@phdthesis{Schaefer2024,
  author    = {Sch{\"a}fer, Marj{\"a}nn Helena},
  title     = {Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei S{\"a}ugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-M{\"a}usen mit humanisierter Reaktionsspezifit{\"a}t der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b)},
  doi       = {10.25932/publishup-62034},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XVII, 280},
  year      = {2024},
  abstract  = {Arachidons{\"a}urelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. F{\"u}r jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr {\"a}hnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabh{\"a}ngigkeit der enzymatischen Eigenschaften von S{\"a}ugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzh{\"o}rnchen (Tupaiidae) sind evolution{\"a}r n{\"a}her mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle f{\"u}r die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidons{\"a}urestoffwechsel von Spitzh{\"o}rnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften {\"a}hneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei M{\"a}usen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel f{\"u}r die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese k{\"o}nnen S{\"a}ugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidons{\"a}ure-12-lipoxygenierende- und Arachidons{\"a}ure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren S{\"a}ugetierspezies, die einen h{\"o}heren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidons{\"a}ure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, w{\"a}hrend evolution{\"a}r weniger weit entwickelte S{\"a}ugetiere Arachidons{\"a}ure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse f{\"u}gen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten best{\"a}tigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, k{\"o}nnen Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen {\"u}bertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in M{\"a}use durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparagins{\"a}ure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese M{\"a}use waren lebens- und fortpflanzungsf{\"a}hig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entz{\"u}ndungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entz{\"u}ndungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entz{\"u}ndungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b f{\"u}hrte zu einer verst{\"a}rkten Ausbildung von Entz{\"u}ndungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschw{\"a}chung der Entz{\"u}ndungssymptome im Freund'schen Adjuvans Pfoten{\"o}demmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entz{\"u}ndungsmodellen unterscheidet.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Sureshkumar2023,
  author    = {Sureshkumar, Priyavathi},
  title     = {Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System f{\"u}r die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkan{\"a}le},
  doi       = {10.25932/publishup-61987},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {x, 110},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als g{\"a}ngige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten f{\"u}r das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkan{\"a}le sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der {\"U}berexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten k{\"o}nnen, wie z. B. Zelltoxizit{\"a}t, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund ver{\"a}nderter Dom{\"a}nen sowie die zeitaufw{\"a}ndige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkan{\"a}len in zellfreien Proteinsyntheseplattformen f{\"u}r das k{\"u}nftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung f{\"u}r die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkan{\"a}len in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ {\"u}berexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkan{\"a}len (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie {\"u}berexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) {\"u}ber Mas und die Beteiligung von TRP-Kan{\"a}len nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode f{\"u}r chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran f{\"u}r die Integration synthetisierter Ionenkan{\"a}le in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkan{\"a}le zu untersuchen. Die Enzymaktivit{\"a}t der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkan{\"a}le wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkan{\"a}le zu analysieren. Nach entsprechender Forschung k{\"o}nnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkan{\"a}le wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkan{\"a}le.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pruefer2023,
  author    = {Pr{\"u}fer, Mareike},
  title     = {Charakterisierung und wechselfeldgest{\"u}tzte Herstellung von Enzym-Nanoarrays},
  doi       = {10.25932/publishup-61232},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612329},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {104},
  year      = {2023},
  abstract  = {Dielektrophorese ist die Manipulation polarisierbarer Partikel durch inhomogene elektrische Wechselfelder. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Enzyme durch Dielektrophorese immobilisiert und anschließend hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivit{\"a}t untersucht: Meerrettichperoxidase, Cholinoxidase aus Alcaligenes sp. und Glucoseoxidase aus Aspergillus niger. Die Immobilisierung erfolgte durch Dielektrophorese auf nano-Elektrodenarrays aus Wolfram-Zylindern mit 500 nm Durchmesser oder aus Titannitrid-Ringen mit 20 nm Breite. Die Immobilisierung der Enzyme konnte fluoreszenzmikroskopisch entweder anhand der intrinsischen Fluoreszenz oder aufgrund einer Fluoreszenzmarkierung vor oder nach der Immobilisierung f{\"u}r alle getesteten Enzyme nachgewiesen werden. Die Messung der Enzymaktivit{\"a}t erfolgte quantitativ durch den direkten oder indirekten Nachweis des gebildeten Produktes oder, im Falle der Cholinoxidase, durch Beobachtung der intrinsischen Fluoreszenz des Cofaktors FAD, die vom Oxidationszustand dieses Enzyms abh{\"a}ngt. F{\"u}r die Meerrettichperoxidase konnte so eine hohe erhaltene Enzymaktivit{\"a}t nach der Immobilisierung nachgewiesen werden. Die Aktivit{\"a}t der permanent immobilisierten Fraktion der Meerrettichperoxidase entsprach bis zu 47 \% der h{\"o}chstm{\"o}glichen Aktivit{\"a}t einer Monolage dieses Enzyms auf den Elektroden des Chips. Diese Aktivit{\"a}t kann als aktive, aber zuf{\"a}llig gegen{\"u}ber der Oberfl{\"a}che ausgerichtete Enzymschicht interpretiert werden. F{\"u}r die permanent immobilisierte Glucoseoxidase wurde nur eine Aktivit{\"a}t entsprechend <1,3 \% der Aktivit{\"a}t einer solchen Enzymschicht detektiert, w{\"a}hrend f{\"u}r die immobilisierte Cholinoxidase gar keine Aktivit{\"a}t nachgewiesen werden konnte. Die Aktivit{\"a}t der durch DEP immobilisierten Enzyme konnte somit quantitativ bestimmt werden. Der Anteil an erhaltener Aktivit{\"a}t h{\"a}ngt dabei stark vom verwendeten Enzym ab.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Goethel2023,
  author    = {G{\"o}thel, Markus},
  title     = {Entwicklung eines Verfahrens zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antik{\"o}rpern gegen Mikroorganismen basierend auf in silico Epitopanalysen},
  doi       = {10.25932/publishup-58801},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-588017},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XVI, 113},
  year      = {2023},
  abstract  = {Monoklonale Antik{\"o}rper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomolek{\"u}le f{\"u}r die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. F{\"u}r die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage f{\"u}r ein schnelles und pr{\"a}zises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen. Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren f{\"u}r die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberfl{\"a}chenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virush{\"u}llprotein VP1 integriert und f{\"u}r eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. F{\"u}r die Bestimmung antigenspezifischer antik{\"o}rperproduzierender Hybridome wurde ein Immunf{\"a}rbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren. In der vorliegenden Studie konnten f{\"u}r E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und f{\"u}r L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. F{\"u}nf verschiedene potenzielle Epitope wurden f{\"u}r E. coli O157:H7 und drei verschiedenen f{\"u}r L. pneumophila ausgew{\"a}hlt und f{\"u}r die Immunisierung mit chim{\"a}ren VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antik{\"o}rperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivit{\"a}ten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden. Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplin{\"a}re Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf f{\"u}r die Herstellung von Antik{\"o}rpern gegen Mikroorganismen einsetzbar.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Steppert2022,
  author    = {Steppert, Isabel},
  title     = {Entwicklung einer nichtinvasiven Diagnostikmethode zum Nachweis von Infektionserregern},
  doi       = {10.25932/publishup-57544},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-575441},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XIV, 101, LVIII},
  year      = {2022},
  abstract  = {Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten k{\"o}nnen. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch fr{\"u}hzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen. Herk{\"o}mmliche kulturelle Verfahren ben{\"o}tigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern f{\"u}r Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren ben{\"o}tigt. Im klassischen Griechenland verließen sich die {\"A}rzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Ger{\"u}che sind fl{\"u}chtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren. Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilit{\"a}tsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographies{\"a}ule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verl{\"a}ssliche Methode handelt. Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Ger{\"u}che produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden k{\"o}nnen. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen. Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen {\"u}berpr{\"u}ft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden. Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Ver{\"a}nderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden k{\"o}nnen. Zur {\"U}berpr{\"u}fung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden. Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ramm2022,
  author    = {Ramm, Timo},
  title     = {Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antik{\"o}rper-Charakterisierung und Validierung},
  doi       = {10.25932/publishup-56153},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XIV, 138},
  year      = {2022},
  abstract  = {Antik{\"o}rper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antik{\"o}rpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegen{\"u}ber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abh{\"a}ngigkeit des Einsatzes, der Antik{\"o}rper, f{\"u}r den gew{\"u}nschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu k{\"o}nnen. Daf{\"u}r wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antik{\"o}rper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminos{\"a}uren auf die Bindung des Antik{\"o}rpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antik{\"o}rperbindungsverhalten in Abh{\"a}ngigkeit der Aminos{\"a}ure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antik{\"o}rpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antik{\"o}rper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antik{\"o}rper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Daf{\"u}r wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden k{\"o}nnen. F{\"u}r die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor s{\"a}mtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antik{\"o}rpern sowie ihre Validierung f{\"u}r verschiedene Testsysteme.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Demin2022,
  author    = {Demin, Paul},
  title     = {Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae},
  doi       = {10.25932/publishup-55969},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {127},
  year      = {2022},
  abstract  = {Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie nat{\"u}rliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedom{\"a}ne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdom{\"a}ne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den nat{\"u}rlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedom{\"a}ne als auch die Aktivierungsdom{\"a}ne wirtsfremd sein k{\"o}nnen und dadurch k{\"u}nstliche Stoffwechselwege im Wirt, gr{\"o}ßtenteils chemisch, induziert werden k{\"o}nnen. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedom{\"a}ne nicht mehr an die Aktivierungsdom{\"a}ne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdom{\"a}ne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Dom{\"a}nen, sodass ein funktionsf{\"a}higer Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedom{\"a}ne, die Aktivierungsdom{\"a}ne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedom{\"a}ne anlagert, ver{\"a}ndert wurden. Um das System f{\"u}r industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pitzen2022,
  author    = {Pitzen, Valentin},
  title     = {Weitergef{\"u}hrte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Am{\"o}ben},
  doi       = {10.25932/publishup-54889},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XI, 104},
  year      = {2022},
  abstract  = {Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriol{\"a}r aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und m{\"o}gliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es w{\"a}hrend der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am st{\"a}rksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen w{\"a}hrend der Mitose wird f{\"u}r Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten {\"a}ußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 f{\"u}hrte zur Ausbildung von {\"u}berz{\"a}hligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erh{\"o}hten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochaufl{\"o}sende Expansion Microscopy f{\"u}r das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den {\"a}ußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in r{\"a}umlicher N{\"a}he zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als m{\"o}glicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und erm{\"o}glichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verst{\"a}ndnis der Topologie des Centrosoms.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Michelchen2021,
  author    = {Michelchen, Sophia},
  title     = {Etablierung einer Antigen-spezifischen Aktivierung von B-Lymphozyten in vitro},
  doi       = {10.25932/publishup-53027},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-530272},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XII,107},
  year      = {2021},
  abstract  = {Monoklonale Antik{\"o}rper sind essenzielle Werkzeuge in der modernen Laboranalytik sowie in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Die Herstellung monoklonaler Antik{\"o}rper ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Herk{\"o}mmliche Methoden beruhen auf der Immunisierung von Labortieren, die mitunter mehrere Monate in Anspruch nimmt. Anschließend werden die Antik{\"o}rper-produzierenden B-Lymphozyten bzw. deren Antik{\"o}rpergene isoliert und in Screening-Verfahren untersucht, um geeignete Binder zu identifizieren. Der Transfer der humoralen Immunantwort in eine in vitro Umgebung erlaubt eine Verk{\"u}rzung des Prozesses und umgeht die Notwendigkeit der in vivo Immunisierung. Das komplexe Zusammenspiel aller involvierten Immunzellen in vitro abzubilden, stellt sich allerdings als schwierig dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Realisierung einer vereinfachten In vitro Immunisierung, die sich auf die Protagonisten der Antik{\"o}rper-Produktion konzentriert: die B-Lymphozyten. Dar{\"u}ber hinaus sollte eine permanente Zelllinie etabliert werden, die zur Antik{\"o}rper-Herstellung eingesetzt werden und die Verwendung von Prim{\"a}rzellen ersetzen w{\"u}rde. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll zur In vitro Immunisierung muriner BLymphozyten etabliert. In Vorversuchen wurden die optimalen Konditionen f{\"u}r die Antigenspezifische Aktivierung gereinigter Milz-B-Lymphozyten aus nicht-immunisierten M{\"a}usen determiniert. Dazu wurde der Einfluss verschiedener Stimuli auf die Produktion unspezifischer und spezifischer Antik{\"o}rper untersucht. Eine Kombination aus dem Modellantigen VP1 (Hamster Polyomavirus H{\"u}llprotein 1), einem Anti-CD40-Antik{\"o}rper, Interleukin 4 (IL 4) und Lipopolysaccharid (LPS) oder IL 7 induzierte nachweislich eine Antigen-spezifische Antik{\"o}rper-Antwort in vitro. Als Indikatoren einer erfolgreichen Aktivierung der B-Lymphozyten infolge der in vitro Stimulation wurden die rapide Proliferation und die Expression charakteristischer Aktivierungsmarker auf der Zelloberfl{\"a}che nachgewiesen. In einer Zeitreihe {\"u}ber zehn Tage wurde am zehnten Tag der In vitro Immunisierung die verh{\"a}ltnism{\"a}ßig h{\"o}chste Konzentration Antigen-spezifischer IgG-Antik{\"o}rper im Kultur{\"u}berstand der stimulierten Zellen nachgewiesen. Als n{\"a}chster Schritt sollte eine permanente Zelllinie hergestellt werden, die statt prim{\"a}rer BLymphozyten f{\"u}r die zuvor etablierte In vitro Immunisierung eingesetzt werden k{\"o}nnte. Zu diesem Zweck wurden retrovirale Vektoren hergestellt, die durch den Transfer verschiedener Onkogene in murine B-Lymphozyten bzw. deren Vorl{\"a}uferzellen das Proliferationsverhalten der Zellen manipulieren sollen. Es wurden Retroviren mit Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassetten mit den Onkogenen cmyc, Bcl2, BclxL und dem Fusionsgen NUP98HOXB4 generiert. Eine Testzelllinie wurde erfolgreich mit den hergestellten Retroviren transduziert und die Funktionalit{\"a}t der hergestellten Viren anhand verschiedener Assays belegt. Die transferierten Gene konnten in der Testzelllinie auf DNAEbene nachgewiesen oder die {\"U}berexpression der entsprechenden Proteine im Western Blot detektiert werden. Es wurden schließlich B-Lymphozyten bzw. unreife Vorl{\"a}uferzellen derselben mit den generierten Retroviren transduziert und mit Knochenmark-{\"a}hnlichen Stromazellen co-kultiviert. Aus keinem der transduzierten Ans{\"a}tze konnte bisher eine Zelllinie oder eine Langzeit-Kultur etabliert werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Effektivit{\"a}t und {\"U}bertragbarkeit des zuvor etablierten Protokolls zur In vitro Immunisierung muriner B-Lymphozyten anhand verschiedener Antigene gezeigt. Es konnten in vitro spezifische IgG-Antworten gegen VP1, Legionella pneumophila und das Protein Mip, von dem ein Peptid in das zur Immunisierung eingesetzte VP1 integriert wurde, induziert werden. Die stimulierten B-Lymphozyten wurden durch Fusion mit Myelomzellen in permanente Antik{\"o}rper-produzierende Zelllinien transformiert. Dabei konnten mehrere Hybridomzelllinien generiert werden, die spezifische IgGAntik{\"o}rper gegen VP1 oder Mip produzieren. Die generierten Antik{\"o}rper konnten sowohl im Western Blot als auch im ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) das entsprechende Antigen spezifisch binden. Die hier etablierte In vitro Immunisierung bietet eine effektive Alternative zu bisherigen Verfahren zur Herstellung spezifischer Antik{\"o}rper. Sie ersetzt die Immunisierung von Versuchstieren und reduziert den Zeitaufwand erheblich. In Kombination mit der Hybridomtechnologie k{\"o}nnen die in vitro immunisierten Zellen, wie hier demonstriert, zur Generation von Hybridomzelllinien und zur Herstellung monoklonaler Antik{\"o}rper genutzt werden. Um die Verwendung von Versuchstieren in dieser Methode durch eine ad{\"a}quate permanente Zelllinie zu ersetzen, muss die genetische Ver{\"a}nderung von B-Lymphozyten und unreifen h{\"a}matopoetischen Zellen optimiert werden. Die Ergebnisse bieten eine Basis f{\"u}r eine universelle, Spezies-unabh{\"a}ngige Methodik zur Antik{\"o}rperherstellung und f{\"u}r die Etablierung einer idealen, tierfreien In vitro Immunisierung.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Raffeiner2021,
  author    = {Raffeiner, Margot},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung des Xanthomonas Typ-III Effektorproteins XopS},
  doi       = {10.25932/publishup-52553},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525532},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {IX, 185},
  year      = {2021},
  abstract  = {Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdr{\"u}cken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort st{\"o}ren diese die Immunantwort des Wirts oder f{\"o}rdern die Etablierung einer f{\"u}r das Pathogen g{\"u}nstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunit{\"a}t gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu st{\"o}ren. Die Aufkl{\"a}rung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv w{\"a}hrend der pr{\"a}invasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfl{\"a}che suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abh{\"a}ngigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die pr{\"a}-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen w{\"a}hrend des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis f{\"u}hrte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmons{\"a}ure (JA), w{\"a}hrend eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicyls{\"a}ure (SA)-Gehalts f{\"u}hrte. So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv f{\"o}rdert, indem JA-abh{\"a}ngige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdr{\"u}ckung SA-abh{\"a}ngiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erh{\"o}hte die Toleranz der Pflanze gegen{\"u}ber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier {\"u}ber verschiedene experimentelle Ans{\"a}tze bekr{\"a}ftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abh{\"a}ngigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gew{\"a}hrleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 {\"u}ber das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter best{\"a}tigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins f{\"u}hrt, indem er auf bislang ungekl{\"a}rte Weise dessen Abbau {\"u}ber das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu f{\"u}hrt, dass eine dar{\"u}ber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen f{\"o}rdert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die f{\"u}r seine Interaktion mit WRKY40 bzw. f{\"u}r die Aufschl{\"u}sselung seines Wirkmechanismus relevant sein k{\"o}nnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion k{\"o}nnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. W{\"a}hrend einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion f{\"u}hrte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegen{\"u}ber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung w{\"a}hrend der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zus{\"a}tzlich verst{\"a}rkt wird. Weiterf{\"u}hrende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgef{\"u}hrt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschl{\"u}sseln.},
  language  = {de}
}