@phdthesis{Danckert2018,
  author    = {Danckert, Lena},
  title     = {Immunscreening Virulenz-adaptierter Expressionsbibliotheken aus einem in vitro Infektionsmodell mit Salmonella Enteritidis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421108},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {144},
  year      = {2018},
  abstract  = {Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere f{\"u}r Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei geh{\"o}ren Salmonella und Campylobacter zu den h{\"a}ufigsten Erregern, die verantwortlich f{\"u}r gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Pr{\"a}vention und Bek{\"a}mpfung von Salmonellen in Gefl{\"u}gelbest{\"a}nden und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen k{\"o}nnen {\"u}ber Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten k{\"o}nnen. Dabei sind bestehende Pr{\"a}ventionsstrategien f{\"u}r Gefl{\"u}gel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen {\"u}bertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Pr{\"a}vention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf f{\"u}r spezifische, sensitive und zuverl{\"a}ssige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gew{\"a}hrleisten. Durch ein wachsendes Verst{\"a}ndnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektions{\"a}hnliches in vitro Modell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r den Erreger durchgef{\"u}hrt. W{\"a}hrend einer Salmonellen-Infektion ist die erste zellul{\"a}re Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) f{\"u}r die Pathogen-Wirt-Studie ausgew{\"a}hlt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Ph{\"a}notyp f{\"u}r die intrazellul{\"a}ren Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Fl{\"u}ssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zus{\"a}tzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adh{\"a}sion und Transmembran-Transport zu gew{\"a}hrleisten. Letzterer ist charakteristisch f{\"u}r die intrazellul{\"a}re Limitierung von N{\"a}hrstoffen und pr{\"a}gt den infektionsrelevanten Status. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Ph{\"a}notyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und m{\"o}glicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellul{\"a}ren Bakterien m{\"u}ssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt f{\"u}r Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen f{\"u}r S. Enteritidis durchgef{\"u}hrt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder erm{\"o}glichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifit{\"a}t oder Membranst{\"a}ndigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektions{\"a}hnlichen Modell durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde deutlich, dass die H{\"a}ufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verf{\"u}gbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu m{\"o}glichen Klonen, die w{\"a}hrend des Microarray-Screenings untersucht werden k{\"o}nnen, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektions{\"a}hnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben. Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant f{\"u}r das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene n{\"a}her untersucht, indem ihr Einfluss im infektions{\"a}hnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-St{\"a}mme analysiert wurde. Dabei wurde f{\"u}r eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der sp{\"a}ten intrazellul{\"a}ren Phase nachgewiesen. Weiterf{\"u}hrende in vitro Analysen sind f{\"u}r die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren. Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell f{\"u}r S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind f{\"u}r diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell l{\"a}sst sich ebenso f{\"u}r andere intrazellul{\"a}re Pathogene {\"u}bertragen und gew{\"a}hrleistet eine zuverl{\"a}ssige Identifizierung von potentiellen Antigenen.},
  language  = {de}
}