@phdthesis{Eisold2017,
  author    = {Eisold, Ursula},
  title     = {Cumarin- und DBD-Farbstoffe als Fluoreszenzsonden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-405833},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {109},
  year      = {2017},
  abstract  = {In dieser Arbeit werden drei Themen im Zusammenhang mit den spektroskopischen Eigenschaften von Cumarin- (Cou) und DBD-Farbstoffen ([1,3]Dioxolo[4,5-f][1,3]benzodioxol) behandelt. Der erste Teil zeigt die grundlegende spektroskopische Charakterisierung von 7-Aminocumarinen und ihre potentielle Anwendung als Fluoreszenzsonde f{\"u}r Fluoreszenzimmunassays. Im zweiten Teil werden mit die photophysikalischen Eigenschaften der Cumarine genutzt um Cou- und DBD-funktionalisierte Oligo-Spiro-Ketal-St{\"a}be (OSTK) und ihre Eigenschaften als Membransonden zu untersuchen. Der letzte Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Synthese und der Charakterisierung von Cou- und DBD-funktionalisierten Polyprolinen als Referenzsysteme f{\"u}r schwefelfunktionalisierte OSTK-St{\"a}be und ihrer Kopplung an Goldnanopartikel. Immunochemische Analysemethoden sind in der klinischen Diagnostik sehr erfolgreich und werden heute auch f{\"u}r die Nahrungsmittelkontrolle und {\"U}berwachung von Umweltfragen mit einbezogen. Dadurch sind sie von großem Interesse f{\"u}r weitere Forschungen. Unter den verschiedenen Immunassays zeichnen sich lumineszenzbasierte Formate durch ihre herausragende Sensitivit{\"a}t aus, die dieses Format f{\"u}r zuk{\"u}nftige Anwendungen besonders attraktiv macht. Die Notwendigkeit von Multiparameterdetektionsm{\"o}glichkeiten erfordert einen Werkzeugkasten mit Farbstoffen, um die biochemische Reaktion in ein optisch detektierbares Signal umzuwandeln. Hier wird bei einem Multiparameteransatz jeder Analyt durch einen anderen Farbstoff mit einer einzigartigen Emissionsfarbe, die den blauen bis roten Spektralbereich abdecken, oder eine einzigartige Abklingzeit detektiert. Im Falle eines kompetitiven Immunassayformats w{\"a}re f{\"u}r jeden der verschiedenen Farbstoffe ein einzelner Antik{\"o}rper erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wird ein leicht modifizierter Ansatz unter Verwendung einer Cumarineinheit, gegen die hochspezifische monoklonale Antik{\"o}rper (mAb) erzeugt wurden, als grundlegendes Antigen pr{\"a}sentiert. Durch eine Modifikation der Stammcumarineinheit an einer Position des Molek{\"u}ls, die f{\"u}r die Erkennung durch den Antik{\"o}rper nicht relevant ist, kann auf den vollen Spektralbereich von blau bis tiefrot zugegriffen werden. In dieser Arbeit wird die photophysikalische Charakterisierung der verschiedenen Cumarinderivate und ihrer entsprechenden Immunkomplexe mit zwei verschiedenen, aber dennoch hochspezifischen, Antik{\"o}rpern pr{\"a}sentiert. Die Cumarinfarbstoffe und ihre Immunkomplexe wurden durch station{\"a}re und zeitaufgel{\"o}ste Absorptions- sowie Fluoreszenzemissionsspektroskopie charakterisiert. Dar{\"u}ber hinaus wurden Fluoreszenzdepolarisationsmessungen durchgef{\"u}hrt, um die Daten zu vervollst{\"a}ndigen, die die verschiedenen Bindungsmodi der beiden Antik{\"o}rper betonten. Im Gegensatz zu h{\"a}ufig eingesetzten Nachweissystemen wurde eine massive Fluoreszenzverst{\"a}rkung bei der Bildung des Antik{\"o}rper-Farbstoffkomplexes bis zu einem Faktor von 50 gefunden. Wegen der leichten Emissionsfarben{\"a}nderung durch das Anpassen der Cumarinsubstitution in der f{\"u}r die Antigenbindung nicht relevanten Position des Elternmolek{\"u}ls, ist eine Farbstoff-Toolbox vorhanden, die bei der Konstruktion von kompetitiven Multiparameterfluoreszenzverst{\"a}rkungsimmunassays verwendet werden kann. Oligo-Spiro-Thio-Ketal-St{\"a}be werden aufgrund ihres hydrophoben R{\"u}ckgrats leicht in Doppellipidschichten eingebaut und deshalb als optische Membransonde verwendet. Wegen ihres geringen Durchmessers wird nur eine minimale St{\"o}rung der Doppellipidschicht verursacht. Durch die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen sind neuartige F{\"o}rster-Resonanz-Energietransfersonden mit hoch definierten relativen Orientierungen der {\"U}bergangsdipolmomente der Donor- und Akzeptorfarbstoffe zug{\"a}nglich und macht die Klasse der OSTK-Sonden zu einem leistungsstarken, flexiblen Werkzeugkasten f{\"u}r optische Biosensoranwendungen. Mit Hilfe von station{\"a}ren und zeitaufgel{\"o}sten Fluoreszenzexperimenten wurde der Einbau von Cumarin- und DBD markierten OSTK-St{\"a}ben in großen unilamellaren Vesikeln untersucht und die Ergebnisse durch Fluoreszenzdepolarisationsmessungen untermauert. Der letzte Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung von Cou- und DBD-funktionalisierten Polyprolinen und ihrer Kopplung an Goldnanopartikel. Die farbstoffmarkierten Polyproline konnten erfolgreich hergestellt werden. Es zeigten sich deutlich Einfl{\"u}sse auf die spektroskopischen Eigenschaften der Farbstoffe durch die Bindung an die Polyprolinhelix. Die Kopplung an die 5 nm großen AuNP konnte erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Die Erfahrungen, die durch die Kopplung der Polyproline an die AuNP, gewonnen wurde, ist die Basis f{\"u}r eine Einzelmolek{\"u}l-AFM-FRET-Nanoskopie mit OSTK-St{\"a}ben.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Behrends2017,
  author    = {Behrends, Nicole},
  title     = {Funktionalisierte OS(T)K-St{\"a}be und Sensorfluorophore zur optischen Sensorik},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-404213},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {210},
  year      = {2017},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum einen erste Oligospiro(thio)ketal (OS(T)K)-basierte Modellsysteme (molekulare Sonden) f{\"u}r abstandsabh{\"a}ngige Messungen mittels F{\"o}rster-Resonanz-Energietransfer (FRET) und zum anderen Sensorfluorophore, basierend auf einem DBD-Fluorophor und BAPTA, zur Messung der intrazellul{\"a}ren Calcium-Konzentration dargestellt. F{\"u}r die Synthese von molekularen Sonden f{\"u}r abstandsabh{\"a}ngige Messungen wurden verschiedenste einfach- und doppelt-markierte OS(T)K-St{\"a}be entwickelt und spektroskopisch untersucht. Die OS(T)K-St{\"a}be, sogenannte molekulare St{\"a}be, dienten als starre Abstandshalter zwischen den Fluorophoren. Als Fluorophore wurden Derivate von 6,7-Dihydroxy-4-methylcoumarin (Donor) und Acyl-DBD (Akzeptor) verwendet, die zusammen ein FRET-Paar bilden. Die Fluorophore wurden so funktionalisiert, dass sie sowohl unbeweglich bzw. „starr", als auch beweglich bzw. „flexibel" an den OS(T)K-Stab gebunden werden konnten. F{\"u}r die Synthese der OS(T)K-St{\"a}be wurden ebenfalls eine Reihe an unterschiedlich langen und kurzen Stabbausteinen synthetisiert. Auf diese Weise wurden eine Vielzahl an verschiedensten einfach- und doppelt-markierten OS(T)K-St{\"a}ben dargestellt, deren Fluorophore sowohl „starr" als auch „flexibel" gebunden sind. Die dargestellten St{\"a}be wurden in verschiedensten L{\"o}sungsmitteln spektroskopisch untersucht, um anschließend das Verhalten in Vesikel, die eine biomimetische Umgebung darstellen, zu beurteilen. Es wurde festgestellt, dass sich die St{\"a}be erfolgreich in die Vesikelmembran einlagerten und hohe FRET-Effizienzen aufweisen. Des Weiteren wurde ein FRET-Paar dargestellt, das sich durch 2-Photonenabsorpion im NIR-Bereich anregen l{\"a}sst. Es wurde in den lebenden Zellen mittels Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM) untersucht. Zur Untersuchung von intrazellul{\"a}rem Calcium wurden zwei verschiedene DBD-Fluorophore {\"u}ber einen kurzen Linker mit dem Calcium-Chelator BAPTA verkn{\"u}pft. Die dargestellten Fluorophore wurden sowohl in vitro als auch in vivo auf ihre Calcium-Sensitivit{\"a}t {\"u}berpr{\"u}ft. Mittels FLIM wurden in lebenden Zellen die Fluoreszenzlebenszeitverteilungen der Fluorophore nach Calcium-Konzentrations{\"a}nderungen detektiert.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Morgner2012,
  author    = {Morgner, Frank},
  title     = {Quantenpunktbasiertes spektroskopisches Lineal mit Terbium-Komplexen als Donoren f{\"u}r optische FRET-Multiplexmessungen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-63576},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2012},
  abstract  = {Der F{\"o}rster-Resonanzenergietransfer (FRET) liefert einen wichtigen Beitrag bei der Untersuchung kleinskaliger biologischer Systeme und Prozesse. M{\"o}glich wird dies durch die r-6-Abh{\"a}ngigkeit des FRET, die es erlaubt Abst{\"a}nde und strukturelle {\"A}nderungen weit unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts mit hoher Sensitivit{\"a}t und geringem Aufwand zu bestimmen. Die besonderen photophysikalischen Eigenschaften von Terbiumkomplexen (LTC) und Quantenpunkten (QD) machen sie zu geeigneten Kandidaten f{\"u}r hochsensitive und st{\"o}rungsarme Multiplex-Abstandsmessungen in biologischen Systemen und Prozessen. Die Abstandsbestimmungen setzen jedoch eine genaueste Kenntnis des Mechanismus des Energietransfers von LTC auf QD ebenso voraus, wie das Wissen um Gr{\"o}ße und Gestalt letzterer. Quantenpunkte haben im Vergleich zu biologischen Strukturen {\"a}hnliche Dimensionen und k{\"o}nnen nicht als punktf{\"o}rmig betrachtet werden, wie es bei einfacheren Farbstoffen m{\"o}glich ist. Durch ihre Form kommt es zu einer Abstandsverteilung innerhalb des Donor-Akzeptorsystems. Dies beeinflusst den Energietransfer und damit die experimentellen Ergebnisse. In dieser Arbeit wurde der Energietransfer von LTC auf QD untersucht, um zu einer Aussage hinsichtlich des Mechanismus der Energie{\"u}bertragung und der dabei zu ber{\"u}cksichtigenden photophysikalischen und strukturellen Parameter von LTC und QD zu gelangen. Mit der Annahme einer Abstandsverteilung sollten die Gr{\"o}ßen der Quantenpunkte bestimmt und der Einfluss von Form und Gestalt auf den Energietransfer betrachtet werden. Die notwendigen theoretischen und praktischen Grundlagen wurden eingangs dargestellt. Daran schlossen sich Messungen zur photophysikalischen Charakterisierung der Donoren und Akzeptoren an, die Grundlage der Berechnung der FRET-Parameter waren. Die F{\"o}rster-Radien zeigten die f{\"u}r den FRET von LTC auf QD typischen extrem hohen Werte von bis zu 11 nm. Zeitaufgel{\"o}ste Messungen der FRET-induzierten Lumineszenz der Donoren und Akzeptoren in den beiden biomolekularen Modellsystemen Zink-Histidin und Biotin-Streptavidin beschlossen den praktischen Teil. Als Donor wurde Lumi4Tb gebunden an ein Peptid bzw. Streptavidin genutzt, Akzeptoren waren f{\"u}nf verschiedene, kommerziell erh{\"a}ltliche Quantenpunkte mit Carboxyl- bzw. Biotinfunktionalisierung. Bei allen Donor-Akzeptor-Paarungen konnte FRET beobachtet und ausgewertet werden. Es konnte gezeigt werden, dass die gesamte Emission des Terbiums zum Energietransfer beitr{\"a}gt und der Orientierungsfaktor ² den Wert 2/3 annimmt. Die Charakterisierung der Bindungsverh{\"a}ltnisse innerhalb der FRET-Paare von LTC und QD {\"u}ber Verteilungsfunktionen bietet {\"u}ber die Form der Verteilungskurve die M{\"o}glichkeit Aussagen {\"u}ber die Gestalt der FRET-Partner zu treffen. So war es m{\"o}glich, die mittlere Form der Quantenpunkte als Sph{\"a}re zu bestimmen. Dies entsprach, insbesondere bei den in z-Richtung des Kristallgitters elongierten Quantenpunkten, nicht den Erwartungen. Dieser Befund erm{\"o}glicht daher bei zuk{\"u}nftigen Messungen eine Verbesserung der Genauigkeit bei Abstandsbestimmungen mit Quantenpunkten. Neben der Ermittlung der die FRET-Verteilung bestimmenden Gestalt der Quantenpunkte konnte im Rahmen dieser Arbeit anhand vergleichender Messungen die Dicke der Polymerh{\"u}lle der QD bestimmt und so gezeigt werden, dass FRET-Paare aus lumineszenten Terbiumkomplexen und Quantenpunkten in der Lage sind, Abst{\"a}nde im Nano- bis Sub-Nanometerbereich aufzul{\"o}sen.},
  language  = {de}
}