@phdthesis{Michelchen2021,
  author    = {Michelchen, Sophia},
  title     = {Etablierung einer Antigen-spezifischen Aktivierung von B-Lymphozyten in vitro},
  doi       = {10.25932/publishup-53027},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-530272},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XII,107},
  year      = {2021},
  abstract  = {Monoklonale Antik{\"o}rper sind essenzielle Werkzeuge in der modernen Laboranalytik sowie in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Die Herstellung monoklonaler Antik{\"o}rper ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Herk{\"o}mmliche Methoden beruhen auf der Immunisierung von Labortieren, die mitunter mehrere Monate in Anspruch nimmt. Anschließend werden die Antik{\"o}rper-produzierenden B-Lymphozyten bzw. deren Antik{\"o}rpergene isoliert und in Screening-Verfahren untersucht, um geeignete Binder zu identifizieren. Der Transfer der humoralen Immunantwort in eine in vitro Umgebung erlaubt eine Verk{\"u}rzung des Prozesses und umgeht die Notwendigkeit der in vivo Immunisierung. Das komplexe Zusammenspiel aller involvierten Immunzellen in vitro abzubilden, stellt sich allerdings als schwierig dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Realisierung einer vereinfachten In vitro Immunisierung, die sich auf die Protagonisten der Antik{\"o}rper-Produktion konzentriert: die B-Lymphozyten. Dar{\"u}ber hinaus sollte eine permanente Zelllinie etabliert werden, die zur Antik{\"o}rper-Herstellung eingesetzt werden und die Verwendung von Prim{\"a}rzellen ersetzen w{\"u}rde. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll zur In vitro Immunisierung muriner BLymphozyten etabliert. In Vorversuchen wurden die optimalen Konditionen f{\"u}r die Antigenspezifische Aktivierung gereinigter Milz-B-Lymphozyten aus nicht-immunisierten M{\"a}usen determiniert. Dazu wurde der Einfluss verschiedener Stimuli auf die Produktion unspezifischer und spezifischer Antik{\"o}rper untersucht. Eine Kombination aus dem Modellantigen VP1 (Hamster Polyomavirus H{\"u}llprotein 1), einem Anti-CD40-Antik{\"o}rper, Interleukin 4 (IL 4) und Lipopolysaccharid (LPS) oder IL 7 induzierte nachweislich eine Antigen-spezifische Antik{\"o}rper-Antwort in vitro. Als Indikatoren einer erfolgreichen Aktivierung der B-Lymphozyten infolge der in vitro Stimulation wurden die rapide Proliferation und die Expression charakteristischer Aktivierungsmarker auf der Zelloberfl{\"a}che nachgewiesen. In einer Zeitreihe {\"u}ber zehn Tage wurde am zehnten Tag der In vitro Immunisierung die verh{\"a}ltnism{\"a}ßig h{\"o}chste Konzentration Antigen-spezifischer IgG-Antik{\"o}rper im Kultur{\"u}berstand der stimulierten Zellen nachgewiesen. Als n{\"a}chster Schritt sollte eine permanente Zelllinie hergestellt werden, die statt prim{\"a}rer BLymphozyten f{\"u}r die zuvor etablierte In vitro Immunisierung eingesetzt werden k{\"o}nnte. Zu diesem Zweck wurden retrovirale Vektoren hergestellt, die durch den Transfer verschiedener Onkogene in murine B-Lymphozyten bzw. deren Vorl{\"a}uferzellen das Proliferationsverhalten der Zellen manipulieren sollen. Es wurden Retroviren mit Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassetten mit den Onkogenen cmyc, Bcl2, BclxL und dem Fusionsgen NUP98HOXB4 generiert. Eine Testzelllinie wurde erfolgreich mit den hergestellten Retroviren transduziert und die Funktionalit{\"a}t der hergestellten Viren anhand verschiedener Assays belegt. Die transferierten Gene konnten in der Testzelllinie auf DNAEbene nachgewiesen oder die {\"U}berexpression der entsprechenden Proteine im Western Blot detektiert werden. Es wurden schließlich B-Lymphozyten bzw. unreife Vorl{\"a}uferzellen derselben mit den generierten Retroviren transduziert und mit Knochenmark-{\"a}hnlichen Stromazellen co-kultiviert. Aus keinem der transduzierten Ans{\"a}tze konnte bisher eine Zelllinie oder eine Langzeit-Kultur etabliert werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Effektivit{\"a}t und {\"U}bertragbarkeit des zuvor etablierten Protokolls zur In vitro Immunisierung muriner B-Lymphozyten anhand verschiedener Antigene gezeigt. Es konnten in vitro spezifische IgG-Antworten gegen VP1, Legionella pneumophila und das Protein Mip, von dem ein Peptid in das zur Immunisierung eingesetzte VP1 integriert wurde, induziert werden. Die stimulierten B-Lymphozyten wurden durch Fusion mit Myelomzellen in permanente Antik{\"o}rper-produzierende Zelllinien transformiert. Dabei konnten mehrere Hybridomzelllinien generiert werden, die spezifische IgGAntik{\"o}rper gegen VP1 oder Mip produzieren. Die generierten Antik{\"o}rper konnten sowohl im Western Blot als auch im ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) das entsprechende Antigen spezifisch binden. Die hier etablierte In vitro Immunisierung bietet eine effektive Alternative zu bisherigen Verfahren zur Herstellung spezifischer Antik{\"o}rper. Sie ersetzt die Immunisierung von Versuchstieren und reduziert den Zeitaufwand erheblich. In Kombination mit der Hybridomtechnologie k{\"o}nnen die in vitro immunisierten Zellen, wie hier demonstriert, zur Generation von Hybridomzelllinien und zur Herstellung monoklonaler Antik{\"o}rper genutzt werden. Um die Verwendung von Versuchstieren in dieser Methode durch eine ad{\"a}quate permanente Zelllinie zu ersetzen, muss die genetische Ver{\"a}nderung von B-Lymphozyten und unreifen h{\"a}matopoetischen Zellen optimiert werden. Die Ergebnisse bieten eine Basis f{\"u}r eine universelle, Spezies-unabh{\"a}ngige Methodik zur Antik{\"o}rperherstellung und f{\"u}r die Etablierung einer idealen, tierfreien In vitro Immunisierung.},
  language  = {de}
}