@phdthesis{Freiberg2004, author = {Freiberg, Alexander}, title = {Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilit{\"a}t und Faltung eines Solenoidproteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2004}, abstract = {F{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilit{\"a}t und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Er{\"o}rterung von Gesetzm{\"a}ßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globul{\"a}ren Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine geh{\"o}ren, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelf{\"o}rmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Terti{\"a}rstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilit{\"a}t und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die f{\"u}r die Infektion ausreichende zentrale LRR-Dom{\"a}ne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrit{\"a}t und die Stabilit{\"a}ts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Dom{\"a}ne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Dom{\"a}ne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Dom{\"a}ne mit einer Immunglobulin (Ig)-{\"a}hnlichen Dom{\"a}ne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollst{\"a}ndige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungs{\"u}berg{\"a}ngen durchgef{\"u}hrt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichts{\"u}berg{\"a}nge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zus{\"a}tzliche Ig-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erh{\"o}hung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilit{\"a}tszunahme {\"a}ußerte sich sowohl in einer Verschiebung des {\"U}bergangsmittelpunktes zu h{\"o}heren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erh{\"o}hung der Kooperativit{\"a}t des Gleichgewichts{\"u}bergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Dom{\"a}ne nicht unabh{\"a}ngig voneinander falten und dass die Ig-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor w{\"a}hrend der Invasion interagiert, eine kritische Rolle f{\"u}r die in\ vivo Stabilit{\"a}t des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativit{\"a}t des {\"U}bergangs die Integrit{\"a}t der Internalin-Dom{\"a}ne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen {\"u}ber Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Dom{\"a}ne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH\ 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen {\"u}ber ein Intermediat. Eine Erh{\"o}hung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins f{\"u}hrte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im {\"U}bergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Dom{\"a}ne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals w{\"a}hrend der Entfaltung m{\"o}glicherweise auf die Pr{\"a}senz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem {\"U}bergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abh{\"a}ngigkeit von der Temperatur, w{\"a}hrend der zweite schnellere Prozess der Entfaltung st{\"a}rker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten f{\"u}r die Erkl{\"a}rung der langsamen Faltungsphase zun{\"a}chst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollst{\"a}ndige Amplitude w{\"a}hrend der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle f{\"u}r die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden k{\"o}nnen.}, subject = {Proteinfaltung}, language = {de} } @phdthesis{Fiedler2010, author = {Fiedler, Christian}, title = {Die Strukturbildung der beta-Helix in der Pektatlyase Pel-15}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-47250}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2010}, abstract = {Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminos{\"a}uren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturons{\"a}urederivate in einem Ca2+-abh{\"a}ngigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einstr{\"a}ngigen, rechtsg{\"a}ngigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enth{\"a}lt jede Windung drei β-Str{\"a}nge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 {\"u}bereinander und bilden entlang der Helixachse fl{\"a}chige, parallele β-Faltbl{\"a}tter aus. Im Bereich dieser β-Faltbl{\"a}tter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden L{\"o}sungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgepr{\"a}gt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix {\"u}ber Salzbr{\"u}cken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivit{\"a}t und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolution{\"a}r konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingef{\"u}hrt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zust{\"a}nden HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zust{\"a}nde sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In R{\"u}ckfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 \% der faltenden Molek{\"u}le den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung" stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite" der Aktivierungsbarriere und tr{\"a}gt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht l{\"a}nger nachweisbar ist. Entgegen anf{\"a}nglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolution{\"a}r konservierten Disulfidbr{\"u}cke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbr{\"u}cke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, l{\"a}sst die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Ver{\"a}nderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinit{\"a}t bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivit{\"a}tstests f{\"u}r VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivit{\"a}t um fast 50 \% an. Die evolution{\"a}r konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbr{\"u}cke im Besonderen m{\"u}ssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl f{\"u}r die Struktur des katalytischen Zentrums als auch f{\"u}r die Strukturbildung der β-Helix w{\"a}hrend der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die f{\"u}r andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber pr{\"a}destinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilit{\"a}t ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilit{\"a}t und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Aufl{\"o}sung zu studieren, die aufgrund der Komplexit{\"a}t bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verf{\"u}gung stand.}, language = {de} } @phdthesis{Becker2009, author = {Becker, Marion}, title = {Bedeutung eines hydrophoben Seitenkettenstapels f{\"u}r Stabilit{\"a}t, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-42674}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2009}, abstract = {Das homotrimere Tailspikeadh{\"a}sin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilit{\"a}t in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedom{\"a}ne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdom{\"a}ne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Str{\"a}nge, die durch turns und loops unterschiedlicher L{\"a}nge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenf{\"o}rmigen Aufbau formen beta-Str{\"a}nge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltbl{\"a}tter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet gr{\"o}ßtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelm{\"a}ßig entlang der L{\"a}ngsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltbl{\"a}tter und die regelm{\"a}ßige Anordnung von {\"a}hnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilit{\"a}t des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilit{\"a}t, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das volumin{\"o}sere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verk{\"u}rzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Dom{\"a}ne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin st{\"a}rkere Effekte ausl{\"o}sen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis f{\"u}r Stabilit{\"a}t und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgel{\"o}ster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte {\"A}nderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass m{\"o}gliche Kavit{\"a}ten gef{\"u}llt und sterische Spannung abgebaut werden k{\"o}nnen. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsph{\"a}notyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerh{\"o}hung waren die Ausbeuten des N‑terminal verk{\"u}rzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterf{\"u}hrende Experimente zeigten, dass der tsf‑Ph{\"a}notyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilit{\"a}t des nativen Trimers ausgel{\"o}st wurde. Durch Untersuchungen am vollst{\"a}ndigen und am N‑terminal verk{\"u}rzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verl{\"a}ufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungs{\"a}ste im Chevronplot die Abh{\"a}ngigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gew{\"o}lbt. Dieses Verhalten k{\"o}nnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten {\"U}bergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Dom{\"a}ne, bei der die N‑terminale Capsidbindedom{\"a}ne und die C‑terminale Trimerisierungsdom{\"a}ne deletiert sind und welche als unabh{\"a}ngige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativit{\"a}ten folgen. Die konformationellen Stabilit{\"a}ten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, w{\"a}hrend Mutationen in {\"a}ußeren Bereichen der Dom{\"a}ne keinen Einfluss auf die Stabilit{\"a}t der beta-Helix haben. Bei Verl{\"a}ngerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im {\"U}bergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem f{\"u}r die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr {\"a}hnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „R{\"u}ckenflosse" beinhaltet, stabilit{\"a}tsbestimmend. Dieser Kern k{\"o}nnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung" kompaktieren.}, language = {de} } @phdthesis{Baumgart2013, author = {Baumgart, Natalie}, title = {Faltungseigenschaften des extrazellul{\"a}ren Proteins Internalin J und seine Cysteinleiter}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-69603}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, year = {2013}, abstract = {Internalin J (InlJ) geh{\"o}rt zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Dom{\"a}ne von InlJ ist aus 15 regelm{\"a}ßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminos{\"a}uren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungew{\"o}hnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die H{\"a}ufigkeit von Cysteinen in InlJ ist f{\"u}r ein extrazellul{\"a}res Protein von L. monocytogenes außergew{\"o}hnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquit{\"a}ren Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilit{\"a}t und Faltung nicht {\"a}quivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilit{\"a}tsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine n{\"a}her beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zug{\"a}nglich ist. Die thermodynamische Stabilit{\"a}t wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments m{\"o}glich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts" Prinzip folgt. Die G{\"u}ltigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung best{\"a}tigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilit{\"a}t von InlJ geht mit hoher Kooperativit{\"a}t einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativit{\"a}t haupts{\"a}chlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberfl{\"a}chen{\"a}nderung w{\"a}hrend der Faltung bereits zum gr{\"o}ßten Teil erfolgt ist, bevor der {\"U}bergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen {\"u}ber den {\"U}bergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im {\"U}bergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilit{\"a}t und ein stark-kooperatives Verhalten f{\"u}r das extrazellul{\"a}re Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse k{\"o}nnten wichtige Beitr{\"a}ge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.}, language = {de} }