@phdthesis{Gomez2016, author = {Gomez, David}, title = {Mechanisms of biochemical reactions within crowded environments}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-94593}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {vii, 112}, year = {2016}, abstract = {The cell interior is a highly packed environment in which biological macromolecules evolve and function. This crowded media has effects in many biological processes such as protein-protein binding, gene regulation, and protein folding. Thus, biochemical reactions that take place in such crowded conditions differ from diluted test tube conditions, and a considerable effort has been invested in order to understand such differences. In this work, we combine different computationally tools to disentangle the effects of molecular crowding on biochemical processes. First, we propose a lattice model to study the implications of molecular crowding on enzymatic reactions. We provide a detailed picture of how crowding affects binding and unbinding events and how the separate effects of crowding on binding equilibrium act together. Then, we implement a lattice model to study the effects of molecular crowding on facilitated diffusion. We find that obstacles on the DNA impair facilitated diffusion. However, the extent of this effect depends on how dynamic obstacles are on the DNA. For the scenario in which crowders are only present in the bulk solution, we find that at some conditions presence of crowding agents can enhance specific-DNA binding. Finally, we make use of structure-based techniques to look at the impact of the presence of crowders on the folding a protein. We find that polymeric crowders have stronger effects on protein stability than spherical crowders. The strength of this effect increases as the polymeric crowders become longer. The methods we propose here are general and can also be applied to more complicated systems.}, language = {en} } @phdthesis{Baumgart2013, author = {Baumgart, Natalie}, title = {Faltungseigenschaften des extrazellul{\"a}ren Proteins Internalin J und seine Cysteinleiter}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-69603}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2013}, abstract = {Internalin J (InlJ) geh{\"o}rt zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Dom{\"a}ne von InlJ ist aus 15 regelm{\"a}ßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminos{\"a}uren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungew{\"o}hnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die H{\"a}ufigkeit von Cysteinen in InlJ ist f{\"u}r ein extrazellul{\"a}res Protein von L. monocytogenes außergew{\"o}hnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquit{\"a}ren Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilit{\"a}t und Faltung nicht {\"a}quivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilit{\"a}tsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine n{\"a}her beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zug{\"a}nglich ist. Die thermodynamische Stabilit{\"a}t wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments m{\"o}glich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts" Prinzip folgt. Die G{\"u}ltigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung best{\"a}tigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilit{\"a}t von InlJ geht mit hoher Kooperativit{\"a}t einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativit{\"a}t haupts{\"a}chlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberfl{\"a}chen{\"a}nderung w{\"a}hrend der Faltung bereits zum gr{\"o}ßten Teil erfolgt ist, bevor der {\"U}bergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen {\"u}ber den {\"U}bergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im {\"U}bergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilit{\"a}t und ein stark-kooperatives Verhalten f{\"u}r das extrazellul{\"a}re Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse k{\"o}nnten wichtige Beitr{\"a}ge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.}, language = {de} } @phdthesis{Fiedler2010, author = {Fiedler, Christian}, title = {Die Strukturbildung der beta-Helix in der Pektatlyase Pel-15}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-47250}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminos{\"a}uren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturons{\"a}urederivate in einem Ca2+-abh{\"a}ngigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einstr{\"a}ngigen, rechtsg{\"a}ngigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enth{\"a}lt jede Windung drei β-Str{\"a}nge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 {\"u}bereinander und bilden entlang der Helixachse fl{\"a}chige, parallele β-Faltbl{\"a}tter aus. Im Bereich dieser β-Faltbl{\"a}tter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden L{\"o}sungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgepr{\"a}gt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix {\"u}ber Salzbr{\"u}cken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivit{\"a}t und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolution{\"a}r konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingef{\"u}hrt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zust{\"a}nden HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zust{\"a}nde sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In R{\"u}ckfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 \% der faltenden Molek{\"u}le den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung" stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite" der Aktivierungsbarriere und tr{\"a}gt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht l{\"a}nger nachweisbar ist. Entgegen anf{\"a}nglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolution{\"a}r konservierten Disulfidbr{\"u}cke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbr{\"u}cke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, l{\"a}sst die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Ver{\"a}nderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinit{\"a}t bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivit{\"a}tstests f{\"u}r VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivit{\"a}t um fast 50 \% an. Die evolution{\"a}r konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbr{\"u}cke im Besonderen m{\"u}ssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl f{\"u}r die Struktur des katalytischen Zentrums als auch f{\"u}r die Strukturbildung der β-Helix w{\"a}hrend der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die f{\"u}r andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber pr{\"a}destinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilit{\"a}t ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilit{\"a}t und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Aufl{\"o}sung zu studieren, die aufgrund der Komplexit{\"a}t bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verf{\"u}gung stand.}, language = {de} } @phdthesis{Becker2009, author = {Becker, Marion}, title = {Bedeutung eines hydrophoben Seitenkettenstapels f{\"u}r Stabilit{\"a}t, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-42674}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {Das homotrimere Tailspikeadh{\"a}sin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilit{\"a}t in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedom{\"a}ne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdom{\"a}ne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Str{\"a}nge, die durch turns und loops unterschiedlicher L{\"a}nge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenf{\"o}rmigen Aufbau formen beta-Str{\"a}nge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltbl{\"a}tter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet gr{\"o}ßtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelm{\"a}ßig entlang der L{\"a}ngsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltbl{\"a}tter und die regelm{\"a}ßige Anordnung von {\"a}hnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilit{\"a}t des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilit{\"a}t, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das volumin{\"o}sere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verk{\"u}rzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Dom{\"a}ne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin st{\"a}rkere Effekte ausl{\"o}sen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis f{\"u}r Stabilit{\"a}t und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgel{\"o}ster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte {\"A}nderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass m{\"o}gliche Kavit{\"a}ten gef{\"u}llt und sterische Spannung abgebaut werden k{\"o}nnen. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsph{\"a}notyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerh{\"o}hung waren die Ausbeuten des N‑terminal verk{\"u}rzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterf{\"u}hrende Experimente zeigten, dass der tsf‑Ph{\"a}notyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilit{\"a}t des nativen Trimers ausgel{\"o}st wurde. Durch Untersuchungen am vollst{\"a}ndigen und am N‑terminal verk{\"u}rzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verl{\"a}ufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungs{\"a}ste im Chevronplot die Abh{\"a}ngigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gew{\"o}lbt. Dieses Verhalten k{\"o}nnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten {\"U}bergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Dom{\"a}ne, bei der die N‑terminale Capsidbindedom{\"a}ne und die C‑terminale Trimerisierungsdom{\"a}ne deletiert sind und welche als unabh{\"a}ngige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativit{\"a}ten folgen. Die konformationellen Stabilit{\"a}ten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, w{\"a}hrend Mutationen in {\"a}ußeren Bereichen der Dom{\"a}ne keinen Einfluss auf die Stabilit{\"a}t der beta-Helix haben. Bei Verl{\"a}ngerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im {\"U}bergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem f{\"u}r die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr {\"a}hnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „R{\"u}ckenflosse" beinhaltet, stabilit{\"a}tsbestimmend. Dieser Kern k{\"o}nnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung" kompaktieren.}, language = {de} } @phdthesis{Freiberg2004, author = {Freiberg, Alexander}, title = {Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilit{\"a}t und Faltung eines Solenoidproteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {F{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilit{\"a}t und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Er{\"o}rterung von Gesetzm{\"a}ßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globul{\"a}ren Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine geh{\"o}ren, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelf{\"o}rmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Terti{\"a}rstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilit{\"a}t und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die f{\"u}r die Infektion ausreichende zentrale LRR-Dom{\"a}ne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrit{\"a}t und die Stabilit{\"a}ts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Dom{\"a}ne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Dom{\"a}ne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Dom{\"a}ne mit einer Immunglobulin (Ig)-{\"a}hnlichen Dom{\"a}ne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollst{\"a}ndige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungs{\"u}berg{\"a}ngen durchgef{\"u}hrt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichts{\"u}berg{\"a}nge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zus{\"a}tzliche Ig-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erh{\"o}hung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilit{\"a}tszunahme {\"a}ußerte sich sowohl in einer Verschiebung des {\"U}bergangsmittelpunktes zu h{\"o}heren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erh{\"o}hung der Kooperativit{\"a}t des Gleichgewichts{\"u}bergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Dom{\"a}ne nicht unabh{\"a}ngig voneinander falten und dass die Ig-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor w{\"a}hrend der Invasion interagiert, eine kritische Rolle f{\"u}r die in\ vivo Stabilit{\"a}t des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs die Integrit{\"a}t der Internalin-Dom{\"a}ne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen {\"u}ber Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Dom{\"a}ne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH\ 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen {\"u}ber ein Intermediat. Eine Erh{\"o}hung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins f{\"u}hrte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im {\"U}bergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Dom{\"a}ne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals w{\"a}hrend der Entfaltung m{\"o}glicherweise auf die Pr{\"a}senz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem {\"U}bergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abh{\"a}ngigkeit von der Temperatur, w{\"a}hrend der zweite schnellere Prozess der Entfaltung st{\"a}rker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten f{\"u}r die Erkl{\"a}rung der langsamen Faltungsphase zun{\"a}chst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollst{\"a}ndige Amplitude w{\"a}hrend der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle f{\"u}r die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden k{\"o}nnen.}, subject = {Proteinfaltung}, language = {de} } @phdthesis{Walter2002, author = {Walter, Monika}, title = {Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilit{\"a}t, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0000588}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2002}, abstract = {Die Pektat-Lyasen geh{\"o}ren zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturons{\"a}ure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Prim{\"a}rzellw{\"a}nden. Der Abbau der alpha-1,4-verbr{\"u}ckten Galakturons{\"a}urereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer unges{\"a}ttigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. F{\"u}r die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium n{\"o}tig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsg{\"a}ngige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gel{\"o}st worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungef{\"a}hren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbr{\"u}cken enth{\"a}lt. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verh{\"a}ltnism{\"a}ßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen {\"u}ber die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins n{\"a}her zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage gekl{\"a}rt werden, welche Wechselwirkungen f{\"u}r die Stabilit{\"a}t dieses Proteins einerseits und f{\"u}r die Stabilit{\"a}t von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
R{\"u}ckfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollst{\"a}ndig m{\"o}glich. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit der R{\"u}ckfaltungsrate im Bereich des {\"U}bergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der R{\"u}ckfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollst{\"a}ndig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren k{\"o}nnen. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativ{\"a}hnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminos{\"a}uren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) f{\"u}hrte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivit{\"a}t, da die Mutationsstelle in der N{\"a}he der putativen Substratbindetasche liegt. Die R{\"u}ckfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10\&\#176;C ann{\"a}hernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht ver{\"a}ndert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands f{\"u}hrte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10\&\#176;C. GdmCl-induzierte Faltungs{\"u}berg{\"a}nge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivit{\"a}t einen kooperativen Phasen{\"u}bergang mit einem {\"U}bergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die {\"U}bereinstimmung der Faltungs{\"u}berg{\"a}nge bei beiden Messparametern konnten die Faltungs{\"u}berg{\"a}nge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung f{\"u}r die Mutante von -\ 64.2\ \&\#177;\ 0.4\ kJ/mol und eine Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs von -\ 58.2\ \&\#177;\ 0.3\ kJ/(mol\&\#183;M) bestimmt.
BsPel enth{\"a}lt, wie die meisten monomeren rechtsg{\"a}ngigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbr{\"u}ckter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zug{\"a}nglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilit{\"a}t und R{\"u}ckfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A n{\"a}her analysiert. Dabei f{\"u}hrte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings f{\"u}hrten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsph{\"a}notyp und die Hysterese im Denaturierungs{\"u}bergang wurde verst{\"a}rkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr fr{\"u}h ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im {\"U}bergangszustand vorhanden.}, subject = {Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix }, language = {de} }