@article{PutzlerMeyerGraef2016, author = {Putzler, Sascha and Meyer, Irene and Gr{\"a}f, Ralph}, title = {CP91 is a component of the Dictyostelium centrosome involved in centrosome biogenesis}, series = {European journal of cell biology}, volume = {95}, journal = {European journal of cell biology}, publisher = {Royal Society}, address = {Jena}, issn = {0171-9335}, doi = {10.1016/j.ejcb.2016.03.001}, pages = {124 -- 135}, year = {2016}, abstract = {The Dictyostelium centrosome is a model for acentriolar centrosomes and it consists of a three-layered core structure surrounded by a corona harboring microtubule nucleation complexes. Its core structure duplicates once per cell cycle at the G2/M transition. Through proteomic analysis of isolated centrosomes we have identified CP91, a 91-kDa coiled coil protein that was localized at the centrosomal core structure. While GFP-CP91 showed almost no mobility in FRAP experiments during interphase, both GFP-CP91 and endogenous CP91 dissociated during mitosis and were absent from spindle poles from late prophase to anaphase. Since this behavior correlates with the disappearance of the central layer upon centrosome duplication, CP91 is a putative component of this layer. When expressed as GFP-fusions, CP91 fragments corresponding to the central coiled coil domain and the preceding N-terminal part (GFP-CP91cc and GFP-CP91N, respectively) also localized to the centrosome but did not show the mitotic redistribution of the full length protein suggesting a regulatory role of the C-terminal domain. Expression of all GFP-fusion proteins suppressed expression of endogenous CP91 and elicited supernumerary centrosomes. This was also very prominent upon depletion of CP91 by RNAi. Additionally, CP91-RNAi cells exhibited heavily increased ploidy due to severe defects in chromosome segregation along with increased cell size and defects in the abscission process during cytokinesis. Our results indicate that CP91 is a central centrosomal core component required for centrosomal integrity, proper centrosome biogenesis and, independently, for abscission during cytokinesis. (c) 2016 Elsevier GmbH. All rights reserved.}, language = {en} } @phdthesis{Putzler2016, author = {Putzler, Sascha}, title = {Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394689}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {111}, year = {2016}, abstract = {Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell f{\"u}r acentriol{\"a}re Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe f{\"u}r Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am {\"U}bergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilit{\"a}t in FRAP-Experimenten w{\"a}hrend der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der sp{\"a}ten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Dom{\"a}ne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volll{\"a}ngenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Dom{\"a}ne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der N{\"a}he des Centrosoms. Es zeigt eine partiell {\"a}hnliche mitotische Verteilung wie das Volll{\"a}ngenprotein. Dies l{\"a}sst eine regulatorische Dom{\"a}ne innerhalb der Coiled-Coil Dom{\"a}ne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdr{\"u}ckt die Expression des endogenen CP91 und bringt {\"u}berz{\"a}hlige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zus{\"a}tzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erh{\"o}hte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erh{\"o}hten Zellgr{\"o}ße und Defekten im Abschn{\"u}rungsprozess w{\"a}hrend der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und f{\"u}r den Zusammenhalt der beiden {\"a}ußeren Schichten der Kernstruktur ben{\"o}tigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle f{\"u}r eine ordnungsgem{\"a}ße Centrosomenbiogenese und, unabh{\"a}ngig davon, bei dem Abschn{\"u}rungsprozess der Tochterzellen w{\"a}hrend der Cytokinese.}, language = {de} } @misc{BatsiosRenBaumannetal.2016, author = {Batsios, Petros and Ren, Xiang and Baumann, Otto and Larochelle, Denis A. and Gr{\"a}f, Ralph}, title = {Src1 is a Protein of the Inner Nuclear Membrane Interacting with the Dictyostelium Lamin NE81}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-97033}, pages = {15}, year = {2016}, abstract = {The nuclear envelope (NE) consists of the outer and inner nuclear membrane (INM), whereby the latter is bound to the nuclear lamina. Src1 is a Dictyostelium homologue of the helix-extension-helix family of proteins, which also includes the human lamin-binding protein MAN1. Both endogenous Src1 and GFP-Src1 are localized to the NE during the entire cell cycle. Immuno-electron microscopy and light microscopy after differential detergent treatment indicated that Src1 resides in the INM. FRAP experiments with GFP-Src1 cells suggested that at least a fraction of the protein could be stably engaged in forming the nuclear lamina together with the Dictyostelium lamin NE81. Both a BioID proximity assay and mis-localization of soluble, truncated mRFP-Src1 at cytosolic clusters consisting of an intentionally mis-localized mutant of GFP-NE81 confirmed an interaction of Src1 and NE81. Expression GFP-Src11-646, a fragment C-terminally truncated after the first transmembrane domain, disrupted interaction of nuclear membranes with the nuclear lamina, as cells formed protrusions of the NE that were dependent on cytoskeletal pulling forces. Protrusions were dependent on intact microtubules but not actin filaments. Our results indicate that Src1 is required for integrity of the NE and highlight Dictyostelium as a promising model for the evolution of nuclear architecture.}, language = {en} } @article{BatsiosRenBaumannetal.2016, author = {Batsios, Petros and Ren, Xiang and Baumann, Otto and Larochelle, Denis A. and Gr{\"a}f, Ralph}, title = {Src1 is a Protein of the Inner Nuclear Membrane Interacting with the Dictyostelium Lamin NE81}, series = {Cells}, volume = {5}, journal = {Cells}, number = {1}, publisher = {MDPI}, address = {Basel}, issn = {2073-4409}, doi = {10.3390/cells5010013}, year = {2016}, abstract = {The nuclear envelope (NE) consists of the outer and inner nuclear membrane (INM), whereby the latter is bound to the nuclear lamina. Src1 is a Dictyostelium homologue of the helix-extension-helix family of proteins, which also includes the human lamin-binding protein MAN1. Both endogenous Src1 and GFP-Src1 are localized to the NE during the entire cell cycle. Immuno-electron microscopy and light microscopy after differential detergent treatment indicated that Src1 resides in the INM. FRAP experiments with GFP-Src1 cells suggested that at least a fraction of the protein could be stably engaged in forming the nuclear lamina together with the Dictyostelium lamin NE81. Both a BioID proximity assay and mis-localization of soluble, truncated mRFP-Src1 at cytosolic clusters consisting of an intentionally mis-localized mutant of GFP-NE81 confirmed an interaction of Src1 and NE81. Expression GFP-Src11-646, a fragment C-terminally truncated after the first transmembrane domain, disrupted interaction of nuclear membranes with the nuclear lamina, as cells formed protrusions of the NE that were dependent on cytoskeletal pulling forces. Protrusions were dependent on intact microtubules but not actin filaments. Our results indicate that Src1 is required for integrity of the NE and highlight Dictyostelium as a promising model for the evolution of nuclear architecture.}, language = {en} } @phdthesis{Peter2016, author = {Peter, Tatjana}, title = {Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96472}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {III, 93}, year = {2016}, abstract = {Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur {\"u}bernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zur{\"u}ck. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder {\"u}berzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis daf{\"u}r, dass I in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms.}, language = {de} }