@phdthesis{Goethel2023,
  author    = {G{\"o}thel, Markus},
  title     = {Entwicklung eines Verfahrens zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antik{\"o}rpern gegen Mikroorganismen basierend auf in silico Epitopanalysen},
  doi       = {10.25932/publishup-58801},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-588017},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XVI, 113},
  year      = {2023},
  abstract  = {Monoklonale Antik{\"o}rper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomolek{\"u}le f{\"u}r die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. F{\"u}r die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage f{\"u}r ein schnelles und pr{\"a}zises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen. Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren f{\"u}r die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberfl{\"a}chenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virush{\"u}llprotein VP1 integriert und f{\"u}r eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. F{\"u}r die Bestimmung antigenspezifischer antik{\"o}rperproduzierender Hybridome wurde ein Immunf{\"a}rbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren. In der vorliegenden Studie konnten f{\"u}r E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und f{\"u}r L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. F{\"u}nf verschiedene potenzielle Epitope wurden f{\"u}r E. coli O157:H7 und drei verschiedenen f{\"u}r L. pneumophila ausgew{\"a}hlt und f{\"u}r die Immunisierung mit chim{\"a}ren VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antik{\"o}rperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivit{\"a}ten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden. Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplin{\"a}re Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf f{\"u}r die Herstellung von Antik{\"o}rpern gegen Mikroorganismen einsetzbar.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Froemmel2013,
  author    = {Fr{\"o}mmel, Ulrike},
  title     = {Vergleichende geno- und ph{\"a}notypische Charakterisierung von Escherichia coli aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-69147},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2013},
  abstract  = {Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von S{\"a}ugern, jedoch zudem der h{\"a}ufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. H{\"a}ufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies f{\"u}hrte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterst{\"u}tzen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen {\"u}ber den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adh{\"a}sion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchf{\"u}hrung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. F{\"u}r die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. F{\"u}r die ph{\"a}notypische Charakterisierung wurden Adh{\"a}sions- und Zytotoxizit{\"a}tsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wilds{\"a}ugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adh{\"a}sionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adh{\"a}sionsraten als auch die Adh{\"a}sionsmuster der 317 nicht h{\"a}molytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizit{\"a}t der 81 h{\"a}molytischen Isolate wurde in Abh{\"a}ngigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien gepr{\"u}ft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Pr{\"a}valenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die gr{\"o}ßte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adh{\"a}sionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adh{\"a}rierten. Ein Drittel der Isolate adh{\"a}rierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adh{\"a}rierten stark an allen Zelllinien. Grunds{\"a}tzlich adh{\"a}rierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichh{\"o}rnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adh{\"a}rieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adh{\"a}sionsmuster diffuse Adh{\"a}sion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adh{\"a}sionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer h{\"o}heren Adh{\"a}sionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizit{\"a}tsassays zeigten eine sehr starke und zeitabh{\"a}ngige Zerst{\"o}rung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-H{\"a}molysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizit{\"a}t h{\"a}molytischer Isolate aus Wildtieren gegen{\"u}ber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es m{\"o}glich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein {\"U}berblick {\"u}ber die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adh{\"a}sionsf{\"a}higkeit und ausgepr{\"a}gter Zytotoxizit{\"a}t als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adh{\"a}sion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der m{\"o}gliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung best{\"a}tigt werden. In weiterf{\"u}hrenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerl{\"a}sslich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adh{\"a}sionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-H{\"a}molysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adh{\"a}sionsunterst{\"u}tzender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragw{\"u}rdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten erm{\"o}glichen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Urban2008,
  author    = {Urban, Alexander},
  title     = {Charakterisierung der Funktion der Rhodanese YnjE f{\"u}r die Molybd{\"a}nkofaktor Biosynthese in Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-29018},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die ubiquit{\"a}r verbreitete Molybd{\"a}nkofaktorbiosynthese ist in Escherichia coli (E. coli) bisher am umfassendsten untersucht. Bislang war jedoch nicht bekannt, welche physiologische Schwefelquelle im zweiten Schritt dieses Syntheseweges zur Bildung der charakteristischen Dithiolengruppe genutzt wird. Erste Untersuchungen deuteten auf eine der Cysteindesulfurasen E. colis hin, welche in Verbindung mit einem rhodanese{\"a}hnlichen Protein den Schwefel in Form eines Persulfids {\"u}bertragen. {\"A}hnliche Mechanismen wurden bereits in der humanen Moco-Biosynthese und der Thiaminbiosynthese identifiziert. In dieser Arbeit wurde das E. coli Protein YnjE n{\"a}her charakterisiert. Es handelt sich bei YnjE um ein rhodanese{\"a}hnliches Protein aus drei Rhodanesedom{\"a}nen. Durch Proteinkristallisation und anschliessender R{\"o}ntgenstrukturanalyse wurde die Terti{\"a}rstruktur des YnjE-Proteins analysiert. Die hergestellten Kristalle konnten zur Gewinnung von Strukturdaten vermessen und eine Proteinkristallstruktur f{\"u}r YnjE berechnet werden. Desweiteren besitzt YnjE ein N-terminales Typ I Sekretionssystem abh{\"a}ngiges Sipnalpeptid. Durch Lokalisieungsexperimente wurde die Bedeutung des Signalpeptids f{\"u}r das YnjE-Protein untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass endogenes YnjE sowohl im peri- als auch im cytoplasmatischen Raum lokalisiert ist. Auf Grund von vorhergehenden Studien, wurde eine Funktion des YnjE-Proteins innerhalb der Molybd{\"a}nkofaktorbiosynthese in der Schwefel{\"u}bertragung auf das Protein MoaD in E. coli vermutet und deshalb in dieser Arbeit n{\"a}her untersucht. Es wurde eine Interaktion des YnjE-Proteins mit dem MoeB-Protein, welches f{\"u}r die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins essentiell ist, durch Tandem-Affinit{\"a}tsreinigung und Antik{\"o}rper-basierte Affinit{\"a}tsreinigung nachgewiesen und ein signifikanter positiver Einfluss YnjEs auf die Bildung von Molybdopterin, einer Vorstufe des Molybd{\"a}nkofaktors, best{\"a}tigt. Dabei wurde sowohl der Sulfurierungsgrad des MoaD-Proteins in YnjE und Cysteindesulfurase-knock-out Mutanten untersucht, als auch die Bildung von Molybdopterin in einem in vitro Ansatz in Abh{\"a}ngigkeit von steigenden YnjE-Konzentrationen analysiert. Im Ergebnis kann man daraus schließen, dass der Mechanismus der Schwefel{\"u}bertragung {\"a}hnlich der Thiaminbiosynthese, {\"u}ber eine der drei Cysteindesulfurasen CsdA, SufS oder IscS geschieht, welche Schwefel in Form eines Persulfids auf YnjE {\"u}bertragen k{\"o}nnen. Thiosulfat und Mercaptopyruvat, die Substrate f{\"u}r die beiden Familien der rhodanese{\"a}hnlichen Proteine, Thiosulfat-Sulfurtransferasen und Mercaptopyruvat-Sulfurtransferasen, dienen nicht als Substrate f{\"u}r eine Persulfurierung YnjEs. Durch eine Austauschmutante des Cysteinrestes der aktiven Schleife von YnjE konnte nicht best{\"a}tigt werden, dass dieser Aminos{\"a}urerest und damit die Bildung eines YnjE-gebundenen Persulfids f{\"u}r die positive Beeinflussung der MPT-Synthese essentiell ist. Vielmehr kann durch diese Arbeit von einer Vermittlung der Interaktionen zwischen MoeB, IscS und der MPT-Synthase durch YnjE ausgegangen werden wobei die Cysteindesulfurase IscS den Schwefel f{\"u}r die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins liefert.},
  language  = {de}
}