@phdthesis{Teller2008,
  author    = {Teller, Carsten},
  title     = {Entwicklung neuartiger biomimetischer Sensoren: ein bifunktionaler Sensor auf Basis haptenisierter Cholinesterase},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-25021},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2008},
  abstract  = {In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines bifunktionellen Biosensors nach dem Vorbild eines Baukastensystems beschrieben. Das Ziel wird durch die Kombination verschiedenster molekularer Erkennungselemente erreicht. Solche molekularen Erkennungselemente im verwendeten System sind: • Propidium und die periphere anionische Bindungsstelle der Acetylcholinesterase (AChE) • Organophosphate und das aktive Zentrum der AChE • ein an die AChE gekoppeltes Hapten und das Epitop eines Antik{\"o}rpers • ein an die AChE gekoppeltes Hapten, das als Ligand ein weiteres Enzym bindet Neben dem molekularen Erkennungselement wird ein Biosensor ebenso durch die Art des Transducers charakterisiert. Hier werden Quarzpl{\"a}ttchen mit Goldelektroden zur Signalumwandlung eingesetzt. Die Verwendung solcher Sensoren mit einem EQCM-Ger{\"a}t (electrochemical quartz crystal microbalance) erm{\"o}glicht es zwei Messsignale gleichzeitig aufzunehmen: die piezoelektrische Bestimmung einer Massebeladung und die amperometrische Detektion von Enzymaktivit{\"a}t auf der Sensoroberfl{\"a}che. F{\"u}r die Analytik stehen somit zwei verschiedene Assay-Varianten zur Verf{\"u}gung: die Bestimmung der Inhibition der ACHE-Aktivit{\"a}t und ein Bindungstest {\"u}ber das Hapten. Die Basis beider Tests ist die Modifizierung der piezoelektrischen Kristalle mit Propidium - einem reversiblen Inhibitor der Acetylcholinesterase. Dies erm{\"o}glicht die Beladung des Sensors mit AChE {\"u}ber die Wechselwirkung mit der peripheren anionischen Bindungsstelle des Enzyms. Die Aktivit{\"a}t der so immobilisierten AChE und die Inhibition durch Organophosphate (Pestizide) werden amperometrisch bestimmt. Durch die chemische Kopplung eines Hapten an die Cholinesterase wird ein weiteres Erkennungselement eingef{\"u}hrt. Das er{\"o}ffnet die M{\"o}glichkeit, an die auf dem Propidium-modifizierten Sensor immobilisierte, haptenisierte Cholinesterase einen Antik{\"o}rper zu binden. Als Voraussetzung f{\"u}r elektrochemische Bestimmung der AChE-Aktivit{\"a}t wurde zun{\"a}chst die Optimierung der amperometrischen Messmethode vorgenommen. Die Oxidatationspotentiale f{\"u}r die Detektion von Thiocholin wurden im Bereich von 150 mV bis 300 mV variiert. Dabei wurde f{\"u}r die nachfolgenden Untersuchungen eine Arbeitspotential von 200 mV (vs. Ag/AgCl) festgelegt, da hier das beste Verh{\"a}ltnis von gemessenem Oxidationsstrom und Langzeitstabilit{\"a}t der Propidium-modifizierten Sensoren erzielt wurde. Dieses Potential war deutlich geringer als die bisher publizierten Mediator-freien AChE-Biosensoren. Es wurde ein Vergleich verschiedener Organophosphate {\"u}ber ihre Inhibitionskonstanten durchgef{\"u}hrt, um diejenigen herauszufinden, die m{\"o}glichst schnell mit dem aktiven Zentrum der Acetylcholinesterase reagieren. Das verwendete Messsystem beruht nicht auf der Vorinkubation der AChE und damit einer Einstellung des Inhibitionsgleichgewichts. Stattdessen wurde die Inhibition der AChE direkt im Fließsystem verfolgt. Daher war eine schnelle Inhibitionskinetik f{\"u}r einen empfindlichen Organophosphat-Nachweis erforderlich. Da einige Inhibitoren nur als Phosphothionat vorlagen, wurde die {\"U}berf{\"u}hrung dieser Substanzen in die entsprechenden Oxo-Formen mittels N-Bromsuccinimid untersucht. Die NBS-Aktivierung wurde erfolgreich durchgef{\"u}hrt, die erwartete Inhibitionsst{\"a}rke konnte jedoch aufgrund hydrolytischer Vorg{\"a}nge nicht erreicht werden. Untersuchungen mit Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Chlorpyriphos-oxon (CPO) konnten die Voruntersuchungen {\"u}ber die Inhibitionskinetik in Bezug auf die erreichten Nachweisgrenzen von 2E-06 M f{\"u}r DFP und 5E-08 M f{\"u}r CPO best{\"a}tigen. F{\"u}r die chemische Modifizierung der Acetylcholinesterase wurde zun{\"a}chst 2,4-Dichlorphenoxyessigs{\"a}ure (2,4-D) als Hapten ausgew{\"a}hlt. 2,4-D wird als Herbizid eingesetzt und in der EU {\"u}ber die Gew{\"a}sserschutzrichtlinie reguliert. 2,4-D konnte in unterschiedlichen molaren Verh{\"a}ltnissen von 2,6 : 1 bis 260 : 1 (2,4-D : AChE) nach Aktivierung mit einem Norbornendicarboximido-Derivat an die AChE gekoppelt werden. Dabei konnte die spezifische Aktivit{\"a}t der Acetylcholinesterase erhalten und die Bindung eines anti-2,4-D-Antik{\"o}rpers erm{\"o}glicht werden. Zur Verst{\"a}rkung des piezolelektrischen Signals der Antik{\"o}rperbindung wurden die Immunoglobuline zun{\"a}chst an Goldnanopartikel gekoppelt. Damit konnte eine Verst{\"a}rkung um den Faktor 10 erreicht werden. Allerdings waren die Antik{\"o}rper-modifizierten Goldnanopartikel nicht langzeitstabil. Daher wurden auch Silica-Nanopartikel als Matrix f{\"u}r die Antik{\"o}rperkopplung getestet. Mit diesem System konnte eine Verst{\"a}rkung um den Faktor von 5 bis 13 je nach Grad der Beladung den Nanopartikel mit Antik{\"o}rper bestimmt werden. Die hohe unspezifische Bindung der Antik{\"o}rper-Nanopartikel-Konjugate an den Propidium-modifizierten QCM-Sensor konnte keinen empfindlichen 2,4-D-Nachweis erm{\"o}glichen. Als Alternative wurde Kokain (Benzoylecgonin, BZE) als Hapten an die Aceytlcholinesterase gekoppelt. Da Kokain selbst auch als Inhibitor im aktiven Zentrum der AChE binden kann, wurden zwei verschiedene Strategien zur Konjugatsynthese verfolgt. Durch Zugabe von Kokain w{\"a}hrend der Kopplung sollte die kovalente Fixierung des Kokain-Derivats BZE-DADOO im aktiven Zentrum verhindert werden (Konjugat B). In der Tat konnten mit dieser Synthesestrategie 67\% der spezifischen Cholinesterase-Aktivit{\"a}t erhalten werden, w{\"a}hrend im Kokain-freien Ansatz (Konjugat A) nur 2\% der Ausgangsaktivit{\"a}t wiedergefunden wurden. Das BZE-AChE-Konjugat erm{\"o}glichte auch die Untersuchung der Bindungskinetik der anti-BZE-Antik{\"o}rper. Dabei konnte eine Assoziationsgeschwindigkeitskonstante ka von 12911 l/(mol•s) berechnet werden. Dieser Wert ist trotz der vergleichsweise geringen Oberfl{\"a}chenbeladung vergleichbar mit den in der Literatur angegebenen Werten. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante ist mit 2,89E-3 1/s um den Faktor 30 h{\"o}her als der Literaturwert. Diese Abweichung ist auf Unterschiede im Bindungsmodell zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Mit beiden BZE-AChE-Konjugaten konnte ein kompetetiver Immunoassay mit Kokain im Fließsystem durchgef{\"u}hrt werden. Dabei zeigte sich f{\"u}r beide Konjugate ein {\"a}hnlicher Testmittelpunkt: IC50 = 4,40E-8 mol/l f{\"u}r Konjugat A bzw. IC50 = 1,77E-8 mol/l f{\"u}r Konjugat B. Diese Werte sind vergleichbar zu bereits publizierten Kokainassays im Fließsystem. Wie vorstehend beschrieben, bindet Kokain als Inhibitor auch im aktiven Zentrum von Cholinesterasen. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um ein zweites Enzym - Butyrylcholinesterase (BChE) - an die BZE-AChE zu binden. Die Spezifit{\"a}t dieser Bindung konnte durch die Abwesenheit einer Affinit{\"a}t der BChE zum Propidium und durch die Blockierbarkeit der Bindung von BChE und BZE-AChE durch Kokain nachgewiesen werden. Damit konnte erfolgreich die Kombination mehrere molekularer Erkennungselemente demonstriert werden. Die Propidium-Plattform erm{\"o}glicht den Aufbau einer Architektur aus verschiedenen Cholinesterasen, die {\"u}ber unterschiedliche Bindungsstellen wechselwirken. Sowohl freie als auch BZE-modifizierte AChE k{\"o}nnen {\"u}ber die Affinit{\"a}t zum Propidium auf dem EQCM-Sensor immobilisiert werden. Mit Kokain als Substrat der Butyrylcholinesterase kann Benzoylecgonin nicht nur als Epitop f{\"u}r die Bindung eines Antik{\"o}rpers, sondern auch als Erkennungselement f{\"u}r die BChE genutzt werden. Auf der anderen Seite erschwert die geringe Affinit{\"a}t der BChE im Gegensatz zum anti-BZE-Antik{\"o}rper den Einsatz dieses Systems f{\"u}r analytische Zwecke. Durch die Verwendung anderer Ligand-Enzym-Kombinationen l{\"a}ßt sich das in dieser Arbeit vorgestellte Konzept noch weiter ausbauen und erm{\"o}glicht damit eine Entwicklung ausgehend von „einfachen" molekularen Erkennungselementen (MRE) hin zu „multifunktionellen" Erkennungselementsystemen. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass der Aufbau solch komplexe Systeme m{\"o}glich ist, ohne Abstriche in Bezug auf die Empfindlichkeit der einzelnen Assays hinzunehmen.},
  language  = {de}
}