@phdthesis{Fischbach2017,
  author    = {Fischbach, Jens},
  title     = {Isothermale Amplifikationsmethoden f{\"u}r den DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Pathogennachweis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {viii, 125},
  year      = {2017},
  abstract  = {Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleins{\"a}ure-basierte Methoden f{\"u}r den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchf{\"u}hrbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleins{\"a}ure-basierten Diagnostik kann durch die Einf{\"u}hrung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kosteng{\"u}nstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielf{\"a}ltige Detektionsm{\"o}glichkeiten, die sowohl f{\"u}r Schnelltest- als auch f{\"u}r Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode f{\"u}r den einfachen, schnellen und g{\"u}nstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abh{\"a}ngiger Detektionsverfahren. Hier wurden zun{\"a}chst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abh{\"a}ngige Fluoreszenzfarbstoffe f{\"u}r die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden k{\"o}nnen. Als Alternative f{\"u}r die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe f{\"u}r den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus f{\"u}r die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: F{\"u}r den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivit{\"a}t zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegen{\"u}ber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zus{\"a}tzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen f{\"u}r die Endpunktdetektion verwendet werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das f{\"u}r den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch f{\"u}r die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zus{\"a}tzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abh{\"a}ngige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP {\"u}ber das Pyrophosphat identifiziert werden. Daf{\"u}r wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilit{\"a}t und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden k{\"o}nnen. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit zwischen den einzelnen Komponenten f{\"u}r einen fluorimetrischen Verdr{\"a}ngungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verh{\"a}ltnis' als Intensit{\"a}tsmatrix (heatmap) konnten zun{\"a}chst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als g{\"u}nstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abh{\"a}ngige Zunahme der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich f{\"u}r die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilit{\"a}t und Homogenit{\"a}t der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tr{\"o}pfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S m{\"o}glich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gew{\"a}hrleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die R{\"u}ckfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivit{\"a}t am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur m{\"o}glich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification" (HIP) konnte abschließend durch die Verk{\"u}rzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-{\"a}hnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsf{\"a}higen Alternative f{\"u}r die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsf{\"a}higkeit der qualitativen und quantitativen LAMP f{\"u}r die Feldanwendungen und f{\"u}r die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden k{\"o}nnen und so eine einfache Pathogendiagnostik erm{\"o}glichen. Die gezeigten Methoden k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegen{\"u}ber den herk{\"o}mmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP f{\"u}r den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei k{\"o}nnen die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngigen Reaktionen erm{\"o}glicht dar{\"u}ber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zuk{\"u}nftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik m{\"o}glich.},
  language  = {de}
}