@phdthesis{Freiberg2004, author = {Freiberg, Alexander}, title = {Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilit{\"a}t und Faltung eines Solenoidproteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {F{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilit{\"a}t und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Er{\"o}rterung von Gesetzm{\"a}ßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globul{\"a}ren Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine geh{\"o}ren, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelf{\"o}rmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Terti{\"a}rstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilit{\"a}t und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die f{\"u}r die Infektion ausreichende zentrale LRR-Dom{\"a}ne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrit{\"a}t und die Stabilit{\"a}ts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Dom{\"a}ne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Dom{\"a}ne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Dom{\"a}ne mit einer Immunglobulin (Ig)-{\"a}hnlichen Dom{\"a}ne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollst{\"a}ndige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungs{\"u}berg{\"a}ngen durchgef{\"u}hrt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichts{\"u}berg{\"a}nge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zus{\"a}tzliche Ig-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erh{\"o}hung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilit{\"a}tszunahme {\"a}ußerte sich sowohl in einer Verschiebung des {\"U}bergangsmittelpunktes zu h{\"o}heren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erh{\"o}hung der Kooperativit{\"a}t des Gleichgewichts{\"u}bergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Dom{\"a}ne nicht unabh{\"a}ngig voneinander falten und dass die Ig-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor w{\"a}hrend der Invasion interagiert, eine kritische Rolle f{\"u}r die in\ vivo Stabilit{\"a}t des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs die Integrit{\"a}t der Internalin-Dom{\"a}ne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen {\"u}ber Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Dom{\"a}ne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH\ 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen {\"u}ber ein Intermediat. Eine Erh{\"o}hung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins f{\"u}hrte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im {\"U}bergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Dom{\"a}ne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals w{\"a}hrend der Entfaltung m{\"o}glicherweise auf die Pr{\"a}senz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem {\"U}bergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abh{\"a}ngigkeit von der Temperatur, w{\"a}hrend der zweite schnellere Prozess der Entfaltung st{\"a}rker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten f{\"u}r die Erkl{\"a}rung der langsamen Faltungsphase zun{\"a}chst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollst{\"a}ndige Amplitude w{\"a}hrend der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle f{\"u}r die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden k{\"o}nnen.}, subject = {Proteinfaltung}, language = {de} } @phdthesis{Pellengahr2004, author = {Pellengahr, Klaus}, title = {Charakterisierung von ausgew{\"a}hlten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2500}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle f{\"u}nf ausgew{\"a}hlten Gene kodieren f{\"u}r PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs pr{\"a}ferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte f{\"u}r die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer {\"U}bereinstimmung auf Aminos{\"a}ureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz erm{\"o}glichte es, die sehr {\"a}hnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit ver{\"a}nderter Genaktivit{\"a}t von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich ver{\"a}ndertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Bl{\"a}tter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. F{\"u}r TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen l{\"a}sst. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivit{\"a}t zu einem deutlichen Blattph{\"a}notyp mit gezahnten Blattr{\"a}ndern f{\"u}hrte. F{\"u}r STH2-Insertionsmutanten wurde dieses ver{\"a}nderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches f{\"u}r ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer f{\"u}r das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erh{\"o}hte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und f{\"u}hrte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. W{\"a}hrend NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erh{\"o}hte, f{\"u}hrte NIC4-Expresion zu einer h{\"o}heren Sensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten ausw{\"a}rts gerichtete Chloridstr{\"o}me, die spannungsabh{\"a}ngig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumstr{\"o}me, die spannungsunabh{\"a}ngig waren. F{\"u}r NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivit{\"a}t detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivit{\"a}t in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war haupts{\"a}chlich in den vaskul{\"a}ren Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Ph{\"a}notyp bei Ver{\"a}nderung der Genaktivit{\"a}t von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu {\"u}bernehmen.}, subject = {Biologie}, language = {de} } @phdthesis{Steinhauser2004, author = {Steinhauser, Dirk}, title = {Inferring hypotheses from complex profile data - by means of CSB.DB, a comprehensive systems-biology database}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2467}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {The past decades are characterized by various efforts to provide complete sequence information of genomes regarding various organisms. The availability of full genome data triggered the development of multiplex high-throughput assays allowing simultaneous measurement of transcripts, proteins and metabolites. With genome information and profiling technologies now in hand a highly parallel experimental biology is offering opportunities to explore and discover novel principles governing biological systems. Understanding biological complexity through modelling cellular systems represents the driving force which today allows shifting from a component-centric focus to integrative and systems level investigations. The emerging field of systems biology integrates discovery and hypothesis-driven science to provide comprehensive knowledge via computational models of biological systems. Within the context of evolving systems biology, investigations were made in large-scale computational analyses on transcript co-response data through selected prokaryotic and plant model organisms. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) was initiated to provide public and open access to the results of biostatistical analyses in conjunction with additional biological knowledge. The database tool CSB.DB enables potential users to infer hypothesis about functional interrelation of genes of interest and may serve as future basis for more sophisticated means of elucidating gene function. The co-response concept and the CSB.DB database tool were successfully applied to predict operons in Escherichia coli by using the chromosomal distance and transcriptional co-responses. Moreover, examples were shown which indicate that transcriptional co-response analysis allows identification of differential promoter activities under different experimental conditions. The co-response concept was successfully transferred to complex organisms with the focus on the eukaryotic plant model organism Arabidopsis thaliana. The investigations made enabled the discovery of novel genes regarding particular physiological processes and beyond, allowed annotation of gene functions which cannot be accessed by sequence homology. GMD - the Golm Metabolome Database - was initiated and implemented in CSB.DB to integrated metabolite information and metabolite profiles. This novel module will allow addressing complex biological questions towards transcriptional interrelation and extent the recent systems level quest towards phenotyping.}, subject = {Datenbank}, language = {en} } @phdthesis{Helaly2004, author = {Helaly, Alaa El-din A.}, title = {Molecular studies on plants to enhance their stress tolerance}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2427}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Environmental stresses such as drought, high salt and low temperature affect plant growth and decrease crop productivity extremely. It is important to improve stress tolerance of the crop plant to increase crop yield under stress conditions. The Arabidopsis thaliana salt tolerance 1 gene (AtSTO1) was originally identified by Lippuner et al., (1996). In this study around 27 members of STO-like proteins were identified in Arabidopsis thaliana, rice and other plant species. The STO proteins have two consensus motifs (CCADEAAL and FCV(L)EDRA). The STO family members can be regarded as a distinct class of C2C2 proteins considering their low sequence similarity to other GATA like proteins and poor conservation in the C-terminus. AtSTO1 was found to be induced by salt, cold and drought in leaves and roots of 4-week-old Arabidopsis thaliana wild-type plants. The expression of AtSTO1 under salt and cold stress was more pronounced in roots than in leaves. The data provided here revealed that the AtSTO1 protein is localized in the nucleus. The observation that AtSTO1 localizes in the nucleus is consistent with its proposed function as a transcription factor. AtSTO1-dependent phenotypes were observed when plant were grown at 50 mM NaCl on agar plates. Leaves of AtSTO1 overexpression lines were bigger with dark green coloration, whereas stunted growth and yellowish leaves were observed in wild-type and RNAi plants. Also, the AtSTO1 overexpression plants when exposed to long-term cold stress had a red leaf coloration which was much stronger than in wild-type and RNAi lines. Growth of AtSTO1 overexpression lines in long term under salt and cold stress was always associated with long roots which was more pronounced than in wild-type and RNAi lines. Proline accumulation increased more strongly in leaves and roots of AtSTO1 overexpression lines than in tissues of wild-type and RNAi lines when treated with 200 mM NaCl, exposed to cold stress or when watering was prevented for one day or two weeks. Also, soluble sugar content increased to higher levels under salt, cold and drought stress in AtSTO1 overexpression lines when compared to wild-type and RNAi lines. The increase in soluble sugar content was detected in AtSTO1 overexpression lines after long-term (2 weeks) growth of plants under these stresses. Anthocyanins accumulated in leaves of AtSTO1 overexpression lines when exposed to long term salt stress (200 mM NaCl for 2 weeks) or to 4°C for 6 and 8 weeks. Also, anthocyanin content was increased in flowers of AtSTO1 overexpression plants kept at 4°C for 8 weeks. Taken together these data indicate that overexpression of AtSTO1 enhances abiotic stress toleranc via a more pronounced accumulation of compatible solutes under stress.}, language = {en} } @phdthesis{Schwonbeck2004, author = {Schwonbeck, Susanne}, title = {Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberfl{\"a}chen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001853}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. F{\"u}r die Analyse wurde ein faseroptischer Affinit{\"a}tssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die Versuche am faseroptischen Affinit{\"a}tssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied l{\"a}sst sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfl{\"a}che sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell f{\"u}r die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter f{\"u}r ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenit{\"a}t als auch im Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis wurden an NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen erreicht. F{\"u}r die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenl{\"a}nge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glastr{\"a}ger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96\%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen best{\"a}tigt werden. Ursache f{\"u}r die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem f{\"u}r die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverl{\"a}ssig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA m{\"o}glich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht ver{\"o}ffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kosteng{\"u}nstigere und weniger hoch dimensionierte L{\"o}sung f{\"u}r Fragestellungen beispielsweise in der Ern{\"a}hrungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zuk{\"u}nftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.}, language = {de} } @phdthesis{Ringleb2004, author = {Ringleb, Jennifer}, title = {Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001901}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz f{\"u}r die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbest{\"a}nde. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entz{\"u}ndungsreaktionen ausl{\"o}senden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und k{\"o}nnen somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden f{\"u}r die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein \„Vakzin-Design\“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide f{\"u}r die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zun{\"a}chst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antik{\"o}rpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze gepr{\"u}ft. Zur Untersuchung der Immunogenit{\"a}t der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen f{\"u}r die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der St{\"a}rke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgesch{\"a}tzt.}, language = {de} } @phdthesis{Venevskaia2004, author = {Venevskaia, Irina}, title = {Modeling of vegetation diversity and a national conservation planning: example of Russia}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001863}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Die {\"u}bergreifende Zielsetzung meiner Studie ist eine Ausarbeitung quantitativer Methoden zur nationalen nationale Schutzplanung in {\"U}bereinstimmung mit dem internationalen Ansatz. Diese Zielsetzung erfordert eine L{\"o}sung der folgenden Probleme: 1) Wie l{\"a}sst sich Vegetationsvielfalt in grober Aufl{\"o}sung auf Basis abiotischen Faktoren einsch{\"a}tzen? 2) Wie ist der Ansatz 'globaler Hotspots' f{\"u}r die Eingrenzung nationaler Biodiversit{\"a}ts-Hotspots zu {\"u}bernehmen? 3) Wie erfolgt die Auswahl von quantitativen Schutzzielen unter Einbezug der Unterschiede nationaler Hotspots bei Umweltbedingungen und durch den Menschen Bedrohung? 4) Wie sieht der Entwurf eines großfl{\"a}chigen nationalen Naturschutzkonzepts aus, das die hierarchische Natur der Artenvielfalt reflektiert? Die Fallstudie f{\"u}r nationale Naturschutzplanung ist Russland. Die nachfolgenden theoretischen Schl{\"u}sse wurden gezogen: · Großr{\"a}umige Vegetationsdiversit{\"a}t ist weitgehend vorhersagbar durch klimabedingte latente W{\"a}rme f{\"u}r Verdunstung und topographische Landschaftsstruktur, beschrieben als H{\"o}hendifferenz. Das klimabasierte Modell reproduziert die beobachtete Artenanzahl von Gef{\"a}ßpflanzen f{\"u}r verschiedene Gebiete auf der Welt mit einem durchschnittlichen Fehler von 15\% · Nationale Biodiversit{\"a}ts-Hotspots k{\"o}nnen auf Grundlage biotischer oder abiotischer Daten kartographiert werden, indem als Korrektur f{\"u}r ein Land die quantitativen Kriterien f{\"u}r Planzenendemismus und Landnutzung des Ansatzes der 'globalen Hotspots' genutzt wird · Quantitative Naturschutzziele, die die Unterschiede zwischen nationalen Biodiversit{\"a}ts-Hotspots in Bezug auf Umweltbedingungen und der Bedrohung durch den Menschen miteinbeziehen, k{\"o}nnen mit nationalen Daten {\"u}ber Arten auf der Roten Liste gesetzt werden · Ein großr{\"a}umiger nationaler Naturschutzplan, der die hierarchische Natur der Artenvielfalt ber{\"u}cksichtigt, kann durch eine Kombination von abiotischer Methode im nationalen Bereich (Identifikation großr{\"a}umiger Hotspots) und biotischer Methode im regionalen Bereich (Datenanalyse der Arten auf der Roten Liste) entworfen werden}, language = {en} } @phdthesis{Junker2004, author = {Junker, Bj{\"o}rn H.}, title = {Sucrose breakdown in the potato tuber}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001673}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans{\"a}tze verfolgt, um das Verst{\"a}ndnis des Saccharose-zu-St{\"a}rke Stoffwechselweges in sich entwickelnden Kartoffelknollen zu untersuchen. Zun{\"a}chst wurde ein induzierbares Genexpressions-System aus dem Schimmelpilz Aspergillus nidulans f{\"u}r die Untersuchung des Metabolismus von Kartoffelknollen optimiert. Es wurde herausgefunden, dass dieses sogenannte alc system schneller auf Acetaldehyd reagiert als auf Ethanol, und dass Acetaldehyd weniger Seiteneffekte auf den Metabolismus hat. Die optimalen Induktionsbedingungen wurden dann benutzt um die Effekte einer zeitlich kontrollierten zytosolischen Expression einer Hefe-Invertase auf den Metabolismus der Kartoffelknolle zu untersuchen. Die beobachteten Unterschiede zwischen induzierter und konstitutiver Expression der Invertase f{\"u}hrten zu der Feststellung, dass die Glycolyse erst induziert wird nachdem ein ATP-Mangel durch erh{\"o}htes Saccharose-Cycling kreiert wurde. Weiterhin lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass Maltose in der Kartoffelknolle eher ein Produkt der Kondensation zweier Glucose-Einheiten ist statt ein Produkt des St{\"a}rke-Abbaus zu sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression einer Hefe-Invertase in der Vakuole von Kartoffelknollen {\"a}hnliche Effekte auf deren Metabolismus hat wie die Expression des gleichen Enzymes im Apoplasten. Diese Beobachtung ist ein weiterer Beleg f{\"u}r die Pr{\"a}senz eines Mechanismus, bei dem Saccharose mittels Endozytose in die Vakuole aufgenommen wird anstatt {\"u}ber Transporter direkt ins Zytosol aufgenommen zu werden. Zum Schluß wird ein kinetisches Modell des Saccharose-Abbaus vorgestellt, das in der Lage ist diesen Teil des Stoffwechsels der Kartoffelknolle quantitativ zu simulieren. Weiterhin kann dieses Modell die metabolischen Effekte der Einf{\"u}hrung einer Hefe-Invertase in das Zytosol von Kartoffelknollen mit erstaunlicher Pr{\"a}zision vorhersagen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass induzierbare Genexpression sowie Computermodelle von Stoffwechselwegen n{\"u}tzliche Hilfsmittel f{\"u}r eine Verbesserung des Verst{\"a}ndnisses des Pflanzenmetabolismus sind.}, language = {en} } @phdthesis{Scheich2004, author = {Scheich, Christoph}, title = {High-throughput evaluation of protein folding conditions and expression constructs for structural genomics}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001552}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {Das E. coli Expressionssystem ist das am h{\"a}ufigsten angewandte hinsichtlich der rekombinante Proteinexpression f{\"u}r strukturelle und funktionelle Analysen aufgrund der hohen erzielten Ausbeuten und der einfachen Handhabbarkeit. Allerdings ist insbesondere die Expression eukaryotischer Proteine in E. coli problematisch, z.B. wenn das Protein nicht korrekt gefaltet ist und in unl{\"o}slichen Inclusion Bodies anf{\"a}llt. In manchen F{\"a}llen ist die Analyse von Deletionskonstrukten oder einzelnen Proteindom{\"a}nen der Untersuchung des Voll{\"a}ngeproteins vorzuziehen. Dies umfasst die Herstellung eines Satzes von Expressionskonstrukten, welche charakterisiert werden m{\"u}ssen. In dieser Arbeit werden Methoden optimiert und evaluiert f{\"u}r die in vitro-Faltung von Inclusion Body-Proteinen sowie die Entwicklung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung von Expressionskonstrukten. Die {\"U}berf{\"u}hrung von Inclusion Body-Proteinen in den nativen Zustand beinhaltet zwei Schritte: (a) Aufl{\"o}sen mit einen chaotropen Reagenz oder starkem ionischen Detergenz und (b) Faltung des Proteins durch Beseitigung des Chaotrops begleitet von dem Transfer in einen geeigneten Puffer. Die Ausbeute an nativ gefaltetem Protein ist oft stark eingeschr{\"a}nkt aufgrund von Aggregation und Fehlfaltung; sie kann allerdings durch die Zugabe bestimmter Additive zum Faltungspuffer erh{\"o}ht werden. Solche Additive m{\"u}ssen empirisch identifiziert werden. In dieser Arbeit wurde eine Testprozedur f{\"u}r Faltungsbedingungen entwickelt. Zur Reduzierung der m{\"o}glichen Kombinationen der getesteten Additive wurden sowohl empirische Beobachtungen aus der Literatur als auch bekannte Eigenschaften der Additive ber{\"u}cksichtigt. Zur Verminderung der eingesetzten Proteinmenge und des Arbeitsaufwandes wurde der Test automatisiert und miniaturisiert mittels eines Pipettierroboters. 20 Bedingungen zum schnellen Verd{\"u}nnen von denaturierten Proteinen werden hierbei getestet und zwei Bedingungen zur Faltung von Proteinen mit dem Detergenz/Cyclodextrin Protein-Faltungssystem von Rozema et al. (1996). 100 \&\#181;g Protein werden pro Bedingung eingesetzt. Zus{\"a}tzlich werden acht Bedingungen f{\"u}r die Faltung von His-Tag-Fusionsproteinen (ca. 200 \&\#181;g), welche an eine Metallchelat-Matrix immobilisiert sind, getestet. Die Testprozedur wurde erfolgreich angewendet zur Faltung eines humanen Proteins, der p22 Untereinheit von Dynactin, welche in E. coli in Inclusion Bodies exprimiert wird. So wie es sich bei vielen Proteinen darstellt, war auch f{\"u}r p22 Dynactin kein biologischer Nachweistest vorhanden, um den Erfolg des Faltungsexperimentes zu messen. Die L{\"o}slichkeit des Proteins kann nicht als eindeutiges Kriterium dienen, da neben nativ gefaltetem Protein, l{\"o}sliche fehlgefaltete Spezies und Mikroaggregate auftreten k{\"o}nnen. Diese Arbeit evaluiert Methoden zur Detektion kleiner Mengen nativen Proteins nach dem automatisierten Faltungstest. Bevor p22 Dynactin gefaltet wurde, wurden zwei Modellenzyme zur Evaluierung eingesetzt, bovine Carboanhydrase II (CAB) und Malat Dehydrogenase aus Schweineherz-Mitochondrien. Die wiedererlangte Aktivit{\"a}t nach der R{\"u}ckfaltung wurde korreliert mit verschiedenen biophysikalischen Methoden. Bindungsstudien mit 8-Anilino-1-Naphtalenesulfons{\"a}ure ergaben keine brauchbaren Informationen bei der R{\"u}ckfaltung von CAB aufgrund der zu geringen Sensitivit{\"a}t und da fehlgefaltete Proteine nicht eindeutig von nativem Protein unterschieden werden konnten. Tryptophan Fluoreszenzspektren der r{\"u}ckgefalteten CAB wurden zur Einsch{\"a}tzung des Erfolges der R{\"u}ckfaltung angewandt. Die Verschiebung des Intensit{\"a}tsmaximum zu einer niedrigeren Wellenl{\"a}nge im Vergleich zum denaturiert entfalteten Protein sowie die Fluoreszenzintensit{\"a}t korrelierten mit der wiedererlangten enzymatischen Aktivit{\"a}t. F{\"u}r beide Modellenzyme war analytische hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) brauchbar zur Identifizierung r{\"u}ckgefalteter Proben mit aktivem Enzym. Kompakt gefaltetes, aktives Enzym eluierte in einem distinkten Peak im abnehmenden Ammoniumsulfat-Gradienten. Das Detektionslimit f{\"u}r analytische HIC lag bei 5 \&\#181;g. Im Falle von CAB konnte gezeigt werden, dass Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie und analytische HIC in Kombination geeignet sind um Falsch-Positive oder Falsch-Negative, welche mit einem der Monitore erhalten wurden, auszuschließen. Diese beiden Methoden waren ebenfalls geeignet zur Identifizierung der Faltungsbedingungen von p22 Dynactin. Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie kann jedoch zu Falsch-Positiven f{\"u}hren, da in machen F{\"a}llen Spektren von l{\"o}slichen Mikroaggregaten kaum unterscheidbar sind von Spektren des nativ gefalteten Proteins. Dies zusammenfassend wurde eine schnelle und zuverl{\"a}ssige Testprozedur entwickelt, um Inclusion Body-Proteine einer strukturellen und funktionellen Analyse zug{\"a}nglich zu machen. In einem separaten Projekt wurden 88 verschiedene E. coli-Expressionskonstrukte f{\"u}r 17 humane Proteindom{\"a}nen, welche durch Sequenzanalyse identifiziert wurden, mit einer Hochdurchsatzreinigung und \–faltungsanalytik untersucht, um f{\"u}r die Strukturanalyse geeignete Kandidaten zu erhalten. Nach Expression in einem Milliliter im 96er Mikrotiterplattenformat und automatisierter Proteinreinigung wurden l{\"o}slich exprimierte Proteindom{\"a}nen direkt analysiert mittels 1D \&\#185;H-NMR Spektroskopie. Hierbei zeigte sich, dass insbesondere isolierte Methylgruppen-Signale unter 0.5 ppm sensitive und zuverl{\"a}ssige Sonden sind f{\"u}r gefaltetes Protein. Zus{\"a}tzlich zeigte sich, dass \– {\"a}hnlich zur Evaluierung des Faltungstests \– analytische HIC effizient eingesetzt werden kann zur Identifizierung von Konstrukten, welche kompakt gefaltetes Protein ergeben. Sechs Konstrukte, welche zwei Dom{\"a}nen repr{\"a}sentieren, konnten schnell als tauglich f{\"u}r die Strukturanalyse gefunden werden. Die Struktur einer dieser Dom{\"a}nen wurde k{\"u}rzlich von Mitarbeitern gel{\"o}st, die andere Struktur wurde im Laufe dieses Projektes von einer anderen Gruppe ver{\"o}ffentlicht.}, language = {en} } @phdthesis{Walter2002, author = {Walter, Monika}, title = {Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilit{\"a}t, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000588}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2002}, abstract = {Die Pektat-Lyasen geh{\"o}ren zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturons{\"a}ure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Prim{\"a}rzellw{\"a}nden. Der Abbau der alpha-1,4-verbr{\"u}ckten Galakturons{\"a}urereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer unges{\"a}ttigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. F{\"u}r die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium n{\"o}tig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsg{\"a}ngige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gel{\"o}st worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungef{\"a}hren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbr{\"u}cken enth{\"a}lt. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verh{\"a}ltnism{\"a}ßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen {\"u}ber die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins n{\"a}her zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage gekl{\"a}rt werden, welche Wechselwirkungen f{\"u}r die Stabilit{\"a}t dieses Proteins einerseits und f{\"u}r die Stabilit{\"a}t von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
R{\"u}ckfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollst{\"a}ndig m{\"o}glich. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit der R{\"u}ckfaltungsrate im Bereich des {\"U}bergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der R{\"u}ckfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollst{\"a}ndig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren k{\"o}nnen. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativ{\"a}hnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminos{\"a}uren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) f{\"u}hrte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivit{\"a}t, da die Mutationsstelle in der N{\"a}he der putativen Substratbindetasche liegt. Die R{\"u}ckfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10\&\#176;C ann{\"a}hernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht ver{\"a}ndert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands f{\"u}hrte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10\&\#176;C. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivit{\"a}t einen kooperativen Phasen{\"u}bergang mit einem {\"U}bergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die {\"U}bereinstimmung der Faltungs{\"u}berg{\"a}nge bei beiden Messparametern konnten die Faltungs{\"u}berg{\"a}nge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung f{\"u}r die Mutante von -\ 64.2\ \&\#177;\ 0.4\ kJ/mol und eine Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs von -\ 58.2\ \&\#177;\ 0.3\ kJ/(mol\&\#183;M) bestimmt.
BsPel enth{\"a}lt, wie die meisten monomeren rechtsg{\"a}ngigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbr{\"u}ckter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zug{\"a}nglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilit{\"a}t und R{\"u}ckfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A n{\"a}her analysiert. Dabei f{\"u}hrte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings f{\"u}hrten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsph{\"a}notyp und die Hysterese im Denaturierungs{\"u}bergang wurde verst{\"a}rkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr fr{\"u}h ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im {\"U}bergangszustand vorhanden.}, subject = {Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix }, language = {de} }