@phdthesis{Krueger2011,
  author    = {Kr{\"u}ger, Anne},
  title     = {Molekulare Charakterisierung von NE81 und CP75, zwei kernh{\"u}llen- und centrosomassoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-53915},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2011},
  abstract  = {Lamine bilden zusammen mit laminassoziierten Proteinen die nukle{\"a}re Lamina. Diese ist notwendig f{\"u}r die mechanische Stabilit{\"a}t von Zellen, die Organisation des Chromatins, der Genexpression, dem Fortgang des Zellzyklus und der Zellmigration. Die vielf{\"a}ltigen Funktionen der Lamine werden durch die Pathogenese von Laminopathien belegt. Zu diesen Erkrankungen, welche ihre Ursache in Mutationen innerhalb der laminkodierenden Gene, oder der Gene laminassoziierter bzw. laminprozessierender Proteine haben, z{\"a}hlen unter anderem das „Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom", die „Emery-Dreifuss" Muskeldystrophie und die dilatierte Kardiomyopathie. Trotz der fundamentalen Bedeutung der Lamine, wurden diese bisher nur in Metazoen und nicht in einzelligen Organismen detektiert. Der am{\"o}bide Organismus Dictyostelium discoideum ist ein haploider Eukaryot, der h{\"a}ufig als Modellorganismus in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie eingesetzt wird. Mit der Entdeckung von NE81, einem Protein das mit der inneren Kernh{\"u}lle von Dictyostelium discoideum assoziiert ist, wurde erstmals ein Protein identifiziert, dass man aufgrund seiner Eigenschaften als lamin{\"a}hnliches Protein in einem niederen Eukaryoten bezeichnen kann. Diese Merkmale umfassen die Existenz lamintypischer Sequenzen, wie die CDK1-Phosphorylierungsstelle, direkt gefolgt von einer zentralen „Rod"-Dom{\"a}ne, sowie eine typische NLS und die hoch konservierte CaaX-Box. F{\"u}r die Etablierung des NE81 als „primitives" Lamin, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Experimente durchgef{\"u}hrt, die strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten zu den Laminen in anderen Organismen aufzeigen konnten. Die Herstellung eines polyklonalen Antik{\"o}rpers erm{\"o}glichte die Verifizierung der subzellul{\"a}ren Lokalisation des NE81 durch Elektronenmikroskopie und gab Einblicke in das Verhalten des endogenen Proteins innerhalb des Zellzyklus. Mit der Generierung von NE81-Nullmutanten konnte demonstriert werden, dass NE81 eine wichtige Rolle bei der nukle{\"a}ren Integrit{\"a}t und der Chromatinorganisation von Zellen spielt. Des Weiteren f{\"u}hrte die Expression von zwei CaaX-Box deletierten NE81 - Varianten dazu, den Einfluss des Proteins auf die mechanische Stabilit{\"a}t der Zellen nachweisen zu k{\"o}nnen. Auch die Bedeutung der hochkonservierten CaaX-Box f{\"u}r die Lokalisation des Proteins wurde durch die erhaltenen Ergebnisse deutlich. Mit der Durchf{\"u}hrung von FRAP-Experimente konnte außerdem die strukturgebende Funktion von NE81 innerhalb des Zellkerns bekr{\"a}ftigt werden. Zus{\"a}tzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen, den Einfluss der Isoprenylcysteincarboxylmethyltransferase auf die Lokalisation des Proteins aufzukl{\"a}ren. Die Entdeckung eines lamin{\"a}hnlichen Proteins in einem einzelligen Organismus, der an der Schwelle zu den Metazoen steht, ist f{\"u}r die evolution{\"a}re Betrachtung der Entwicklung der sozialen Am{\"o}be und f{\"u}r die Erforschung der molekularen Basis von Laminopathien in einem einfachen Modellorganismus sehr interessant. Die Arbeit mit Dictyostelium discoideum k{\"o}nnte daher Wege aufzeigen, dass Studium der Laminopathien am Tiermodell drastisch zu reduzieren. In den letzten Jahren hat die Erforschung unbekannter Bestandteile des Centrosoms in Dictyostelium discoideum große Fortschritte gemacht. Eine zu diesem Zwecke von unserer Arbeitsgruppe durchgef{\"u}hrte Proteomstudie, f{\"u}hrte zur Identifizierung weiterer, potentiell centrosomaler Kandidatenproteine. Der zweite Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Kandidatenproteins, dem CP75. Es konnte gezeigt werden, dass CP75 einen echten, centrosomalen Bestandteil darstellt, der mikrotubuli-unabh{\"a}ngig mit der Core Struktur des Zellorganells assoziiert ist. Weiterhin wurde deutlich, dass die Lokalisation am Centrosom in Abh{\"a}ngigkeit vom Zellzyklus erfolgt und CP75 vermutlich mit CP39, einem weiteren centrosomalen Core Protein, interagiert.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{BarbosaPfannes2011,
  author    = {Barbosa Pfannes, Eva Katharina},
  title     = {Probing the regulatory mechanisms of the actomyosin system in motile cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-57812},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2011},
  abstract  = {Actin-based directional motility is important for embryonic development, wound healing, immune responses, and development of tissues. Actin and myosin are essential players in this process that can be subdivided into protrusion, adhesion, and traction. Protrusion is the forward movement of the membrane at the leading edge of the cell. Adhesion is required to enable movement along a substrate, and traction finally leads to the forward movement of the entire cell body, including its organelles. While actin polymerization is the main driving force in cell protrusions, myosin motors lead to the contraction of the cell body. The goal of this work was to study the regulatory mechanisms of the motile machinery by selecting a representative key player for each stage of the signaling process: the regulation of Arp2/3 activity by WASP (actin system), the role of cGMP in myosin II assembly (myosin system), and the influence of phosphoinositide signaling (upstream receptor pathway). The model organism chosen for this work was the social ameba Dictyostelium discoideum, due to the well-established knowledge of its cytoskeletal machinery, the easy handling, and the high motility of its vegetative and starvation developed cells. First, I focused on the dynamics of the actin cytoskeleton by modulating the activity of one of its key players, the Arp2/3 complex. This was achieved using the carbazole derivative Wiskostatin, an inhibitor of the Arp2/3 activator WASP. Cells treated with Wiskostatin adopted a round shape, with no of few pseudopodia. With the help of a microfluidic cell squeezer device, I could show that Wiskostatin treated cells display a reduced mechanical stability, comparable to cells treated with the actin disrupting agent Latrunculin A. Furthermore, the WASP inhibited cells adhere stronger to a surface and show a reduced motility and chemotactic performance. However, the overall F-actin content in the cells was not changed. Confocal microscopy and TIRF microscopy imaging showed that the cells maintained an intact actin cortex. Localized dynamic patches of increased actin polymerization were observed that, however, did not lead to membrane deformation. This indicated that the mechanisms of actin-driven force generation were impaired in Wiskostatin treated cells. It is concluded that in these cells, an altered architecture of the cortical network leads to a reduced overall stiffness of the cell, which is insufficient to support the force generation required for membrane deformation and pseudopod formation. Second, the role of cGMP in myosin II dynamics was investigated. Cyclic GMP is known to regulate the association of myosin II with the cytoskeleton. In Dictyostelium, intracellular cGMP levels increase when cells are exposed to chemoattractants, but also in response to osmotic stress. To study the influence of cyclic GMP on actin and myosin II dynamics, I used the laser-induced photoactivation of a DMACM-caged-Br-cGMP to locally release cGMP inside the cell. My results show that cGMP directly activates the myosin II machinery, but is also able to induce an actin response independently of cAMP receptor activation and signaling. The actin response was observed in both vegetative and developed cells. Possible explanations include cGMP-induced actin polymerization through VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) or through binding of cGMP to cyclic nucleotide-dependent kinases. Finally, I investigated the role of phosphoinositide signaling using the Polyphosphoinositide-Binding Peptide (PBP10) that binds preferentially to PIP2. Phosphoinositides can recruit actin-binding proteins to defined subcellular sites and alter their activity. Neutrophils, as well as developed Dictyostelium cells produce PIP3 in the plasma membrane at their leading edge in response to an external chemotactic gradient. Although not essential for chemotaxis, phosphoinositides are proposed to act as an internal compass in the cell. When treated with the peptide PBP10, cells became round, with fewer or no pseudopods. PH-CRAC translocation to the membrane still occurs, even at low cAMP stimuli, but cell motility (random and directional) was reduced. My data revealed that the decrease in the pool of available PIP2 in the cell is sufficient to impair cell motility, but enough PIP2 remains so that PIP3 is formed in response to chemoattractant stimuli. My data thus highlights how sensitive cell motility and morphology are to changes in the phosphoinositide signaling. In summary, I have analyzed representative regulatory mechanisms that govern key parts of the motile machinery and characterized their impact on cellular properties including mechanical stability, adhesion and chemotaxis.},
  language  = {en}
}