@phdthesis{KoikkarahAji2023,
  author    = {Koikkarah Aji, Amit},
  title     = {Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins},
  doi       = {10.25932/publishup-58661},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {101},
  year      = {2023},
  abstract  = {Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 \% mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \\& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Luschtinetz2010,
  author    = {Luschtinetz, Franziska},
  title     = {Cyaninfarbstoffe als Fluoreszenzsonden in biomimetischen und biologischen Systemen : Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie und Fluoreszenzanisotropie-Untersuchungen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-48478},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2010},
  abstract  = {Um Prozesse in biologischen Systemen auf molekularer Ebene zu untersuchen, haben sich vor allem fluoreszenzspektroskopische Methoden bew{\"a}hrt. Die M{\"o}glichkeit, einzelne Molek{\"u}le zu beobachten, hat zu einem deutlichen Fortschritt im Verst{\"a}ndnis von elementaren biochemischen Prozessen gef{\"u}hrt. Zu einer der bekanntesten Methoden der Einzelmolek{\"u}lspektroskopie z{\"a}hlt die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), mit deren Hilfe intramolekulare und diffusionsgesteuerte Prozesse in einem Zeitbereich von µs bis ms untersucht werden k{\"o}nnen. Durch die Verwendung von sog. Fluoreszenzsonden k{\"o}nnen Informationen {\"u}ber deren molekulare Mikroumgebung erhalten werden. Insbesondere f{\"u}r die konfokale Mikroskopie und die Einzelmolek{\"u}lspektroskopie werden Fluoreszenzfarbstoffe mit einer hohen Photostabilit{\"a}t und hohen Fluoreszenzquantenausbeute ben{\"o}tigt. Aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzquantenausbeute und der M{\"o}glichkeit, maßgeschneiderte" Farbstoffe in einem breiten Spektralbereich f{\"u}r die Absorption und Fluoreszenz zu entwickeln, sind Cyaninfarbstoffe von besonderem Interesse f{\"u}r bioanalytische Anwendungen. Als Fluoreszenzmarker finden diese Farbstoffe insbesondere in der klinischen Diagnostik und den Lebenswissenschaften Verwendung. Die in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffe DY-635 und DY-647 sind zwei typische Vertreter dieser Farbstoffklasse. Durch Modifizierung k{\"o}nnen die Farbstoffe kovalent an biologisch relevante Molek{\"u}le gebunden werden. Aufgrund ihres Absorptionsmaximums oberhalb von 630nm werden sie insbesondere in der Bioanalytik eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurden die spektroskopischen Eigenschaften der Cyaninfarbstoffe DY-635 und DY-647 in biomimetischen und biologischen Modellsystemen untersucht. Zur Charakterisierung wurden dabei neben der Absorptionsspektroskopie insbesondere fluoreszenzspektroskopische Methoden verwendet. Dazu z{\"a}hlen die zeitkorrelierte Einzelphotonenz{\"a}hlung zur Ermittlung des Fluoreszenzabklingverhaltens, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zur Beobachtung von Diffusions- und photophysikalischen Desaktivierungsprozessen und die zeitaufgel{\"o}ste Fluoreszenzanisotropie zur Untersuchung der Rotationsdynamik und Beweglichkeit der Farbstoffe im jeweiligen Modellsystem. Das Biotin-Streptavidin-System wurde als Modellsystem f{\"u}r die Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen verwendet, da der Bindungsmechanismus weitgehend aufgekl{\"a}rt ist. Nach Bindung der Farbstoffe an Streptavidin wurde eine erhebliche Ver{\"a}nderung in den Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften beobachtet. Es wird angenommen, dass diese spektralen Ver{\"a}nderungen durch Wechselwirkung von benachbarten, an ein Streptavidintetramer gebundenen Farbstoffmolek{\"u}len und Bildung von H-Dimeren verursacht wird. F{\"u}r das System Biotin-Streptavidin ist bekannt, dass w{\"a}hrend der Bindung des Liganden (Biotin) an das Protein eine Konformations{\"a}nderung auftritt. Anhand von zeitaufgel{\"o}sten Fluoreszenzanisotropieuntersuchungen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese strukturellen Ver{\"a}nderungen zu einer starken Einschr{\"a}nkung der Beweglichkeit des Farbstoffes DY-635B f{\"u}hren. Liegt eine Mischung von ungebundenem und Streptavidin-gebundenem Farbstoff vor, k{\"o}nnen die Anisotropieabklingkurven nicht nach einem exponentiellen Verlauf angepasst werden. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass in diesem Fall die Auswertung mit Hilfe des Assoziativen Anisotropiemodells m{\"o}glich ist, welches eine Unterscheidung der Beitr{\"a}ge aus den zwei verschiedenen Mikroumgebungen erm{\"o}glicht. Als zweites Modellsystem dieser Arbeit wurden Mizellen des nichtionischen Tensids Tween-20 eingesetzt. Mizellen bilden eines der einfachsten Systeme, um die Mikroumgebung einer biologischen Membran nachzuahmen. Sind die Farbstoffe in den Mizellen eingelagert, so kommt es zu keiner Ver{\"a}nderung der Mizellgr{\"o}ße. Die ermittelten Werte des Diffusionskoeffizienten der mizellar eingelagerten Farbstoffe spiegeln demzufolge die Translationsbewegung der Tween-20-Mizellen wider. Die Beweglichkeit der Farbstoffe innerhalb der Tween-20-Mizellen wurde durch zeitaufgel{\"o}ste Fluoreszenzanisotropiemessungen untersucht. Neben der „Wackelbewegung", entsprechend dem wobble-in-a-cone-Modell, wird zus{\"a}tzlich noch die laterale Diffusion der Farbstoffe entlang der Mizelloberfl{\"a}che beschrieben.},
  language  = {de}
}
@misc{TzonevaStoyanovaPetrichetal.2020,
  author    = {Tzoneva, Rumiana and Stoyanova, Tihomira and Petrich, Annett and Popova, Desislava and Uzunova, Veselina and Albena, Momchilova and Chiantia, Salvatore},
  title     = {Effect of Erufosine on Membrane Lipid Order in Breast Cancer Cell Models},
  series = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe},
  journal   = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe},
  number    = {1000},
  issn      = {1866-8372},
  doi       = {10.25932/publishup-47705},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-477056},
  pages     = {19},
  year      = {2020},
  abstract  = {Alkylphospholipids are a novel class of antineoplastic drugs showing remarkable therapeutic potential. Among them, erufosine (EPC3) is a promising drug for the treatment of several types of tumors. While EPC3 is supposed to exert its function by interacting with lipid membranes, the exact molecular mechanisms involved are not known yet. In this work, we applied a combination of several fluorescence microscopy and analytical chemistry approaches (i.e., scanning fluorescence correlation spectroscopy, line-scan fluorescence correlation spectroscopy, generalized polarization imaging, as well as thin layer and gas chromatography) to quantify the effect of EPC3 in biophysical models of the plasma membrane, as well as in cancer cell lines. Our results indicate that EPC3 affects lipid-lipid interactions in cellular membranes by decreasing lipid packing and increasing membrane disorder and fluidity. As a consequence of these alterations in the lateral organization of lipid bilayers, the diffusive dynamics of membrane proteins are also significantly increased. Taken together, these findings suggest that the mechanism of action of EPC3 could be linked to its effects on fundamental biophysical properties of lipid membranes, as well as on lipid metabolism in cancer cells.},
  language  = {en}
}