@phdthesis{Schumann2008,
  author    = {Schumann, Silvia},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung von prokaryotischen und eukaryotischen Molybdoflavoenzymen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-43427},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die Xanthin-Dehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches ein (αβ)₂ Heterotetramer mit einer Gr{\"o}ße von 275 kDa bildet. Die drei Kofaktoren (Moco, 2[2Fe2S], FAD) sind auf zwei unterschiedlichen Polypeptidketten gebunden. So sind die beiden spektroskopisch unterscheidbaren Eisen-Schwefel-Zentren und das FAD in der XdhA-Untereinheit und der Moco in der XdhB-Untereinheit gebunden. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum die R. capsulatus XDH ein Dimer bildet und ob ein intramolekularer Elektronentransfer existiert. Daf{\"u}r wurde eine chim{\"a}re XDH-Variante [(α)₂(β₁wt/β₂E730A)] erzeugt, welche eine aktive und eine inaktive XdhB-Untereinheit tr{\"a}gt. Mit Hilfe von Reduktionsspektren sowie mit der Bestimmung der kinetischen Parameter f{\"u}r die Substrate Xanthin und NAD+ konnte gezeigt werden, dass die chim{\"a}re XDH-Variante katalytisch halb so aktiv war, wie der auf gleiche Weise gereinigte XDH-Wildtyp. Dies verdeutlicht, dass die noch aktive Untereinheit der Chim{\"a}ren selbstst{\"a}ndig und unabh{\"a}ngig Substrat binden und hydroxylieren kann und ein intramolekularer Elektronentransfer zwischen den beiden XdhB-Untereinheiten nicht stattfindet. Ein weiteres Ziel war die funktionelle Charakterisierung der Mus musculus AOX1 sowie der humanen AOX1 hinsichtlich ihrer Substratspezifit{\"a}ten und ihrer biophysikalischen Eigenschaften sowie der Charakterisierung der konservierten Aminos{\"a}uren im aktiven Zentrum der mAOX1. Da bislang noch kein heterologes Expressionssystem f{\"u}r ein aktives und stabiles rekombinantes AO-Protein existierte, wurde ein E. coli Expressionssystem mit der gleichzeitigen Expression der entsprechenden Mocosulfurase f{\"u}r mAOX1 und hAOX1 in dieser Arbeit etabliert. Mit Hilfe dieser Koexpression konnte die Aktivit{\"a}t der rekombinanten mAOX1 um 50 \% gesteigert werden, wenn gleich auch der sulfurierte Moco-Anteil nur 20 \% betrug. Um die konservierten Aminos{\"a}uren im aktiven Zentrum hinsichtlich ihrer Funktion der Substratbindung zu charakterisieren, wurden folgende Varianten erzeugt: V806E, M884R, V806/M884R sowie E1265Q. Mit Hilfe von kinetischen Substratuntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die beiden Aminos{\"a}uren Val806 und Met884 f{\"u}r die Erkennung und die Stabilisierung von Aldehyden und N-Heterozyklen essentiell sind. Ein Austausch dieser beiden gegen Glutamat bzw. Arginin (wie bei R. capsulatus XDH) zeigte jedoch keine Xanthin- oder Hypoxanthinumsetzung. F{\"u}r das Glu1265 wurde ebenfalls die Rolle als die Katalyse initiierende Aminos{\"a}ure belegt.},
  language  = {de}
}