@phdthesis{Luschtinetz2010, author = {Luschtinetz, Franziska}, title = {Cyaninfarbstoffe als Fluoreszenzsonden in biomimetischen und biologischen Systemen : Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie und Fluoreszenzanisotropie-Untersuchungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-48478}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Um Prozesse in biologischen Systemen auf molekularer Ebene zu untersuchen, haben sich vor allem fluoreszenzspektroskopische Methoden bew{\"a}hrt. Die M{\"o}glichkeit, einzelne Molek{\"u}le zu beobachten, hat zu einem deutlichen Fortschritt im Verst{\"a}ndnis von elementaren biochemischen Prozessen gef{\"u}hrt. Zu einer der bekanntesten Methoden der Einzelmolek{\"u}lspektroskopie z{\"a}hlt die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), mit deren Hilfe intramolekulare und diffusionsgesteuerte Prozesse in einem Zeitbereich von µs bis ms untersucht werden k{\"o}nnen. Durch die Verwendung von sog. Fluoreszenzsonden k{\"o}nnen Informationen {\"u}ber deren molekulare Mikroumgebung erhalten werden. Insbesondere f{\"u}r die konfokale Mikroskopie und die Einzelmolek{\"u}lspektroskopie werden Fluoreszenzfarbstoffe mit einer hohen Photostabilit{\"a}t und hohen Fluoreszenzquantenausbeute ben{\"o}tigt. Aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzquantenausbeute und der M{\"o}glichkeit, maßgeschneiderte" Farbstoffe in einem breiten Spektralbereich f{\"u}r die Absorption und Fluoreszenz zu entwickeln, sind Cyaninfarbstoffe von besonderem Interesse f{\"u}r bioanalytische Anwendungen. Als Fluoreszenzmarker finden diese Farbstoffe insbesondere in der klinischen Diagnostik und den Lebenswissenschaften Verwendung. Die in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffe DY-635 und DY-647 sind zwei typische Vertreter dieser Farbstoffklasse. Durch Modifizierung k{\"o}nnen die Farbstoffe kovalent an biologisch relevante Molek{\"u}le gebunden werden. Aufgrund ihres Absorptionsmaximums oberhalb von 630nm werden sie insbesondere in der Bioanalytik eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurden die spektroskopischen Eigenschaften der Cyaninfarbstoffe DY-635 und DY-647 in biomimetischen und biologischen Modellsystemen untersucht. Zur Charakterisierung wurden dabei neben der Absorptionsspektroskopie insbesondere fluoreszenzspektroskopische Methoden verwendet. Dazu z{\"a}hlen die zeitkorrelierte Einzelphotonenz{\"a}hlung zur Ermittlung des Fluoreszenzabklingverhaltens, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zur Beobachtung von Diffusions- und photophysikalischen Desaktivierungsprozessen und die zeitaufgel{\"o}ste Fluoreszenzanisotropie zur Untersuchung der Rotationsdynamik und Beweglichkeit der Farbstoffe im jeweiligen Modellsystem. Das Biotin-Streptavidin-System wurde als Modellsystem f{\"u}r die Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen verwendet, da der Bindungsmechanismus weitgehend aufgekl{\"a}rt ist. Nach Bindung der Farbstoffe an Streptavidin wurde eine erhebliche Ver{\"a}nderung in den Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften beobachtet. Es wird angenommen, dass diese spektralen Ver{\"a}nderungen durch Wechselwirkung von benachbarten, an ein Streptavidintetramer gebundenen Farbstoffmolek{\"u}len und Bildung von H-Dimeren verursacht wird. F{\"u}r das System Biotin-Streptavidin ist bekannt, dass w{\"a}hrend der Bindung des Liganden (Biotin) an das Protein eine Konformations{\"a}nderung auftritt. Anhand von zeitaufgel{\"o}sten Fluoreszenzanisotropieuntersuchungen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese strukturellen Ver{\"a}nderungen zu einer starken Einschr{\"a}nkung der Beweglichkeit des Farbstoffes DY-635B f{\"u}hren. Liegt eine Mischung von ungebundenem und Streptavidin-gebundenem Farbstoff vor, k{\"o}nnen die Anisotropieabklingkurven nicht nach einem exponentiellen Verlauf angepasst werden. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass in diesem Fall die Auswertung mit Hilfe des Assoziativen Anisotropiemodells m{\"o}glich ist, welches eine Unterscheidung der Beitr{\"a}ge aus den zwei verschiedenen Mikroumgebungen erm{\"o}glicht. Als zweites Modellsystem dieser Arbeit wurden Mizellen des nichtionischen Tensids Tween-20 eingesetzt. Mizellen bilden eines der einfachsten Systeme, um die Mikroumgebung einer biologischen Membran nachzuahmen. Sind die Farbstoffe in den Mizellen eingelagert, so kommt es zu keiner Ver{\"a}nderung der Mizellgr{\"o}ße. Die ermittelten Werte des Diffusionskoeffizienten der mizellar eingelagerten Farbstoffe spiegeln demzufolge die Translationsbewegung der Tween-20-Mizellen wider. Die Beweglichkeit der Farbstoffe innerhalb der Tween-20-Mizellen wurde durch zeitaufgel{\"o}ste Fluoreszenzanisotropiemessungen untersucht. Neben der „Wackelbewegung", entsprechend dem wobble-in-a-cone-Modell, wird zus{\"a}tzlich noch die laterale Diffusion der Farbstoffe entlang der Mizelloberfl{\"a}che beschrieben.}, language = {de} }