@phdthesis{Walter2002,
author = {Walter, Monika},
title = {Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilit{\"a}t, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000588},
school = {Universit{\"a}t Potsdam},
year = {2002},
abstract = {Die Pektat-Lyasen geh{\"o}ren zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturons{\"a}ure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Prim{\"a}rzellw{\"a}nden. Der Abbau der alpha-1,4-verbr{\"u}ckten Galakturons{\"a}urereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer unges{\"a}ttigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. F{\"u}r die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium n{\"o}tig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsg{\"a}ngige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gel{\"o}st worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungef{\"a}hren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbr{\"u}cken enth{\"a}lt. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verh{\"a}ltnism{\"a}ßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen {\"u}ber die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins n{\"a}her zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage gekl{\"a}rt werden, welche Wechselwirkungen f{\"u}r die Stabilit{\"a}t dieses Proteins einerseits und f{\"u}r die Stabilit{\"a}t von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
R{\"u}ckfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollst{\"a}ndig m{\"o}glich. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit der R{\"u}ckfaltungsrate im Bereich des {\"U}bergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der R{\"u}ckfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollst{\"a}ndig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren k{\"o}nnen. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativ{\"a}hnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminos{\"a}uren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) f{\"u}hrte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivit{\"a}t, da die Mutationsstelle in der N{\"a}he der putativen Substratbindetasche liegt. Die R{\"u}ckfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10\&\#176;C ann{\"a}hernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht ver{\"a}ndert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands f{\"u}hrte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10\&\#176;C. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivit{\"a}t einen kooperativen Phasen{\"u}bergang mit einem {\"U}bergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die {\"U}bereinstimmung der Faltungs{\"u}berg{\"a}nge bei beiden Messparametern konnten die Faltungs{\"u}berg{\"a}nge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung f{\"u}r die Mutante von -\ 64.2\ \&\#177;\ 0.4\ kJ/mol und eine Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs von -\ 58.2\ \&\#177;\ 0.3\ kJ/(mol\&\#183;M) bestimmt.
BsPel enth{\"a}lt, wie die meisten monomeren rechtsg{\"a}ngigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbr{\"u}ckter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zug{\"a}nglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilit{\"a}t und R{\"u}ckfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A n{\"a}her analysiert. Dabei f{\"u}hrte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings f{\"u}hrten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsph{\"a}notyp und die Hysterese im Denaturierungs{\"u}bergang wurde verst{\"a}rkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr fr{\"u}h ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im {\"U}bergangszustand vorhanden.},
subject = {Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix },
language = {de}
}