@phdthesis{Schwonbeck2004,
  author    = {Schwonbeck, Susanne},
  title     = {Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberfl{\"a}chen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001853},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2004},
  abstract  = {Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. F{\"u}r die Analyse wurde ein faseroptischer Affinit{\"a}tssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die Versuche am faseroptischen Affinit{\"a}tssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied l{\"a}sst sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfl{\"a}che sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell f{\"u}r die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter f{\"u}r ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenit{\"a}t als auch im Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis wurden an NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen erreicht. F{\"u}r die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenl{\"a}nge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glastr{\"a}ger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96\%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen best{\"a}tigt werden. Ursache f{\"u}r die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem f{\"u}r die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverl{\"a}ssig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA m{\"o}glich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht ver{\"o}ffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kosteng{\"u}nstigere und weniger hoch dimensionierte L{\"o}sung f{\"u}r Fragestellungen beispielsweise in der Ern{\"a}hrungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zuk{\"u}nftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.},
  language  = {de}
}