@phdthesis{Garz2013,
  author    = {Garz, Andreas},
  title     = {Nichtlineare Mikroskopie und Bilddatenverarbeitung zur biochemischen Analyse synchronisierter Chlamydomonas-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-66904},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2013},
  abstract  = {Unter geeigneten Wachstumsbedingungen weisen Algenkulturen oft eine gr{\"o}ßere Produktivit{\"a}t der Zellen auf, als sie bei h{\"o}heren Pflanzen zu beobachten ist. Chlamydomonas reinhardtii-Zellen sind vergleichsweise klein. So betr{\"a}gt das Zellvolumen w{\"a}hrend des vegetativen Zellzyklus etwa 50-3500 µm³. Im Vergleich zu h{\"o}heren Pflanzen ist in einer Algensuspension die Konzentration der Biomasse allerdings gering. So enth{\"a}lt beispielsweise 1 ml einer {\"u}blichen Konzentration zwischen 10E6 und 10E7 Algenzellen. Quantifizierungen von Metaboliten oder Makromolek{\"u}len, die zur Modellierung von zellul{\"a}ren Prozessen genutzt werden, werden meist im Zellensemble vorgenommen. Tats{\"a}chlich unterliegt jedoch jede Algenzelle einer individuellen Entwicklung, die die Identifizierung charakteristischer allgemeing{\"u}ltiger Systemparameter erschwert. Ziel dieser Arbeit war es, biochemisch relevante Messgr{\"o}ßen in-vivo und in-vitro mit Hilfe optischer Verfahren zu identifizieren und zu quantifizieren. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Puls-Amplituden-Modulation(PAM)-Fluorimetriemessplatz zur Messung der durch {\"a}ußere Einfl{\"u}sse bedingten ver{\"a}nderlichen Chlorophyllfluoreszenz an einzelnen Zellen vorgestellt. Die Verwendung eines kommerziellen Mikroskops, die Implementierung empfindlicher Nachweiselektronik und einer geeignete Immobilisierungsmethode erm{\"o}glichten es, ein Signal-zu-Rauschverh{\"a}ltnis zu erreichen, mit dem Fluoreszenzsignale einzelner lebender Chlamydomonas-Zellen gemessen werden konnten. Insbesondere wurden das Zellvolumen und der als Maß f{\"u}r die Effizienz des Photosyntheseapparats bzw. die Zellfitness geltende Chlorophyllfluoreszenzparameter Fv/Fm ermittelt und ein hohes Maß an Heterogenit{\"a}t dieser zellul{\"a}ren Parameter in verschiedenen Entwicklungsstadien der synchronisierten Chlamydomonas-Zellen festgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die bildgebende Laser-Scanning-Mikroskopie und anschließende Bilddatenanalyse zur quantitativen Erfassung der wachstumsabh{\"a}ngigen zellul{\"a}ren Parameter angewandt. Ein kommerzielles konfokales Mikroskop wurde um die M{\"o}glichkeit der nichtlinearen Mikroskopie erweitert. Diese hat den Vorteil einer lokalisierten Anregung, damit verbunden einer h{\"o}heren Ortsaufl{\"o}sung und insgesamt geringeren Probenbelastung. Weiterhin besteht neben der Signalgewinnung durch Fluoreszenzanregung die M{\"o}glichkeit der Erzeugung der Zweiten Harmonischen (SHG) an biophotonischen Strukturen, wie der zellul{\"a}ren St{\"a}rke. Anhand der Verteilungsfunktionen war es m{\"o}glich mit Hilfe von modelltheoretischen Ans{\"a}tzen zellul{\"a}re Parameter zu ermitteln, die messtechnisch nicht unmittelbar zug{\"a}nglich sind. Die morphologischen Informationen der Bilddaten erm{\"o}glichten die Bestimmung der Zellvolumina und die Volumina subzellularer Strukturen, wie Nuclei, extranucle{\"a}re DNA oder St{\"a}rkegranula. Weiterhin konnte die Anzahl subzellul{\"a}rer Strukturen innerhalb einer Zelle bzw. eines Zellverbunds ermittelt werden. Die Analyse der in den Bilddaten enthaltenen Signalintensit{\"a}ten war Grundlage einer relativen Konzentrationsbestimmung von zellul{\"a}ren Komponenten, wie DNA bzw. St{\"a}rke. Mit dem hier vorgestellten Verfahren der nichtlinearen Mikroskopie und nachfolgender Bilddatenanalyse konnte erstmalig die Verteilung des zellul{\"a}ren St{\"a}rkegehalts in einer Chlamydomonas-Population w{\"a}hrend des Wachstums bzw. nach induziertem St{\"a}rkeabbau verfolgt werden. Im weiteren Verlauf wurde diese Methode auch auf Gefrierschnitte h{\"o}herer Pflanzen, wie Arabidopsis thaliana, angewendet. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass viele zellul{\"a}re Parameter, wie das Volumen, der zellul{\"a}re DNA- und St{\"a}rkegehalt bzw. die Anzahl der St{\"a}rkegranula durch eine Lognormalverteilung, mit wachstumsabh{\"a}ngiger Parametrisierung, beschrieben werden. Zellul{\"a}re Parameter, wie Stoffkonzentration und zellul{\"a}res Volumen, zeigen keine signifikanten Korrelationen zueinander, woraus geschlussfolgert werden muss, dass es ein hohes Maß an Heterogenit{\"a}t der zellul{\"a}ren Parameter innerhalb der synchronisierten Chlamydomonas-Populationen gibt. Diese Aussage gilt sowohl f{\"u}r die als homogenste Form geltenden Synchronkulturen von Chlamydomonas reinhardtii als auch f{\"u}r die gemessenen zellul{\"a}ren Parameter im intakten Zellverbund h{\"o}herer Pflanzen. Dieses Ergebnis ist insbesondere f{\"u}r modelltheoretische Betrachtungen von Relevanz, die sich auf empirische Daten bzw. zellul{\"a}re Parameter st{\"u}tzen welche im Zellensemble gemessen wurden und somit nicht notwendigerweise den zellul{\"a}ren Status einer einzelnen Zelle repr{\"a}sentieren.},
  language  = {de}
}