@article{HolzloehnerHanack2017,
  author    = {Holzl{\"o}hner, Pamela and Hanack, Katja},
  title     = {Generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology},
  series = {JoVE : Video journal},
  journal   = {JoVE : Video journal},
  number    = {119},
  publisher = {JoVE},
  address   = {Cambridge},
  issn      = {1940-087X},
  doi       = {10.3791/54832},
  pages     = {7},
  year      = {2017},
  abstract  = {Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Fuhrmann2018,
  author    = {Fuhrmann, Saskia},
  title     = {Physiologically-based pharmacokinetic and mechanism-based pharmacodynamic modelling of monoclonal antibodies with a focus on tumour targeting},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-418861},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {xvii, 171},
  year      = {2018},
  abstract  = {Monoclonal antibodies (mAbs) are an innovative group of drugs with increasing clinical importance in oncology, combining high specificity with generally low toxicity. There are, however, numerous challenges associated with the development of mAbs as therapeutics. Mechanistic understanding of factors that govern the pharmacokinetics (PK) of mAbs is critical for drug development and the optimisation of effective therapies; in particular, adequate dosing strategies can improve patient quality life and lower drug cost. Physiologically-based PK (PBPK) models offer a physiological and mechanistic framework, which is of advantage in the context of animal to human extrapolation. Unlike for small molecule drugs, however, there is no consensus on how to model mAb disposition in a PBPK context. Current PBPK models for mAb PK hugely vary in their representation of physiology and parameterisation. Their complexity poses a challenge for their applications, e.g., translating knowledge from animal species to humans. In this thesis, we developed and validated a consensus PBPK model for mAb disposition taking into account recent insights into mAb distribution (antibody biodistribution coefficients and interstitial immunoglobulin G (IgG) pharmacokinetics) to predict tissue PK across several pre-clinical species and humans based on plasma data only. The model allows to a priori predict target-independent (unspecific) mAb disposition processes as well as mAb disposition in concentration ranges, for which the unspecific clearance (CL) dominates target-mediated CL processes. This is often the case for mAb therapies at steady state dosing. The consensus PBPK model was then used and refined to address two important problems: 1) Immunodeficient mice are crucial models to evaluate mAb efficacy in cancer therapy. Protection from elimination by binding to the neonatal Fc receptor is known to be a major pathway influencing the unspecific CL of both, endogenous and therapeutic IgG. The concentration of endogenous IgG, however, is reduced in immunodeficient mouse models, and this effect on unspecific mAb CL is unknown, yet of great importance for the extrapolation to human in the context of mAb cancer therapy. 2) The distribution of mAbs into solid tumours is of great interest. To comprehensively investigate mAb distribution within tumour tissue and its implications for therapeutic efficacy, we extended the consensus PBPK model by a detailed tumour distribution model incorporating a cell-level model for mAb-target interaction. We studied the impact of variations in tumour microenvironment on therapeutic efficacy and explored the plausibility of different mechanisms of action in mAb cancer therapy. The mathematical findings and observed phenomena shed new light on therapeutic utility and dosing regimens in mAb cancer treatment.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dippong2017,
  author    = {Dippong, Martin},
  title     = {Direkte und indirekte Hapten-selektive Immunfluoreszenzmarkierung von Hybridomzellen zur Generierung monoklonaler Antik{\"o}rper},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {VII, 103},
  year      = {2017},
  abstract  = {Die Hybridomtechnik zur Produktion von monoklonalen Antik{\"o}rpern erm{\"o}glichte einen großen Schritt in der Entwicklung von Immunoassays f{\"u}r die biochemische Forschung und klinische Diagnostik. Auch die Produktion von Antik{\"o}rpern gegen niedermolekulare Analyten, Haptene, typische Targets in der Lebensmittel- und Umweltanalytik, erlangte in den letzten Jahren eine immer gr{\"o}ßere Bedeutung. Im Zuge der Durchf{\"u}hrung der Hybridomtechnik werden tausende Antik{\"o}rper-sezernierende und nicht-sezernierende Zellen generiert. Die Selektion der wenigen antigenselektiven Hybridomzellen z{\"a}hlt dabei zu den herausforderndsten Schritten f{\"u}r die Antik{\"o}rpergewinnung. Bisherige Selektionsverfahren, wie die Limiting-Dilution-Klonierung in Verbindung mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), garantieren keine Monoklonalit{\"a}t und erlauben nur das Screening von einigen wenigen Zellklonen. Hingegen erm{\"o}glichen Hochdurchsatz-Selektionsmethoden, wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), einen sehr hohen Probendurchsatz. Eine Einzelzellablage garantiert hierbei Monoklonalit{\"a}t. Jedoch sind die daf{\"u}r erforderlichen Zellmarkierungen oftmals zellsch{\"a}digend oder aufwendig zu generieren. Auch ist bisher noch keine Markierungsmethode bekannt, die es erm{\"o}glicht, Hapten-selektive Hybridomzellen durchflusszytometrisch zu analysieren und eine FACS-Selektion durchzuf{\"u}hren. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zwei Zellmarkierungsmethoden entwickelt, die dies erm{\"o}glichen sollten. Die membranst{\"a}ndigen Antik{\"o}rper von Hybridomzellen sollten entweder direkt oder indirekt immunfluoreszenz-markiert und dadurch f{\"u}r die Durchflusszytometrie und FACS-Selektion zug{\"a}nglich gemacht werden. Die direkte Markierung wurde mittels eines Hapten-Fluorophor-Konjugats durchgef{\"u}hrt. Sie erm{\"o}glichte erstmalig den Anteil an Haptenselektiven Hybridomzellen in einer Hybridomzelllinie zu {\"u}berpr{\"u}fen. Dies konnte f{\"u}r zwei Hapten-selektive Hybridomzelllinien, die Antik{\"o}rper gegen das Hormon 17β-Estradiol und das Cardenolid Digoxigenin bilden, gezeigt werden. Durchflusszytometrie und ELISAs lieferten vergleichbare Ergebnisse. Zellen, die Hapten-selektiv markiert werden konnten, sezernierten ebenfalls Hapten-selektive Antik{\"o}rper. Des Weiteren konnte die direkte Markierung dazu genutzt werden, zwei Mykotoxin-selektive Hybridomzelllinien, welche Antik{\"o}rper gegen Aflatoxin und Zearalenon bilden, auf Monoklonalit{\"a}t zu testen. Dies ist mittels ELISA nicht m{\"o}glich. Die Markierungsmethode eignete sich jedoch nur f{\"u}r fixierte Hybridomzellen. Eine Markierung von lebenden Zellen konnte weder durchflusszytometrisch noch mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt werden. Dies gelang erst mit einer neu entwickelten indirekten Immunfluoreszenzmarkierung. Dabei wurden die Zellen zun{\"a}chst mit einem Hapten-Peroxidase-Konjugat inkubiert, gefolgt von einem Fluorophor-markierten anti-HRP-Antik{\"o}rper-Konjugat. Dies wurde f{\"u}r zwei Analyten, das Hormon Estron und das Antiepileptikum Carbamazepin, gezeigt. Die indirekte Markierung wurde erfolgreich dazu verwendet, Carbamazepin-selektive Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz f{\"u}r die monoklonale Antik{\"o}rperproduktion auszusortieren. Damit wurde erstmalig eine Zellmarkierungsmethode entwickelt, die eine Hochdurchsatz-Selektion lebender Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz erm{\"o}glicht. Sie ist nicht zellsch{\"a}digend und kann zus{\"a}tzlich zur Selektion Hapten-selektiver Plasmazellen verwendet werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Werner2002,
  author    = {Werner, Deljana},
  title     = {Versuche zur Gewinnung von katalytischen Antik{\"o}rpern zur Hydrolyse von Arylcarbamaten und Arylharnstoffen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000463},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2002},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antik{\"o}rper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antik{\"o}rper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antik{\"o}rper wurden Inzuchtm{\"a}use mit KLH-Konjugaten von 4 {\"U}bergangszustandsanaloga ({\"U}ZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antik{\"o}rper gegen diese {\"U}ZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausst{\"a}mme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antik{\"o}rper gegen die verwendeten {\"U}ZA selektiert. Diese Antik{\"o}rper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antik{\"o}rper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antik{\"o}rpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivit{\"a}t gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antik{\"o}rper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivit{\"a}t dieser Antik{\"o}rper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antik{\"o}rper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 \&\#181;M, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antik{\"o}rpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das {\"U}ZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivit{\"a}t. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antik{\"o}rperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abh{\"a}ngigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinit{\"a}t zum {\"U}ZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antik{\"o}rper, die gegen das {\"U}bergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate {\"u}ber einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen {\"U}bergangszustandes verl{\"a}uft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantik{\"o}rpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antik{\"o}rper hergestellt. Einer der Antik{\"o}rper (B91-CG5) ist spezifisch f{\"u}r das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 \&\#181;g/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 \&\#181;g/l. Ein anderer Antik{\"o}rper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette {\"a}hnlicher Herbizide. Mit diesen Antik{\"o}rpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes f{\"u}r Pflanzenschutzmittel von 0,1 \&\#181;g/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antik{\"o}rper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antik{\"o}rper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung f{\"u}hrt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so f{\"u}hrte die Zugabe der Anti-Diuron-Antik{\"o}rper zur Reaktivierung der Elektronen{\"u}bertragung.},
  language  = {de}
}