@phdthesis{Werner2002,
  author    = {Werner, Deljana},
  title     = {Versuche zur Gewinnung von katalytischen Antik{\"o}rpern zur Hydrolyse von Arylcarbamaten und Arylharnstoffen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000463},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2002},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antik{\"o}rper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antik{\"o}rper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antik{\"o}rper wurden Inzuchtm{\"a}use mit KLH-Konjugaten von 4 {\"U}bergangszustandsanaloga ({\"U}ZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antik{\"o}rper gegen diese {\"U}ZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausst{\"a}mme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antik{\"o}rper gegen die verwendeten {\"U}ZA selektiert. Diese Antik{\"o}rper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antik{\"o}rper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antik{\"o}rpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivit{\"a}t gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antik{\"o}rper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivit{\"a}t dieser Antik{\"o}rper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antik{\"o}rper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 \&\#181;M, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antik{\"o}rpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das {\"U}ZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivit{\"a}t. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antik{\"o}rperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abh{\"a}ngigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinit{\"a}t zum {\"U}ZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antik{\"o}rper, die gegen das {\"U}bergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate {\"u}ber einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen {\"U}bergangszustandes verl{\"a}uft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantik{\"o}rpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antik{\"o}rper hergestellt. Einer der Antik{\"o}rper (B91-CG5) ist spezifisch f{\"u}r das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 \&\#181;g/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 \&\#181;g/l. Ein anderer Antik{\"o}rper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette {\"a}hnlicher Herbizide. Mit diesen Antik{\"o}rpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes f{\"u}r Pflanzenschutzmittel von 0,1 \&\#181;g/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antik{\"o}rper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antik{\"o}rper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung f{\"u}hrt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so f{\"u}hrte die Zugabe der Anti-Diuron-Antik{\"o}rper zur Reaktivierung der Elektronen{\"u}bertragung.},
  language  = {de}
}