced to the market. So far, almost no toxicologically relevant properties have been identified for DINCH®. However, the effects of DINCH® have only been studied in animal experiments and, as with phthalates, almost exclusively with the parent substance. However, toxic effects of a particular compound may be induced by its metabolites and not by the parent compound itself. Therefore, potential endocrine effects of 15 phthalates, 19 phthalate metabolites, DINCH®, and five of its metabolites were investigated using reporter gene assays on the ERα, ERβ, and the AR. In addition, studies of the influence of some selected plasticizers on peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) activity were performed. Furthermore, a H295R steroidogenesis assay was performed to determine the influence of DINCH® and its metabolites on estradiol or testosterone synthesis. Analysis of the experiments shows that the phthalates either stimulated or inhibited ERα and ERβ activity and inhibited AR activity, whereas the phthalate metabolites did not affect the activity of these human hormone receptors. In contrast, metabolites of di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) stimulated transactivation of the human PPARα and PPARγ in analogous reporter gene assays, although DEHP itself did not activate these nuclear receptors. Therefore, primary and secondary phthalate metabolites appear to exert different effects at the molecular level compared to the parent compounds. Similarly, the results showed that the phthalate-free plasticizer DINCH® itself did not affect the activity of ERα, ERβ, AR, PPARα and PPARγ, while the DINCH® metabolites were shown to activate all these receptors. In the case of AR, DINCH® metabolites mainly enhanced AR activity stimulated by dihydrotestosterone (DHT). In the H295R steroidogenesis assay, neither DINCH® nor any of its metabolites affected estradiol or testosterone synthesis. Primary and secondary metabolites of DINCH® thus exert different effects at the molecular level than DINCH® itself. However, all these in vitro effects of DINCH® metabolites were observed only at high concentrations, which were about three orders of magnitude higher than the reported DINCH® metabolite concentrations in human urine. Therefore, the in vitro data does not support the assumption that DINCH® or any of the metabolites studied could have significant endocrine effects in vivo at relevant exposure levels in humans. Following the demonstration of direct and indirect endocrine effects of the studied plasticizers, a new effect-based in vitro 3D screening tool for toxicity assays of non-genotoxic carcinogens was developed using estrogen receptor-negative (ER-) MCF10-A cells and estrogen receptor-positive (ER+) MCF-12A cells. This arose from the background that breast cancer is the most common cancer occurring in women and estrogenic substances, such as phthalates, can probably influence the disease. The human mammary epithelial cell lines MCF-10A and MCF-12A form well-differentiated acini-like structures when cultured in three-dimensional Matrigel culture for a period of 20 days. The model should make it possible to detect substance effects on cell differentiation and growth, on mammary cell acini, and to differentiate between estrogenic and non-estrogenic effects at the same time. In the present study, both cell lines were tested for their suitability as an effect-based in vitro assay system for non-genotoxic carcinogens. An Automated Acinus Detection And Morphological Evaluation (ADAME) software solution has been developed for automatic acquisition of acinus images and determination of morphological parameters such as acinus size, lumen size, and acinus roundness. Several test substances were tested for their ability to affect acinus formation and cellular differentiation. Human epithelial growth factor (EGF) stimulated acinus growth for both cell lines, while all trans retinoic acid (RA) inhibited acinar growth. The potent estrogen 17β-estradiol had no effect on acinus formation of MCF-10A cells but resulted in larger MCF-12A acini. Thus, the parallel use of both cell lines together with the developed high content screening and evaluation tool allows the rapid identification of the estrogenic and cancerogenic properties of a given test compound. The morphogenesis of the acini was only slightly affected by the test substances. On the one hand, this suggests a robust test system, on the other hand, it probably cannot detect low-potent estrogenic compounds such as phthalates or DINCH®. The advantage of the robustness of the system, however, may be that vast numbers of "positive" results with questionable biological relevance could be avoided, such as those observed in sensitive reporter gene assays.},
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