@phdthesis{Nietzsche2016,
  author    = {Nietzsche, Madlen},
  title     = {Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {xi, 182},
  year      = {2016},
  abstract  = {F{\"u}r alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolution{\"a}r konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von N{\"a}hrstoffen und zellul{\"a}rer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege f{\"u}hrt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort f{\"u}hren ist bisher noch nicht ausreichend gekl{\"a}rt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zun{\"a}chst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind {\"u}ber ihre konservierte DUF581Dom{\"a}ne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, f{\"a}hig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung beg{\"u}nstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta best{\"a}tigt werden. Außerhalb der DUF581-Dom{\"a}ne weisen die Proteine einander keine große Sequenz{\"a}hnlichkeit auf. Aufgrund ihrer F{\"a}higkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde f{\"u}r DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise k{\"o}nnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung erm{\"o}glichen. Durch weiterf{\"u}hrende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine f{\"u}r das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde n{\"a}her charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, geh{\"o}rt zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterst{\"u}tzt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich {\"u}ber das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsf{\"a}higkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erh{\"o}hte Spezifit{\"a}t der Zielgenregulation erm{\"o}glicht werden k{\"o}nnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer ver{\"a}nderten STKR1-Expression ph{\"a}notypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. W{\"a}hrend der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen f{\"u}hrte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive {\"U}berexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverz{\"o}gerungen hinsichtlich der Bl{\"u}hinduktion und Seneszenz {\"a}hnlich wie sie auch bei SnRK1α-{\"U}berexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erh{\"o}hten n{\"a}chtlichen St{\"a}rkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-{\"u}berexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verl{\"a}ngerte Dunkelphase, eine gr{\"o}ßere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als w{\"a}hrend der Lichtphase. Dies spricht f{\"u}r eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die w{\"a}hrend der verl{\"a}ngerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1{\"U}berexpression f{\"u}hrte zudem zu einer verst{\"a}rkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verl{\"a}ngerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabh{\"a}ngige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r die ph{\"a}notypischen und physiologischen Auff{\"a}lligkeiten der STKR1-{\"U}berexprimierer liefern.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Borschewski2015,
  author    = {Borschewski, Aljona},
  title     = {Bedeutung der Interaktion von Calcineurin und SORLA f{\"u}r die Regulation des Na⁺,K⁺,2Cl⁻-Kotransporters (NKCC2) in der Niere},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-89205},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {II, 86},
  year      = {2015},
  abstract  = {Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medull{\"a}ren und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport {\"u}ber den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivit{\"a}t des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminos{\"a}urereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden m{\"u}ssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. {\"U}ber Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters f{\"u}hren. Der intrazellul{\"a}re Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung f{\"u}r das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress k{\"o}nnen SORLA-defiziente M{\"a}use ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochaufl{\"o}sender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die f{\"u}r die NKCC2 Aktivit{\"a}t maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegen{\"u}ber dem Wildtyp nicht ver{\"a}ndert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verst{\"a}rktem CnAβ-Signal und NKCC2 best{\"a}tigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Pr{\"a}senz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte {\"U}berexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zellul{\"a}re Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne) mittels Co-Immunpr{\"a}zipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster f{\"u}r CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermedi{\"a}re Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) f{\"u}hrte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend f{\"u}hrte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ {\"u}ber ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivit{\"a}t von NKCC2 zu unterst{\"u}tzen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen k{\"o}nnen die Ergebnisse auch {\"u}ber die Niere hinaus Bedeutung erlangen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nitschke2013,
  author    = {Nitschke, Felix},
  title     = {Phosphorylation of polyglycans, especially glycogen and starch},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-67396},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2013},
  abstract  = {Functional metabolism of storage carbohydrates is vital to plants and animals. The water-soluble glycogen in animal cells and the amylopectin which is the major component of water-insoluble starch granules residing in plant plastids are chemically similar as they consist of α-1,6 branched α-1,4 glucan chains. Synthesis and degradation of transitory starch and of glycogen are accomplished by a set of enzymatic activities that to some extend are also similar in plants and animals. Chain elongation, branching, and debranching are achieved by synthases, branching enzymes, and debranching enzymes, respectively. Similarly, both types of polyglucans contain low amounts of phosphate esters whose abundance varies depending on species and organs. Starch is selectively phosphorylated by at least two dikinases (GWD and PWD) at the glucosyl carbons C6 and C3 and dephosphorylated by the phosphatase SEX4 and SEX4-like enzymes. In Arabidopsis insufficiency in starch phosphorylation or dephosphorylation results in largely impaired starch turnover, starch accumulation, and often in retardation of growth. In humans the progressive neurodegenerative epilepsy, Lafora disease, is the result of a defective enzyme (laforin) that is functional equivalent to the starch phosphatase SEX4 and capable of glycogen dephosphorylation. Patients lacking laforin progressively accumulate unphysiologically structured insoluble glycogen-derived particles (Lafora bodies) in many tissues including brain. Previous results concerning the carbon position of glycogen phosphate are contradictory. Currently it is believed that glycogen is esterified exclusively at the carbon positions C2 and C3 and that the monophosphate esters, being incorporated via a side reaction of glycogen synthase (GS), lack any specific function but are rather an enzymatic error that needs to be corrected. In this study a versatile and highly sensitive enzymatic cycling assay was established that enables quantification of very small G6P amounts in the presence of high concentrations of non-target compounds as present in hydrolysates of polysaccharides, such as starch, glycogen, or cytosolic heteroglycans in plants. Following validation of the G6P determination by analyzing previously characterized starches G6P was quantified in hydrolysates of various glycogen samples and in plant heteroglycans. Interestingly, glucosyl C6 phosphate is present in all glycogen preparations examined, the abundance varying between glycogens of different sources. Additionally, it was shown that carbon C6 is severely hyperphosphorylated in glycogen of Lafora disease mouse model and that laforin is capable of removing C6 phosphate from glycogen. After enrichment of phosphoglucans from amylolytically degraded glycogen, several techniques of two-dimensional NMR were applied that independently proved the existence of 6-phosphoglucosyl residues in glycogen and confirmed the recently described phosphorylation sites C2 and C3. C6 phosphate is neither Lafora disease- nor species-, or organ-specific as it was demonstrated in liver glycogen from laforin-deficient mice and in that of wild type rabbit skeletal muscle. The distribution of 6-phosphoglucosyl residues was analyzed in glycogen molecules and has been found to be uneven. Gradual degradation experiments revealed that C6 phosphate is more abundant in central parts of the glycogen molecules and in molecules possessing longer glucan chains. Glycogen of Lafora disease mice consistently contains a higher proportion of longer chains while most short chains were reduced as compared to wild type. Together with results recently published (Nitschke et al., 2013) the findings of this work completely unhinge the hypothesis of GS-mediated phosphate incorporation as the respective reaction mechanism excludes phosphorylation of this glucosyl carbon, and as it is difficult to explain an uneven distribution of C6 phosphate by a stochastic event. Indeed the results rather point to a specific function of 6-phosphoglucosyl residues in the metabolism of polysaccharides as they are present in starch, glycogen, and, as described in this study, in heteroglycans of Arabidopsis. In the latter the function of phosphate remains unclear but this study provides evidence that in starch and glycogen it is related to branching. Moreover a role of C6 phosphate in the early stages of glycogen synthesis is suggested. By rejecting the current view on glycogen phosphate to be a stochastic biochemical error the results permit a wider view on putative roles of glycogen phosphate and on alternative biochemical ways of glycogen phosphorylation which for many reasons are likely to be mediated by distinct phosphorylating enzymes as it is realized in starch metabolism of plants. Better understanding of the enzymology underlying glycogen phosphorylation implies new possibilities of Lafora disease treatment.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Himmel2004,
  author    = {Himmel, Mirko},
  title     = {Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2004},
  abstract  = {F{\"u}r ein tiefergehendes Verst{\"a}ndnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zun{\"a}chst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollst{\"a}ndig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Gr{\"o}ße der aminoterminalen Kopfdom{\"a}ne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Dom{\"a}nen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Dom{\"a}nen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabh{\"a}ngigen Antik{\"o}rper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. M{\"o}gliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin k{\"o}nnte eine zentrale Rolle f{\"u}r den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt.},
  subject      = {Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gehmlich2004,
  author    = {Gehmlich, Katja},
  title     = {Strukturen der Kraft{\"u}bertragung im quergestreiften Muskel : Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulationsmechanismen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2576},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2004},
  abstract  = {Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraft{\"u}bertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte w{\"a}hrend der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch {\"a}ndert, was mit einer ver{\"a}nderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur f{\"u}r fr{\"u}he Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben k{\"o}nnen. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorl{\"a}uferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin {\"u}ber eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen tern{\"a}ren Signalkomplex bilden, der die Umbauvorg{\"a}nge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivit{\"a}t von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorg{\"a}nge der Strukturen der Kraft{\"u}bertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ausl{\"o}st, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsf{\"a}higkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen k{\"o}nnte folglich eine Ver{\"a}nderung der Hom{\"o}ostase im tern{\"a}ren Komplex MLP \– N-RAP \– alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antik{\"o}rpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur f{\"u}r die Integrit{\"a}t des Myokards, sondern auch f{\"u}r die der Skelettmuskulatur notwendig sind.},
  subject      = {Herzmuskelkrankheit},
  language  = {de}
}