@misc{MiticGrafeBatsiosetal.2022, author = {Mitic, Kristina and Grafe, Marianne and Batsios, Petros and Meyer, Irene}, title = {Partial Disassembly of the Nuclear Pore Complex Proteins during Semi-Closed Mitosis in Dictyostelium discoideum}, series = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe}, journal = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe}, number = {3}, issn = {1866-8372}, doi = {10.25932/publishup-54534}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-545341}, pages = {16}, year = {2022}, abstract = {Dictyostelium cells undergo a semi-closed mitosis, during which the nuclear envelope (NE) persists; however, free diffusion between the cytoplasm and the nucleus takes place. To permit the formation of the mitotic spindle, the nuclear envelope must be permeabilized in order to allow diffusion of tubulin dimers and spindle assembly factors into the nucleus. In Aspergillus, free diffusion of proteins between the cytoplasm and the nucleus is achieved by a partial disassembly of the nuclear pore complexes (NPCs) prior to spindle assembly. In order to determine whether this is also the case in Dictyostelium, we analysed components of the NPC by immunofluorescence microscopy and live cell imaging and studied their behaviour during interphase and mitosis. We observed that the NPCs are absent from the contact area of the nucleoli and that some nucleoporins also localize to the centrosome and the spindle poles. In addition, we could show that, during mitosis, the central FG protein NUP62, two inner ring components and Gle1 depart from the NPCs, while all other tested NUPs remained at the NE. This leads to the conclusion that indeed a partial disassembly of the NPCs takes place, which contributes to permeabilisation of the NE during semi-closed mitosis.}, language = {en} } @misc{GrafeHofmannBatsiosetal.2020, author = {Grafe, Marianne and Hofmann, Phillip and Batsios, Petros and Meyer, Irene and Gr{\"a}f, Ralph}, title = {In vivo assembly of a Dictyostelium lamin mutant induced by light, mechanical stress, and pH}, series = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe}, journal = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe}, number = {8}, issn = {1866-8372}, doi = {10.25932/publishup-52507}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525075}, pages = {16}, year = {2020}, abstract = {We expressed Dictyostelium lamin (NE81) lacking both a functional nuclear localization signal and a CAAX-box for C-terminal lipid modification. This lamin mutant assembled into supramolecular, three-dimensional clusters in the cytosol that disassembled at the onset of mitosis and re-assembled in late telophase, thus mimicking the behavior of the endogenous protein. As disassembly is regulated by CDK1-mediated phosphorylation at serine 122, we generated a phosphomimetic S122E mutant called GFP-NE81-S122E-∆NLS∆CLIM. Surprisingly, during imaging, the fusion protein assembled into cytosolic clusters, similar to the protein lacking the phosphomimetic mutation. Clusters disassembled again in the darkness. Assembly could be induced with blue but not green or near ultraviolet light, and it was independent of the fusion tag. Assembly similarly occurred upon cell flattening. Earlier reports and own observations suggested that both blue light and cell flattening could result in a decrease of intracellular pH. Indeed, keeping the cells at low pH also reversibly induced cluster formation. Our results indicate that lamin assembly can be induced by various stress factors and that these are transduced via intracellular acidification. Although these effects have been shown in a phosphomimetic CDK1 mutant of the Dictyostelium lamin, they are likely relevant also for wild-type lamin.}, language = {en} } @phdthesis{Grafe2019, author = {Grafe, Marianne Erika}, title = {Analysis of supramolecular assemblies of NE81, the first lamin protein in a non-metazoan organism}, doi = {10.25932/publishup-44180}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-441802}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {V, 94}, year = {2019}, abstract = {Lamine sind Proteine an der inneren Kernh{\"u}lle und bilden zusammen mit verbundenen Proteinen die nukle{\"a}re Lamina. Dieses Netzwerk sorgt f{\"u}r die Stabilit{\"a}t des Zellkerns und unterst{\"u}tzt die Organisation des Zell-Zytoskeletts. Zus{\"a}tzlich sind Lamine und ihre verbundenen Proteine in viele Prozesse wie Genregulation und Zelldifferenzierung involviert. Bis 2012 war der Stand der Forschung, dass nur bei mehrzelligen Organismen eine nukle{\"a}re Lamina zu finden ist. NE81 ist das erste lamin-{\"a}hnliche Protein, das in einem nicht-mehrzelligen Organismus (Dictyostelium discoideum) entdeckt wurde. Es hat viele Eigenschaften und Strukturmerkmale mit Laminen gemeinsam. Dazu z{\"a}hlt der dreiteilige Aufbau des Proteins, eine Phosphorylierungsstelle f{\"u}r ein Zellzyklus-abh{\"a}ngiges Enzym, ein Kernlokalisationssignal, wodurch das Protein in den Kern transportiert wird, sowie eine C-terminale Sequenz zur Verankerung des Proteins in der Kernh{\"u}lle. In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zur vereinfachten Untersuchung von Laminstrukturen getestet, um zu zeigen, dass sich NE81 wie bereits bekannte Lamin-Proteine verh{\"a}lt und supramolekulare Netzwerke aus Laminfilamenten bildet. Zur Analyse der Struktur supramolekularer Anordnungen wurde das Protein durch Entfernen des Kernlokalisationssignals auf der {\"a}ußeren Kernh{\"u}lle von Dictyostelium gebildet. Die anschließende Untersuchung der Oberfl{\"a}che der Kerne mit einem Rasterelektronenmikroskop zeigte, dass NE81 Strukturen in der Gr{\"o}ße von Laminen bildet, allerdings nicht in regelm{\"a}ßigen filament{\"o}sen Anordnungen. Um die Entstehung der Laminfilamente zu untersuchen, wurde l{\"o}sliches NE81 aus Dictyostelium aufgereinigt und mit verschiedenen mikroskopischen Methoden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass NE81 unter Niedrigsalz-Bedingungen d{\"u}nne, fadenf{\"o}rmige Strukturen und Netzwerke ausbildet, die denen von S{\"a}ugetier-Laminen sehr {\"a}hnlich sind. Die Mutation der Phosphorylierungsstelle von NE81 zu einer imitierenden dauerhaften Phosphorylierung von NE81 in der Zelle, zeigte zun{\"a}chst ein gel{\"o}stes Protein, das {\"u}berraschenderweise unter Blaulichtbestrahlung der Zelle wieder lamin-{\"a}hnliche Anordnungen formte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass NE81 echte Laminstrukturen ausbilden kann und hebt Dictyostelium als Nicht-S{\"a}ugetier-Modellorganismus mit einer gut charakterisierten Kernh{\"u}lle, mit allen relevanten, aus tierischen Zellen bekannten Proteinen, hervor.}, language = {en} } @phdthesis{Putzler2016, author = {Putzler, Sascha}, title = {Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394689}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {111}, year = {2016}, abstract = {Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell f{\"u}r acentriol{\"a}re Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe f{\"u}r Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am {\"U}bergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilit{\"a}t in FRAP-Experimenten w{\"a}hrend der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der sp{\"a}ten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Dom{\"a}ne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volll{\"a}ngenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Dom{\"a}ne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der N{\"a}he des Centrosoms. Es zeigt eine partiell {\"a}hnliche mitotische Verteilung wie das Volll{\"a}ngenprotein. Dies l{\"a}sst eine regulatorische Dom{\"a}ne innerhalb der Coiled-Coil Dom{\"a}ne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdr{\"u}ckt die Expression des endogenen CP91 und bringt {\"u}berz{\"a}hlige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zus{\"a}tzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erh{\"o}hte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erh{\"o}hten Zellgr{\"o}ße und Defekten im Abschn{\"u}rungsprozess w{\"a}hrend der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und f{\"u}r den Zusammenhalt der beiden {\"a}ußeren Schichten der Kernstruktur ben{\"o}tigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle f{\"u}r eine ordnungsgem{\"a}ße Centrosomenbiogenese und, unabh{\"a}ngig davon, bei dem Abschn{\"u}rungsprozess der Tochterzellen w{\"a}hrend der Cytokinese.}, language = {de} } @misc{BatsiosRenBaumannetal.2016, author = {Batsios, Petros and Ren, Xiang and Baumann, Otto and Larochelle, Denis A. and Gr{\"a}f, Ralph}, title = {Src1 is a Protein of the Inner Nuclear Membrane Interacting with the Dictyostelium Lamin NE81}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-97033}, pages = {15}, year = {2016}, abstract = {The nuclear envelope (NE) consists of the outer and inner nuclear membrane (INM), whereby the latter is bound to the nuclear lamina. Src1 is a Dictyostelium homologue of the helix-extension-helix family of proteins, which also includes the human lamin-binding protein MAN1. Both endogenous Src1 and GFP-Src1 are localized to the NE during the entire cell cycle. Immuno-electron microscopy and light microscopy after differential detergent treatment indicated that Src1 resides in the INM. FRAP experiments with GFP-Src1 cells suggested that at least a fraction of the protein could be stably engaged in forming the nuclear lamina together with the Dictyostelium lamin NE81. Both a BioID proximity assay and mis-localization of soluble, truncated mRFP-Src1 at cytosolic clusters consisting of an intentionally mis-localized mutant of GFP-NE81 confirmed an interaction of Src1 and NE81. Expression GFP-Src11-646, a fragment C-terminally truncated after the first transmembrane domain, disrupted interaction of nuclear membranes with the nuclear lamina, as cells formed protrusions of the NE that were dependent on cytoskeletal pulling forces. Protrusions were dependent on intact microtubules but not actin filaments. Our results indicate that Src1 is required for integrity of the NE and highlight Dictyostelium as a promising model for the evolution of nuclear architecture.}, language = {en} } @phdthesis{Peter2016, author = {Peter, Tatjana}, title = {Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96472}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {III, 93}, year = {2016}, abstract = {Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur {\"u}bernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zur{\"u}ck. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder {\"u}berzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis daf{\"u}r, dass I in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms.}, language = {de} } @phdthesis{Kuhnert2012, author = {Kuhnert, Oliver}, title = {Charakterisierung der neuen centrosomalen Proteine CP148 und CP55 in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-59949}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2012}, abstract = {Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es {\"u}ber eine spezifische Verbindung eng an den Kern gekn{\"u}pft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M {\"U}bergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabh{\"a}ngige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. W{\"a}hrend der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 {\"U}berexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi f{\"u}hrte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe w{\"a}hrend der Interphase und Mitose {\"u}ber verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine ver{\"a}nderte Sun1 Lokalisation in der Kernh{\"u}lle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein f{\"u}r die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum f{\"u}r die Centrosom/Centromer Verbindung ben{\"o}tigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt w{\"a}hrend des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Molek{\"u}le in der Interphase keine Mobilit{\"a}t zeigten. Die GFP-CP55 {\"U}berexpression f{\"u}hrte zur Bildung von {\"u}berz{\"a}hligen Centrosomen mit der {\"u}blichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erh{\"o}hte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergr{\"o}ßerte Corona sowie zus{\"a}tzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der fr{\"u}hen Metaphase anstatt, wie {\"u}blich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Dar{\"u}ber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeintr{\"a}chtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden.}, language = {de} } @phdthesis{Krueger2011, author = {Kr{\"u}ger, Anne}, title = {Molekulare Charakterisierung von NE81 und CP75, zwei kernh{\"u}llen- und centrosomassoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-53915}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2011}, abstract = {Lamine bilden zusammen mit laminassoziierten Proteinen die nukle{\"a}re Lamina. Diese ist notwendig f{\"u}r die mechanische Stabilit{\"a}t von Zellen, die Organisation des Chromatins, der Genexpression, dem Fortgang des Zellzyklus und der Zellmigration. Die vielf{\"a}ltigen Funktionen der Lamine werden durch die Pathogenese von Laminopathien belegt. Zu diesen Erkrankungen, welche ihre Ursache in Mutationen innerhalb der laminkodierenden Gene, oder der Gene laminassoziierter bzw. laminprozessierender Proteine haben, z{\"a}hlen unter anderem das „Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom", die „Emery-Dreifuss" Muskeldystrophie und die dilatierte Kardiomyopathie. Trotz der fundamentalen Bedeutung der Lamine, wurden diese bisher nur in Metazoen und nicht in einzelligen Organismen detektiert. Der am{\"o}bide Organismus Dictyostelium discoideum ist ein haploider Eukaryot, der h{\"a}ufig als Modellorganismus in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie eingesetzt wird. Mit der Entdeckung von NE81, einem Protein das mit der inneren Kernh{\"u}lle von Dictyostelium discoideum assoziiert ist, wurde erstmals ein Protein identifiziert, dass man aufgrund seiner Eigenschaften als lamin{\"a}hnliches Protein in einem niederen Eukaryoten bezeichnen kann. Diese Merkmale umfassen die Existenz lamintypischer Sequenzen, wie die CDK1-Phosphorylierungsstelle, direkt gefolgt von einer zentralen „Rod"-Dom{\"a}ne, sowie eine typische NLS und die hoch konservierte CaaX-Box. F{\"u}r die Etablierung des NE81 als „primitives" Lamin, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Experimente durchgef{\"u}hrt, die strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten zu den Laminen in anderen Organismen aufzeigen konnten. Die Herstellung eines polyklonalen Antik{\"o}rpers erm{\"o}glichte die Verifizierung der subzellul{\"a}ren Lokalisation des NE81 durch Elektronenmikroskopie und gab Einblicke in das Verhalten des endogenen Proteins innerhalb des Zellzyklus. Mit der Generierung von NE81-Nullmutanten konnte demonstriert werden, dass NE81 eine wichtige Rolle bei der nukle{\"a}ren Integrit{\"a}t und der Chromatinorganisation von Zellen spielt. Des Weiteren f{\"u}hrte die Expression von zwei CaaX-Box deletierten NE81 - Varianten dazu, den Einfluss des Proteins auf die mechanische Stabilit{\"a}t der Zellen nachweisen zu k{\"o}nnen. Auch die Bedeutung der hochkonservierten CaaX-Box f{\"u}r die Lokalisation des Proteins wurde durch die erhaltenen Ergebnisse deutlich. Mit der Durchf{\"u}hrung von FRAP-Experimente konnte außerdem die strukturgebende Funktion von NE81 innerhalb des Zellkerns bekr{\"a}ftigt werden. Zus{\"a}tzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen, den Einfluss der Isoprenylcysteincarboxylmethyltransferase auf die Lokalisation des Proteins aufzukl{\"a}ren. Die Entdeckung eines lamin{\"a}hnlichen Proteins in einem einzelligen Organismus, der an der Schwelle zu den Metazoen steht, ist f{\"u}r die evolution{\"a}re Betrachtung der Entwicklung der sozialen Am{\"o}be und f{\"u}r die Erforschung der molekularen Basis von Laminopathien in einem einfachen Modellorganismus sehr interessant. Die Arbeit mit Dictyostelium discoideum k{\"o}nnte daher Wege aufzeigen, dass Studium der Laminopathien am Tiermodell drastisch zu reduzieren. In den letzten Jahren hat die Erforschung unbekannter Bestandteile des Centrosoms in Dictyostelium discoideum große Fortschritte gemacht. Eine zu diesem Zwecke von unserer Arbeitsgruppe durchgef{\"u}hrte Proteomstudie, f{\"u}hrte zur Identifizierung weiterer, potentiell centrosomaler Kandidatenproteine. Der zweite Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Kandidatenproteins, dem CP75. Es konnte gezeigt werden, dass CP75 einen echten, centrosomalen Bestandteil darstellt, der mikrotubuli-unabh{\"a}ngig mit der Core Struktur des Zellorganells assoziiert ist. Weiterhin wurde deutlich, dass die Lokalisation am Centrosom in Abh{\"a}ngigkeit vom Zellzyklus erfolgt und CP75 vermutlich mit CP39, einem weiteren centrosomalen Core Protein, interagiert.}, language = {de} } @phdthesis{Samereier2011, author = {Samereier, Matthias}, title = {Functional analyses of microtubule and centrosome-associated proteins in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-52835}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2011}, abstract = {Understanding the role of microtubule-associated proteins is the key to understand the complex mechanisms regulating microtubule dynamics. This study employs the model system Dictyostelium discoideum to elucidate the role of the microtubule-associated protein TACC (Transforming acidic coiled-coil) in promoting microtubule growth and stability. Dictyostelium TACC was localized at the centrosome throughout the entire cell cycle. The protein was also detected at microtubule plus ends, however, unexpectedly only during interphase but not during mitosis. The same cell cycle-dependent localization pattern was observed for CP224, the Dictyostelium XMAP215 homologue. These ubiquitous MAPs have been found to interact with TACC proteins directly and are known to act as microtubule polymerases and nucleators. This work shows for the first time in vivo that both a TACC and XMAP215 family protein can differentially localize to microtubule plus ends during interphase and mitosis. RNAi knockdown mutants revealed that TACC promotes microtubule growth during interphase and is essential for proper formation of astral microtubules in mitosis. In many organisms, impaired microtubule stability upon TACC depletion was explained by the failure to efficiently recruit the TACC-binding XMAP215 protein to centrosomes or spindle poles. By contrast, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analyses conducted in this study demonstrate that in Dictyostelium recruitment of CP224 to centrosomes or spindle poles is not perturbed in the absence of TACC. Instead, CP224 could no longer be detected at the tips of microtubules in TACC mutant cells. This finding demonstrates for the first time in vivo that a TACC protein is essential for the association of an XMAP215 protein with microtubule plus ends. The GFP-TACC strains generated in this work also turned out to be a valuable tool to study the unusual microtubule dynamics in Dictyostelium. Here, microtubules exhibit a high degree of lateral bending movements but, in contrast most other organisms, they do not obviously undergo any growth or shrinkage events during interphase. Despite of that they are affected by microtubuledepolymerizing drugs such as thiabendazole or nocodazol which are thought to act solely on dynamic microtubules. Employing 5D-fluorescence live cell microscopy and FRAP analyses this study suggests Dictyostelium microtubules to be dynamic only in the periphery, while they are stable at the centrosome. In the recent years, the identification of yet unknown components of the Dictyostelium centrosome has made tremendous progress. A proteomic approach previously conducted by our group disclosed several uncharacterized candidate proteins, which remained to be verified as genuine centrosomal components. The second part of this study focuses on the investigation of three such candidate proteins, Cenp68, CP103 and the putative spindle assembly checkpoint protein Mad1. While a GFP-CP103 fusion protein could clearly be localized to isolated centrosomes that are free of microtubules, Cenp68 and Mad1 were found to associate with the centromeres and kinetochores, respectively. The investigation of Cenp68 included the generation of a polyclonal anti-Cenp68 antibody, the screening for interacting proteins and the generation of knockout mutants which, however, did not display any obvious phenotype. Yet, Cenp68 has turned out as a very useful marker to study centromere dynamics during the entire cell cycle. During mitosis, GFP-Mad1 localization strongly resembled the behavior of other Mad1 proteins, suggesting the existence of a yet uncharacterized spindle assembly checkpoint in Dictyostelium.}, language = {en} }