@phdthesis{Voss2008,
  author    = {Voß, Martin},
  title     = {Regulation der vakuol{\"a}ren H(+)-ATPase durch reversible Proteinphosphorylierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-19617},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die vakuol{\"a}re Protonen-ATPase, kurz V-ATPase, ist ein multimerer Enzymkomplex, der in fast jeder eukaryotischen Zelle zu finden ist und den aktiven elektrogenen Transport von Protonen {\"u}ber Membranen katalysiert. Die Aktivit{\"a}t der V-ATPase ist essentiell f{\"u}r eine Vielzahl physiologischer Prozesse. Ein grundlegender Mechanismus zur Regulation der V-ATPase-Aktivit{\"a}t ist die reversible Dissoziation des Holoenzyms in den integralen VO-Komplex, der als Protonenkanal dient, und den cytosolischen V1-Komplex, der ATP hydrolysiert und somit den Protonentransport energetisiert. Die Untereinheit C, die im dissoziierten Zustand der V-ATPase als einzige Untereinheit isoliert im Cytoplasma vorliegt, scheint bei der Bildung des aktiven Holoenzyms eine Schl{\"u}sselrolle zu {\"u}bernehmen. In den Speicheldr{\"u}sen der Schmeißfliege Calliphora vicina ist die V-ATPase an der Speichelsekretion beteiligt. In den sekretorischen Zellen wird die Bildung des V-ATPase-Holoenzyms in der apikalen Plasmamembran durch das Neurohormon Serotonin (5-HT) stimuliert. Der Effekt von 5-HT auf die V-ATPase wird intrazellul{\"a}r durch die Proteinkinase A (PKA) vermittelt und h{\"a}lt nur f{\"u}r die Dauer der Stimulierung an. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Phosphoproteinf{\"a}rbungen und 2D-Elektrophorese nachgewiesen, dass infolge einer Stimulierung der Dr{\"u}senzellen mit 5-HT die Untereinheit C der V-ATPase durch die PKA reversibel phosphoryliert wird. Die Phosphorylierung geht einher mit einer Umverteilung der Untereinheit C aus dem Cytoplasma zur apikalen Plasmamembran und der Bildung des aktiven Holoenzyms. Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, dass die katalytische Untereinheit der PKA ebenfalls umverteilt wird und in stimulierten Zellen im Bereich der apikalen Plasmamembran konzentriert vorliegt. Um herauszufinden welche Proteinphosphatase der PKA entgegenwirkt, wurden luminale pH-Messungen durchgef{\"u}hrt und der Effekt von spezifischen Proteinphosphatase-Inhibitoren und veresterten Komplexbildnern zweiwertiger Kationen auf die V-ATPase-Aktivit{\"a}t untersucht. Diese Messungen f{\"u}hrten zu der Schlussfolgerung, dass eine Proteinphosphatase des Typs 2C an der Inaktivierung der V-ATPase beteiligt ist. Mit weiteren Phosphoproteinf{\"a}rbungen konnte gezeigt werden, dass die Dephosphorylierung der Untereinheit C ebenfalls durch eine Proteinphosphatase 2C katalysiert wird und dies vermutlich die Dissoziation des VO- und V1-Komplexes beg{\"u}nstigt. Dar{\"u}ber hinaus konnte durch luminale pH-Messungen und erg{\"a}nzende biochemische Untersuchungen eine Calcineurin-vermittelte Modulation des cAMP/PKA-Signalweges durch den parallel aktivierten IP3/Ca2+-Signalweg und damit einhergehend eine Beeinflussung der V-ATPase-Aktivit{\"a}t durch den [Ca2+]-Spiegel nachgewiesen werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schewe2008,
  author    = {Schewe, Bettina},
  title     = {R{\"a}umliche und zeitliche Aspekte der intrazellul{\"a}ren pH-Regulation in Epithelien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-26879},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die Speicheldr{\"u}sen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Prim{\"a}rspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuol{\"a}re H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldr{\"u}sen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Dr{\"u}senlumen transportiert. Trotz des ausw{\"a}rts gerichteten Protonentransportes f{\"u}hrt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellul{\"a}ren Ans{\"a}uerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ans{\"a}uerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellul{\"a}ren pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldr{\"u}sen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-{\"A}nderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: • Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Dr{\"u}se zeigten, dass vor allem die V-ATPase und mindestens ein Na+-abh{\"a}ngiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind. • Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellul{\"a}ren Ans{\"a}uerung (NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens ein Na+-abh{\"a}ngiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der unstimulierten Dr{\"u}se keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi. • Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellul{\"a}ren Alkalisierung (Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abh{\"a}ngig, aber auch unter extremen Bedingungen waren die Zellen noch in der Lage sich vollst{\"a}ndig von einer intrazellull{\"a}ren Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazellul{\"a}re Pufferkapazit{\"a}t. • Ein Na+-abh{\"a}ngiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender Transporter, seine Aktivit{\"a}t hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der unstimulierten Speicheldr{\"u}se von Calliphora vicina. • 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldr{\"u}sen eine intrazellul{\"a}re Ans{\"a}uerung. An dieser Ans{\"a}uerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend beteiligt. Auch eine klare Cl--Abh{\"a}ngigkeit der 5-HT-induzierten Ans{\"a}uerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivit{\"a}t von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter. • Messungen mit einem O2-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldr{\"u}sen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-{\"A}nderungen bei. • Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abh{\"a}ngigen Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldr{\"u}sen direkt nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis f{\"u}r die Expression eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldr{\"u}sen von Calliphora vicina erbracht werden. Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verst{\"a}ndnis der pHi-Regulation in der unstimulierten und stimulierten Speicheldr{\"u}se von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellul{\"a}ren Ans{\"a}uerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazellul{\"a}re Ans{\"a}uerung verursachen, konnten ebenfalls aufgekl{\"a}rt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldr{\"u}sen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert.},
  language  = {de}
}