@phdthesis{Hartmann2007,
  author    = {Hartmann, Laura},
  title     = {Synthese monodisperser, multifunktionaler Poly(amidoamine) und ihre Anwendung als nicht-virale Vektoren f{\"u}r die Gentherapie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-13129},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Synthese monodisperser, multifunktionaler Poly(amidoamine) (PAAs). Die Klasse der PAAs ist besonders interessant f{\"u}r eine Anwendung im Bereich der Biomedizin, da sie meist nicht toxisch ist, eine sehr geringe Immunogenizit{\"a}t zeigt und eine erh{\"o}hte Zellmembranpermeabilit{\"a}t besitzt. Allerdings ist der Einsatz linearer PAAs bisher limitiert, da ihre Synthese nur den Zugang von hoch-polydispersen Systemen mit einer streng alternierenden oder statistischen Verteilung von Funktionalit{\"a}ten erlaubt. Es ist daher von großem Interesse diese Polymerklasse durch die M{\"o}glichkeit eines sequenzdefinierten Aufbaus und der Integration von neuen Funktionalit{\"a}ten zu verbessern. Um dies zu erm{\"o}glichen, wurden, vergleichbar mit der etablierten Festphasensynthese von Peptiden, schrittweise funktionale Dis{\"a}ure- und Diamin-Bausteine an ein polymeres Tr{\"a}ger-Harz addiert. Der sequenzielle Aufbau erm{\"o}glicht die Synthese monodisperser PAAs und die Kontrolle {\"u}ber die Monomersequenz. Die Wahl der Monomer-Bausteine und ihrer Funktionalit{\"a}ten kann dabei f{\"u}r jede Addition neu getroffen werden und entscheidet so {\"u}ber die Sequenz der Funktionalit{\"a}ten im Polymerr{\"u}ckgrat. Die verwendete Chemie entspricht dabei der Standardpeptidchemie, so dass mit Hilfe eines Peptidsynthese-Automaten die Synthese vollst{\"a}ndig automatisiert werden konnte. Die Verwendung spezieller Tr{\"a}gerharze, die bereits mit einem synthetischen Polymerblock wie PEO oder auch mit einem Peptid vorbeladen waren, erlaubt die direkte Synthese von PEO- und Peptid-PAA Blockcopolymeren. Da die hier dargestellten PAAs sp{\"a}ter auf ihre Eignung als multivalente Polykationen in der Gentherapie getestet werden sollten, wurden zun{\"a}chst Bausteine gew{\"a}hlt, die den Einbau verschiedener Aminfunktionalit{\"a}ten erm{\"o}glichen. Die Bausteine m{\"u}ssen dabei so gew{\"a}hlt sein, dass sie kompatibel sind mit der Chemie des Peptidsynthesizers und eine quantitative Addition ohne Neben- oder Abbruchreaktionen garantieren. Dar{\"u}ber hinaus ist der Einbau von Peptidsequenzen und Disulfid-Einheiten in die PAA-Kette m{\"o}glich, die z. B. f{\"u}r einen selektiven Abbau des Polymers im Organismus genutzt werden k{\"o}nnen. Zusammenfassend l{\"a}sst sich feststellen, dass die in dieser Arbeit vorgestellten PAA-Systeme großes Potenzial als nicht-virale Vektoren f{\"u}r die Gentransfektion bieten. Sie sind nicht toxisch und zeigen Zellaufnahme-Effizienzen von bis zu 77\%. Die Gentransfereffizienz ist im Vergleich zu etablierten Polymer-Vektoren zwar noch sehr gering, aber die bisherigen Versuche zeigen bereits eine m{\"o}gliche Ursache, n{\"a}mlich die schlechte Freisetzung des Genmaterials innerhalb der Zelle. Eine L{\"o}sung dieses Problems bietet jedoch die weitere Modifizierung der PAA-Systeme durch den Einbau von Sollbruchstellen. Diese Sollbruchstellen erm{\"o}glichen einen programmierten Abbau des Polymers innerhalb der Zelle und damit sollte die Freisetzung des Genmaterials vom Tr{\"a}ger deutlich erleichtert werden. M{\"o}gliche Bruchstellen sind z. B. enzymatisch gezielt spaltbare Peptideinheiten oder Disulfid-Einheiten, wie sie bereits als Bausteine f{\"u}r die PAA-Synthese vorgestellt wurden (vergl. Kapitel 4.4). Da nur innerhalb der Zelle ein reduzierendes elektrochemisches Potential besteht, werden z. B. Disulfid-Einheiten auch nur dort gespalten und bieten außerhalb der Zelle ausreichende Stabilit{\"a}t zum Erhalt der Polyplexstruktur. Neben einer Anwendung in der Gentherapie bieten die hier vorgestellten PAA-Systeme den Vorteil einer systematischen Untersuchung von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen der Polyplexe. Es wurden verschiedene Zusammenh{\"a}nge zwischen der chemischen Struktur der PAA-Segmente und der Art und St{\"a}rke der DNS-Komprimierung aufgezeigt. Die Komprimierungsst{\"a}rke wiederum zeigte deutlichen Einfluss auf die Internalisierungsrate und damit auch Transfektionseffizienz. Dar{\"u}ber hinaus zeigte sich ein drastischer Einfluss des PEO-Blocks auf die Stabilisierung der Polyplexe sowie deren intrazellul{\"a}re Freisetzung bei Zusatz von Chloroquin. Dennoch bleiben aufgrund der Komplexit{\"a}t der Zusammenh{\"a}nge noch viele Mechanismen der Transfektion unverstanden, und es muss Aufgabe folgender Arbeiten sein, das Potential der hier eingef{\"u}hrten monodispersen PAA-Systeme weiter auszuloten. So w{\"a}re z. B. eine Korrelation der Kettenl{\"a}nge mit den Parametern der Polyplexbildung, der Zellaufnahme und Transfektionseffizienz von großem Interesse. Dar{\"u}ber hinaus bietet der Einbau von Sollbruchstellen wie kurzen Peptidsequenzen oder den hier bereits eingef{\"u}hrten Disulfid-Einheiten neue M{\"o}glichkeiten der gezielten Freisetzung und des programmierten Abbaus, die n{\"a}her untersucht werden m{\"u}ssen. Neben der Anwendung im Bereich der Gentransfektion sind außerdem andere Gebiete f{\"u}r den Einsatz von monodispersen multifunktionalen PAAs denkbar, da diese kontrollierbare und einstellbare Wechselwirkungen erm{\"o}glichen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Lehmann2003,
  author    = {Lehmann, Cathleen},
  title     = {Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus und intrazellul{\"a}rem Transport von fusogenen und kationischen Liposomen-DNA-Komplexen f{\"u}r den Gentransfer},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001196},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2003},
  abstract  = {Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Pr{\"a}parationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Gr{\"o}ße und fusogenen Eigenschaften sind abh{\"a}ngig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antik{\"o}rper gegen H{\"a}magglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Gr{\"o}ße kationischer Liposomen werden haupts{\"a}chlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Gr{\"o}ßenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Gr{\"o}ße der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse {\"u}ber diese Vorg{\"a}nge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und m{\"o}glichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zellul{\"a}re Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abh{\"a}ngig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt {\"u}ber endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern {\"u}ber Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernn{\"a}he deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern).},
  language  = {de}
}