@phdthesis{Scheich2004,
  author    = {Scheich, Christoph},
  title     = {High-throughput evaluation of protein folding conditions and expression constructs for structural genomics},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001552},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2004},
  abstract  = {Das E. coli Expressionssystem ist das am h{\"a}ufigsten angewandte hinsichtlich der rekombinante Proteinexpression f{\"u}r strukturelle und funktionelle Analysen aufgrund der hohen erzielten Ausbeuten und der einfachen Handhabbarkeit. Allerdings ist insbesondere die Expression eukaryotischer Proteine in E. coli problematisch, z.B. wenn das Protein nicht korrekt gefaltet ist und in unl{\"o}slichen Inclusion Bodies anf{\"a}llt. In manchen F{\"a}llen ist die Analyse von Deletionskonstrukten oder einzelnen Proteindom{\"a}nen der Untersuchung des Voll{\"a}ngeproteins vorzuziehen. Dies umfasst die Herstellung eines Satzes von Expressionskonstrukten, welche charakterisiert werden m{\"u}ssen. In dieser Arbeit werden Methoden optimiert und evaluiert f{\"u}r die in vitro-Faltung von Inclusion Body-Proteinen sowie die Entwicklung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung von Expressionskonstrukten. Die {\"U}berf{\"u}hrung von Inclusion Body-Proteinen in den nativen Zustand beinhaltet zwei Schritte: (a) Aufl{\"o}sen mit einen chaotropen Reagenz oder starkem ionischen Detergenz und (b) Faltung des Proteins durch Beseitigung des Chaotrops begleitet von dem Transfer in einen geeigneten Puffer. Die Ausbeute an nativ gefaltetem Protein ist oft stark eingeschr{\"a}nkt aufgrund von Aggregation und Fehlfaltung; sie kann allerdings durch die Zugabe bestimmter Additive zum Faltungspuffer erh{\"o}ht werden. Solche Additive m{\"u}ssen empirisch identifiziert werden. In dieser Arbeit wurde eine Testprozedur f{\"u}r Faltungsbedingungen entwickelt. Zur Reduzierung der m{\"o}glichen Kombinationen der getesteten Additive wurden sowohl empirische Beobachtungen aus der Literatur als auch bekannte Eigenschaften der Additive ber{\"u}cksichtigt. Zur Verminderung der eingesetzten Proteinmenge und des Arbeitsaufwandes wurde der Test automatisiert und miniaturisiert mittels eines Pipettierroboters. 20 Bedingungen zum schnellen Verd{\"u}nnen von denaturierten Proteinen werden hierbei getestet und zwei Bedingungen zur Faltung von Proteinen mit dem Detergenz/Cyclodextrin Protein-Faltungssystem von Rozema et al. (1996). 100 \&\#181;g Protein werden pro Bedingung eingesetzt. Zus{\"a}tzlich werden acht Bedingungen f{\"u}r die Faltung von His-Tag-Fusionsproteinen (ca. 200 \&\#181;g), welche an eine Metallchelat-Matrix immobilisiert sind, getestet. Die Testprozedur wurde erfolgreich angewendet zur Faltung eines humanen Proteins, der p22 Untereinheit von Dynactin, welche in E. coli in Inclusion Bodies exprimiert wird. So wie es sich bei vielen Proteinen darstellt, war auch f{\"u}r p22 Dynactin kein biologischer Nachweistest vorhanden, um den Erfolg des Faltungsexperimentes zu messen. Die L{\"o}slichkeit des Proteins kann nicht als eindeutiges Kriterium dienen, da neben nativ gefaltetem Protein, l{\"o}sliche fehlgefaltete Spezies und Mikroaggregate auftreten k{\"o}nnen. Diese Arbeit evaluiert Methoden zur Detektion kleiner Mengen nativen Proteins nach dem automatisierten Faltungstest. Bevor p22 Dynactin gefaltet wurde, wurden zwei Modellenzyme zur Evaluierung eingesetzt, bovine Carboanhydrase II (CAB) und Malat Dehydrogenase aus Schweineherz-Mitochondrien. Die wiedererlangte Aktivit{\"a}t nach der R{\"u}ckfaltung wurde korreliert mit verschiedenen biophysikalischen Methoden. Bindungsstudien mit 8-Anilino-1-Naphtalenesulfons{\"a}ure ergaben keine brauchbaren Informationen bei der R{\"u}ckfaltung von CAB aufgrund der zu geringen Sensitivit{\"a}t und da fehlgefaltete Proteine nicht eindeutig von nativem Protein unterschieden werden konnten. Tryptophan Fluoreszenzspektren der r{\"u}ckgefalteten CAB wurden zur Einsch{\"a}tzung des Erfolges der R{\"u}ckfaltung angewandt. Die Verschiebung des Intensit{\"a}tsmaximum zu einer niedrigeren Wellenl{\"a}nge im Vergleich zum denaturiert entfalteten Protein sowie die Fluoreszenzintensit{\"a}t korrelierten mit der wiedererlangten enzymatischen Aktivit{\"a}t. F{\"u}r beide Modellenzyme war analytische hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) brauchbar zur Identifizierung r{\"u}ckgefalteter Proben mit aktivem Enzym. Kompakt gefaltetes, aktives Enzym eluierte in einem distinkten Peak im abnehmenden Ammoniumsulfat-Gradienten. Das Detektionslimit f{\"u}r analytische HIC lag bei 5 \&\#181;g. Im Falle von CAB konnte gezeigt werden, dass Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie und analytische HIC in Kombination geeignet sind um Falsch-Positive oder Falsch-Negative, welche mit einem der Monitore erhalten wurden, auszuschließen. Diese beiden Methoden waren ebenfalls geeignet zur Identifizierung der Faltungsbedingungen von p22 Dynactin. Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie kann jedoch zu Falsch-Positiven f{\"u}hren, da in machen F{\"a}llen Spektren von l{\"o}slichen Mikroaggregaten kaum unterscheidbar sind von Spektren des nativ gefalteten Proteins. Dies zusammenfassend wurde eine schnelle und zuverl{\"a}ssige Testprozedur entwickelt, um Inclusion Body-Proteine einer strukturellen und funktionellen Analyse zug{\"a}nglich zu machen. In einem separaten Projekt wurden 88 verschiedene E. coli-Expressionskonstrukte f{\"u}r 17 humane Proteindom{\"a}nen, welche durch Sequenzanalyse identifiziert wurden, mit einer Hochdurchsatzreinigung und \–faltungsanalytik untersucht, um f{\"u}r die Strukturanalyse geeignete Kandidaten zu erhalten. Nach Expression in einem Milliliter im 96er Mikrotiterplattenformat und automatisierter Proteinreinigung wurden l{\"o}slich exprimierte Proteindom{\"a}nen direkt analysiert mittels 1D \&\#185;H-NMR Spektroskopie. Hierbei zeigte sich, dass insbesondere isolierte Methylgruppen-Signale unter 0.5 ppm sensitive und zuverl{\"a}ssige Sonden sind f{\"u}r gefaltetes Protein. Zus{\"a}tzlich zeigte sich, dass \– {\"a}hnlich zur Evaluierung des Faltungstests \– analytische HIC effizient eingesetzt werden kann zur Identifizierung von Konstrukten, welche kompakt gefaltetes Protein ergeben. Sechs Konstrukte, welche zwei Dom{\"a}nen repr{\"a}sentieren, konnten schnell als tauglich f{\"u}r die Strukturanalyse gefunden werden. Die Struktur einer dieser Dom{\"a}nen wurde k{\"u}rzlich von Mitarbeitern gel{\"o}st, die andere Struktur wurde im Laufe dieses Projektes von einer anderen Gruppe ver{\"o}ffentlicht.},
  language  = {en}
}