@phdthesis{Garz2013,
  author    = {Garz, Andreas},
  title     = {Nichtlineare Mikroskopie und Bilddatenverarbeitung zur biochemischen Analyse synchronisierter Chlamydomonas-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-66904},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2013},
  abstract  = {Unter geeigneten Wachstumsbedingungen weisen Algenkulturen oft eine gr{\"o}ßere Produktivit{\"a}t der Zellen auf, als sie bei h{\"o}heren Pflanzen zu beobachten ist. Chlamydomonas reinhardtii-Zellen sind vergleichsweise klein. So betr{\"a}gt das Zellvolumen w{\"a}hrend des vegetativen Zellzyklus etwa 50-3500 µm³. Im Vergleich zu h{\"o}heren Pflanzen ist in einer Algensuspension die Konzentration der Biomasse allerdings gering. So enth{\"a}lt beispielsweise 1 ml einer {\"u}blichen Konzentration zwischen 10E6 und 10E7 Algenzellen. Quantifizierungen von Metaboliten oder Makromolek{\"u}len, die zur Modellierung von zellul{\"a}ren Prozessen genutzt werden, werden meist im Zellensemble vorgenommen. Tats{\"a}chlich unterliegt jedoch jede Algenzelle einer individuellen Entwicklung, die die Identifizierung charakteristischer allgemeing{\"u}ltiger Systemparameter erschwert. Ziel dieser Arbeit war es, biochemisch relevante Messgr{\"o}ßen in-vivo und in-vitro mit Hilfe optischer Verfahren zu identifizieren und zu quantifizieren. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Puls-Amplituden-Modulation(PAM)-Fluorimetriemessplatz zur Messung der durch {\"a}ußere Einfl{\"u}sse bedingten ver{\"a}nderlichen Chlorophyllfluoreszenz an einzelnen Zellen vorgestellt. Die Verwendung eines kommerziellen Mikroskops, die Implementierung empfindlicher Nachweiselektronik und einer geeignete Immobilisierungsmethode erm{\"o}glichten es, ein Signal-zu-Rauschverh{\"a}ltnis zu erreichen, mit dem Fluoreszenzsignale einzelner lebender Chlamydomonas-Zellen gemessen werden konnten. Insbesondere wurden das Zellvolumen und der als Maß f{\"u}r die Effizienz des Photosyntheseapparats bzw. die Zellfitness geltende Chlorophyllfluoreszenzparameter Fv/Fm ermittelt und ein hohes Maß an Heterogenit{\"a}t dieser zellul{\"a}ren Parameter in verschiedenen Entwicklungsstadien der synchronisierten Chlamydomonas-Zellen festgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die bildgebende Laser-Scanning-Mikroskopie und anschließende Bilddatenanalyse zur quantitativen Erfassung der wachstumsabh{\"a}ngigen zellul{\"a}ren Parameter angewandt. Ein kommerzielles konfokales Mikroskop wurde um die M{\"o}glichkeit der nichtlinearen Mikroskopie erweitert. Diese hat den Vorteil einer lokalisierten Anregung, damit verbunden einer h{\"o}heren Ortsaufl{\"o}sung und insgesamt geringeren Probenbelastung. Weiterhin besteht neben der Signalgewinnung durch Fluoreszenzanregung die M{\"o}glichkeit der Erzeugung der Zweiten Harmonischen (SHG) an biophotonischen Strukturen, wie der zellul{\"a}ren St{\"a}rke. Anhand der Verteilungsfunktionen war es m{\"o}glich mit Hilfe von modelltheoretischen Ans{\"a}tzen zellul{\"a}re Parameter zu ermitteln, die messtechnisch nicht unmittelbar zug{\"a}nglich sind. Die morphologischen Informationen der Bilddaten erm{\"o}glichten die Bestimmung der Zellvolumina und die Volumina subzellularer Strukturen, wie Nuclei, extranucle{\"a}re DNA oder St{\"a}rkegranula. Weiterhin konnte die Anzahl subzellul{\"a}rer Strukturen innerhalb einer Zelle bzw. eines Zellverbunds ermittelt werden. Die Analyse der in den Bilddaten enthaltenen Signalintensit{\"a}ten war Grundlage einer relativen Konzentrationsbestimmung von zellul{\"a}ren Komponenten, wie DNA bzw. St{\"a}rke. Mit dem hier vorgestellten Verfahren der nichtlinearen Mikroskopie und nachfolgender Bilddatenanalyse konnte erstmalig die Verteilung des zellul{\"a}ren St{\"a}rkegehalts in einer Chlamydomonas-Population w{\"a}hrend des Wachstums bzw. nach induziertem St{\"a}rkeabbau verfolgt werden. Im weiteren Verlauf wurde diese Methode auch auf Gefrierschnitte h{\"o}herer Pflanzen, wie Arabidopsis thaliana, angewendet. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass viele zellul{\"a}re Parameter, wie das Volumen, der zellul{\"a}re DNA- und St{\"a}rkegehalt bzw. die Anzahl der St{\"a}rkegranula durch eine Lognormalverteilung, mit wachstumsabh{\"a}ngiger Parametrisierung, beschrieben werden. Zellul{\"a}re Parameter, wie Stoffkonzentration und zellul{\"a}res Volumen, zeigen keine signifikanten Korrelationen zueinander, woraus geschlussfolgert werden muss, dass es ein hohes Maß an Heterogenit{\"a}t der zellul{\"a}ren Parameter innerhalb der synchronisierten Chlamydomonas-Populationen gibt. Diese Aussage gilt sowohl f{\"u}r die als homogenste Form geltenden Synchronkulturen von Chlamydomonas reinhardtii als auch f{\"u}r die gemessenen zellul{\"a}ren Parameter im intakten Zellverbund h{\"o}herer Pflanzen. Dieses Ergebnis ist insbesondere f{\"u}r modelltheoretische Betrachtungen von Relevanz, die sich auf empirische Daten bzw. zellul{\"a}re Parameter st{\"u}tzen welche im Zellensemble gemessen wurden und somit nicht notwendigerweise den zellul{\"a}ren Status einer einzelnen Zelle repr{\"a}sentieren.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Brandt2001,
  author    = {Brandt, Stephan Peter},
  title     = {Zelltyp-spezifische Mikroanalyse von Arabidopsis thaliana-Bl{\"a}ttern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000410},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2001},
  abstract  = {Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuf{\"u}hren, um spezifische Transkripte nachweisen zu k{\"o}nnen. Dies gelang f{\"u}r eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. F{\"u}r die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zun{\"a}chst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge f{\"u}r Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch f{\"u}r die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode f{\"u}r die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zur{\"u}ckgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. {\"U}ber UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der f{\"u}r andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zw{\"o}lf freie Aminos{\"a}uren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die {\"U}bertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivit{\"a}t selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben erm{\"o}glicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und {\"u}ber Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Prim{\"a}rsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden. Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl r{\"a}umlich als auch zeitlich aufzul{\"o}sen. Dies wird zu einem detaillierteren Verst{\"a}ndnis mannigfaltiger Vorg{\"a}nge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen f{\"u}hren.},
  language  = {de}
}